経皮針生検によって得られた骨格筋組織から単離されたミトコンドリアの調製と呼吸計測評価

この手順の全体的な目標は、生検された骨格筋組織から分離されたミトコンドリアの呼吸制御を調べることです。これは、最初に経皮的針生検によって少量の筋肉を得ることによって達成されます。2番目のステップは、均質化によって生検された筋肉からミトコンドリアを分離することです。

次に、単離されたミトコンドリアを洗浄し、遠心分離により非ミトコンドリア画分から分離し、サンプルを結合したチーズクロスに通します。最後のステップは、単離されたミトコンドリアをプレート化して、細胞外フラックスアッセイによるレスピロメトリック分析を行い、酸素消費率を視覚化することです。最終的に、タツノオトシゴ細胞外フラックス分析装置は、単離されたミトコンドリアの呼吸制御を調べるために使用されます。

この手法が既存の方法と比較した場合の主な利点は、必要な筋肉組織の量が最小限で20ミリグラムと低く、実験間のばらつきが制限されることです。これらの特徴により、この技術は臨床研究アプリケーションに適しています。この技術の意味は、患者のミトコンドリア機能障害を診断するためのものです。

筋生検とミトコンドリアの分離には、テキストで説明されるだけでなく、視覚的に最もよく示される正確な操作が必要であるため、この方法を視覚的に実証することが重要です。局所的に生検を行うには、筋肉に浸潤しないように注意しながら、1%リドカインを投与します。その後、10分間の待機期間を設けます。

十分な麻痺を可能にするために、挿入と起点の間の筋肉の中央領域から生検を行い、筋膜下領域と筋腱領域を避けます。これを達成するには、最初に経皮的針を使用し、筋膜のポップまたは筋膜の抵抗をガイドとして追跡します。麻酔針で深さを推定し、次に細いメスの刃でそれを感じ、筋膜を通して4〜5ミリメートルの切開を行います。

針が筋肉に挿入されるまで、切開部を通して針を進めます。ウィンドウを異なる方向に向けた状態で複数のサンプルを収集します。60立方センチメートルのシリンジを使用して、筋肉サンプルを経皮針に2〜4回異なる方向に前進および吸引しながら、連続吸引を行います。

吸引を中止し、針を取り外します。アシスタントに穿刺部位に5分間しっかりと圧力をかけてもらいます。止血を確立するには、針を吸引チューブから外し、窓とバレルから筋肉サンプルを慎重に取り出します。

この手順を繰り返して、より多くの筋肉が必要な場合は、2回目のパスを行います。鉗子を使用して、筋肉サンプルから目に見える血栓を取り除きます。次に、サンプルを秤量し、すぐに氷の入ったチューブに入れます。

冷たいECCOsリン酸緩衝生理食塩水またはDPBS。鋭利なハサミとピンセットを使用して、サンプルから目に見える結合組織を取り除きます。徹底的に。氷冷したDPBSバッファーで試料を3〜4回洗浄します。

血液を除去するには、サンプルを氷冷したDPBSに保管し、できるだけ早く処理します。生検から45分以内に、筋肉サンプルから腱や脂肪組織を慎重に取り除くための予防策を講じてください。摂氏マイナス80度で保管するために、余分なティッシュのごく一部を取り除きます。

これは、ウェスタンブロットなどの他の実験にも使用できます。すぐに筋肉組織を細かく刻みます。滅菌済みのハサミを使用して、次いで、組織の1グラム当たり0.2ミリグラムの濃度でCP1緩衝液に溶解したナガルのようなシスティーナタンパク質ACE阻害剤を1ミリリットルに500マイクロリットルで懸濁する。

サンプルが十分に懸濁しているように見えるまで、サンプルをミンチします。その後、室温で5分間インキュベートしてから氷に移し、ホモジナイザーが完全に洗浄されていることを確認します。事前。ナガルで処理したミンチ組織を均質化します。

自動ホモジナイザーを使用。このプロセス全体を通して、サンプルを氷の上に保ちます。各組織サンプルを毎回4回、2秒間のパルスで均質化します。

自動ホモジナイザーを 10, 000 RPM の速度設定で使用して、サンプルを氷上に戻します。プローブを70%エタノールで洗浄し、続いて組織間に蒸留水で洗浄します。次に、均質化された組織を等量のchapel Perry oneまたはCP oneバッファーで洗浄します。

次に、CP 2バッファーの2倍の容量で組織を洗浄します。別の円錐形のチューブで水を同じ体積まで持ってきて、バランスチューブを追加します。内容物を遠心分離管に集め、600 GSで摂氏4度またはチーズクロスを10分前に遠心分離して、すべての粒子が通過し、布に引っかからないようにします。

