膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで

この手順の全体的な目的は、構造および機能解析のために、SIA coliで発現した膜タンパク質を同定することです。まず、細菌を回収し、溶解させ、SDS-PAGEで分析することで、GFP蛍光による正しく折りたたまれたGFPタンパク質の可視化を行います。次に、目的の膜タンパク質を発現していると判断されたE. coliの生産規模を拡大し、タンパク質発現の誘導後、細胞から全膜画分を調製します。

最後に、全膜分画を4種類の異なる界面活性剤で可溶化し、可溶化したGFPタンパク質の単分散性をサイズ排除クロマトグラフィーにより解析します。最終的に、タンパク質を蛍光でモニターし、溶出プロファイルをプロットすることで、サンプル中の凝集状態、単分散性、および遊離GFPの状態を評価します。

構造的および機能的研究のための組換え膜タンパク質の調製は、溶解度が低く、界面活性剤で抽出した後に不安定になるため、依然として技術的な課題となっています。これまでの経験から、異なる種のオーソログなどの膜タンパク質の複数のバリアントをスクリーニングすることで、膜タンパク質発現の成功率を向上させることができることが示されています。また、正しいフォールディングを確認するためのレポーターとして、緑色蛍光タンパク質との融合が用いられています。

膜タンパク質およびe coliの発現スクリーニングのためのGFPベースのプロトコルの最初のステップでは、全細胞からの界面活性剤溶解液のインゲル蛍光を用いて、スクリーニングでの発現レベルに基づき、さらなる解析対象となる膜タンパク質構築物を特定します。次に、サイズ排除クロマトグラフィーに結合した蛍光検出を用いて、膜タンパク質と異なる界面活性剤の選択挙動を評価します。これにより、界面活性剤-タンパク質複合体の単分散性に関する情報が得られます。IPTG誘導による細菌発現を解析するには、まず、オーバーナイト培養した24深孔ブロックから、IPTG処理したe coli 1 mLを96深孔ブロックへ重複して移し、ブロックを密封した後、室温で6,000 ×gにて10分間遠心分離して細胞を沈殿させます。

その後、ブロックを反転させて培地をデカンテーションし、ペーパータオルの上に軽く叩いて残った液体を切り出します。プレートを再び密閉し、少なくとも20分後にマイナス80 degrees Celsiusで細胞を保存します。ペレットを室温で20分間解凍し、マルチチャンネルピペットを用いて200 µLのライシスバッファーで細胞を完全に再懸濁します。

細胞に20 µLのDLPI溶液を加え、1000 RPM、4 °Cで10分間振盪しながら処理します。次に、各ウェルに10% DDM溶液を25 µL添加し、さらに60分間振盪しながら細胞をインキュベートします。DDM処理後、ディープウェルブロックを遠心分離し、上清のライセートを10 µL分マイクロタイタープレートに分注して、SDS-PAGEゲル用ロードバッファーを10 µL添加します。

次に、各ウェルに10 µLの溶出バッファー溶液をロードし、コールドルームにて100～120 Vの定電圧で、ダイアフラムが底部に達するまで2～2.5時間電泳を行います。その後、ゲルの融合タンパク質を検出し細胞培養をスケールアップさせるため、青色光フィルターを備えたイメージャーにゲルを設置します。コンピテントセル化したE. coliにEloquaを形質転換した後、コロニーをピックアップして10 mLのpower brothに加え、37 °Cで一晩培養します。

翌朝、一晩培養した菌液 5 mL を 500 mL のパワーブロスで希釈し、250 RPM、37 °C で振盪培養を継続します。595 nm における OD が約 0.5 に達したら、最終濃度 1 mM となるように IPTG を添加して発現を誘導し、その後、今度は 20 °C で一晩振盪培養します。翌朝、遠心分離により細胞を回収し、ペレットを -80 °C で保存します。

細胞膜を調製します。室温の3番目のペレットを、細胞ペレット1gあたり5mLのPBSで再懸濁し、粘度が低下して流動的になるまで必要に応じて液量を増やします。次に、塩化マグネシウムを最終濃度1mM、DNAを最終濃度10µg/mLになるように加え、さらに細胞ペレット20gあたり1錠の市販のプロテアーゼ阻害剤タブレットを添加します。

次に、冷却した細胞破砕機を用い、30 KPSIの圧力で細胞を破砕し、その後、未破砕の細胞とデブリを30,000 ×g、4 °Cで15分間遠心分離してペレット化します。上清を超遠心管に移し、上清を200,000 ×g、4 °Cで1時間遠心分離して、全膜画分を回収します。その後、細胞ホモジナイザーを用いて膜ペレットを10 mLの氷冷PBSに再懸濁し、使用する各界面活性剤で膜を可溶化させます。

膜懸濁液900 µLを1.5 mLポリセントリフュージチューブに分注します。次に、調製直後の各界面活性剤100 µLを対応する1.5 mLチューブに加え、4 °Cで緩やかに撹拌しながらインキュベートします。1時間後、ベンチトップ超遠心機を用いて界面活性剤および可溶化画分をペレット化します。その際、チューブが少なくとも半分まで満たされていることを確認し、蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィー（FEC分析）用に上清を回収して保持します。

次に、分画範囲の広いEquatorサイズ排除カラムを用い、流速0.3 mL/minで平衡化バッファーを流します。続いて、可溶化させた膜サンプル100 µLを同流速でカラムに注入し、蛍光光学系を用いて溶出プロファイルをモニターします。最後に、溶出量と蛍光強度のデータをスプレッドシートプログラムにインポートしてグラフ表示し、残存する可溶化膜物質をインゲル蛍光法で分析します。

前述の通り、当該タンパク質ファミリーは細菌の細胞分裂に不可欠です。これらの画像には、当該構築物のうち24/47個について、代表的なゲル内蛍光可視化の結果を示しています。バンドの強度は、発現レベルの指標となります。

例えば、レーン4の融合タンパク質は、両方の株で良好に発現しています。しかし、低分子側のバンドが追加で認められることは、多くのレーンにおいてタンパク質が部分的に分解していることを示唆しています。また、GFP単体と同等のサイズに相当するバンドも確認されます。

例えば、C41(DE3) pLysS株では、G4およびH4は完全に分解されて遊離GFPになります。一方、LEMO 21(DE3)では、これらのグラフにおいて一部のタンパク質が完全な状態で存在しています。一次スクリーニングで良好な結果を示した2つのコンストラクトを蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィーで解析すると、試験した4種類の界面活性剤のいずれを用いるかによって、タンパク質の挙動が異なることがわかります。

例えば、このタンパク質はDool Multisideにおいて、わずかな凝集を伴う対称的なピークのみを示し、その結果、以降の精製において最適の界面活性剤として選択されました。対照的に、もう一方の融合タンパク質は、テストしたすべての界面活性剤で同様のプロファイルを示しました。このプロトコルは、例えば、異なる発現条件下で培養した異なるE. coli株の導入や、一次および二次スクリーニングにおける追加の界面活性剤の検討など、容易に拡張することが可能です。

要約すると、本プロトコルの主な目的は、多数の膜タンパク質の発現および可溶化についてスクリーニングを行い、詳細な解析に向けた候補を特定することです。