上清を結婚したチーズクロスに通し、濾液を集めてペレットを捨てることで、非ミトコンドリア画分の大部分を取り除きます。次に、上清を10, 000GSで摂氏4度で10分間超遠心分離します。ペレットを4ミリリットルのCP 2バッファーに懸濁してから、遠心分離後と同じ方法で2回目の遠心分離を行います。

上清を捨て、パテを2ミリリットルのCP 1バッファーに再懸濁します。この時点で、この懸濁液から小さなアリコートを別の試験管に入れて、タンパク質推定に使用します。Resusは、残りのサンプルをCP 1つのバッファーに懸濁し、遠心分離します。

前回と同様に、タンパク質プレートは、以前の遠心分離ステップで標準試料をセットする必要があることに注意してください。最後に、最終ペレットを最小限のミトコンドリアアッセイ溶液または質量に再懸濁します。XFアッセイを実施して、酸素消費率またはOCRを毎分ピコモルの酸素で視覚化するか、酸素とpHの絶対レベルを視覚化します。

データ出力で。1つのX質量中の化合物の10倍濃度をプレートベースの呼吸計のポートAからDに加えて、テキストプロトコルに記載されている最終濃度が得られます。必要なウェル数に対して十分な量の化合物を調製します。

以前に測定したタンパク質計算を使用して、添加するミトコンドリアの濃度を決定します。ミトコンドリアの最適量を決定するには、ウェルあたり1マイクログラム、2.5マイクログラム、5マイクログラムのミトコンドリアを滴定します。ウェル間のばらつきを最小限に抑えるための24ウェルプレートのうち。

まず、10 x ミトコンドリアを冷水で希釈し、1 x 質量と基質を希釈します。次に、この懸濁液を50マイクロリットルを各ウェルに供給します。バックグラウンドの読み取り値として使用するために、わずか50マイクロリットルの質量を含む4つのウェルを残します。

事前に浸したキャリブレーションプレートを、前の上部カートリッジと一緒に呼吸器計に置き、機器のキャリブレーションを実行します。テストプレートの実行の準備として、プレートを2000GSで摂氏4度で20分間遠心分離します。遠心分離後。

1 x 質量の450マイクロリットルを静かに加え、さらにそれぞれに知られているコハク酸と腐ったものを加えます。顕微鏡でミトコンドリアをよく観察し、プレートをXFアナライザーに移す前にウェルへの均一な付着を確認します。順次。呼吸計を使用してリアルタイムでミトコンドリアの呼吸を測定し、それを使用してプログラムします ここに示すテキストプロトコルで提供される呼吸計の設定は、1マイクログラム、2.5マイクログラム、および5マイクログラムのミトコンドリアを使用して複雑な2によって駆動される典型的なレスピロメトリックプロファイルです。

全体として、OCRはミトコンドリアの量が多いほど増加します。このアッセイで計算された呼吸制御比またはRCRは7.95であり、ミトコンドリア調製物が高品質であることを示しています。これは、異なる量のミトコンドリアのプロファイル作成、バリアントの分析、またはInovaが実行され、平方和が計算された場合の結果の一貫性を比較するためです。平方和またはSSは、状態2、状態3、状態3、非結合アンチマイシンA、および状態3の測定値のRCRに対して一方向で表されます。

Innovaは、ANTIMYCINおよびRCRと同様に統計的に有意でした。グループ間で結合されていない状態3では、有意差は見られませんでした。これらの結果は、ウェルあたり5マイクログラムのミトコンドリアが他の濃度と比較して最も低いSSをもたらしたことを示しています。

このプロットは、初期の筋肉サンプルサイズに基づいて期待できるミトコンドリアタンパク質の量を示すガイドとして機能します。予想通り、処理された筋肉の量と最終サンプルの総ミトコンドリアタンパク質含有量との間には強い相関関係があります。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば3時間未満で完了できます。

筋生検に続いて、生検した組織の良好な治癒を確保するために、患者が次の3日間、アスピリンやイブプロフェン、またはその他の市販の非ステロイド薬を服用していないことを確認することが重要です。次に、彼らが次の1日半も激しい活動をしないようにしたいので、不快感を与えるようなことは何もありません。それはバスケットボールのトランポリンティラリーですが、彼らは自分の通常の活動を行うことができます。

また、その領域を24時間乾燥させておくようにお願いしますが、初めてシャワーを浴びるために濡れるときは、洗浄していない皮膚にある可能性のあるあらゆる種類の細菌が切開部に入らないようにします。このビデオを見た後、S外側骨格筋組織を生検する方法、ミトコンドリアを分離する方法、および呼吸制御を測定する方法について理解を深めるはずです。