Name: 膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングでエシェリヒア·コリ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-06T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 学ぶ膜タンパク質のGFP融合発現スクリーニング法。Escherichia coliを用いてインゲル蛍光とFSECで発現レベル・モノ分散性を評価し、構造・機能解析に適した候補を同定する効率的なプロトコルです。

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OPPF-UKは、英国医学研究評議会(助成金MR/K018779/1)とMembrane Protein Laboratory(助成金099165/Z/12/Z)によって資金提供されています。

発現ベクターの1の構築<ol><li>使用するPCR輸液配列13それぞれに切断可能なC末端またはN末端 ​​のHis6-GFP融合物のいずれかを追加するベクターpOPINE-3C-GFPとPOPIN-N-GFPを用いて、並列に96発現プラスミドまで構築するためにクローニング。 注：GFPは細胞質ゾル中で発現する必要があるので、ベクターの選択は、タンパク質のトポロジーによって決定され、したがって、細胞質N末端 ​​および細胞外C末端を有するタンパク質を我々はPOPIN-N-GFPとのために使用し細胞外のN末端および細胞質C末端は、年にはpOPINE-3C-GFPを使用します。両方の末端が細胞質ゾルであるがC末端にタグ付けしない機能的な理由がない限り、我々はpOPINE-3C-GFPを使用します。 </li><li>示され、以下の拡張機能を組み込んだプライマーを用いて膜タンパク質をコードするDNA配列を増幅する。 pOPINE-3C-GFP（フォワードプライマー - AGGAGATATACCATG、プライマーリバース - CAGAACTTCCAGTTT）とPOPIN-N-GFP（フォワードプライマー - AAGTTCTGTTTCAGGGCCCG、プライマーリバース - ATGGTCTAGAAAGCTTTA）。 </li><li>アガロースゲル電気泳動によるPCR反応を分析します。一度きれいなPCR産物が得られている、（1×をDpnI反応緩衝液5μlで構成する）を各ウェルに5 UのDpnIを追加します。 96ウェル形式で、磁気ビーズを使用してPCR産物を精製する。 注：DpnIをテンプレートベクトルを除去するために添加される。ゲノムDNAを鋳型として使用される場合は、このステップは不要である。 </li><li> PCRプレートの各ウェルに、適切な線状化ベクターを1μl（100ngの）を追加します。 </li><li>マルチチャンネルピペッターを使用して、精製したPCRのμlの追加x PCRプレートの適切なウェルに挿入します。すべての製品が10〜250 ngの範囲内にあることを確認してください。 </li><li>ウェルに水の（9-X）μLを加え、ドライダウンで融合試薬を含むチューブに全体の10μLを転送する。 30秒間のままにしておきます。 </li><li>ピペッティングにより簡単に内容物を混合。転送元のPCRプレートシールに対する反応。 </li><li>サーモサイクラー中で42℃で30分間インキュベートする。 </li><li>とすぐ反応が完了すると、氷に反応を転送し、40μlのTE（10mMトリス、pH8.0,1mMのEDTA）を添加する。 </li><li>一度にフリーズしたり、テント細胞に形質転換する。形質転換のために、高い能力の50μlのアリコート当たり希釈した反応の3μL（&gt; 5×10 9の形質転換体/μgの）テントE.を使用coli細胞 。 </li><li> （クローニングのために、構築物2 x個、ウェルを調製）を、24​​ウェル組織培養プレートのウェルを50μg/ mlのカルベニシリン当たり添加したLB寒天培地を1ml加える。 </li><li>成長板の後、成長を次のうち25μlを、24ウェル組織培養プレートを含む寒天上に培養の1~5倍希釈液25μl。 </li><li>優しくプレートを傾けることによって、細胞を広げた。 </li><li> 37℃でのまたはフロで10-15分間、蓋をオフにして、プレートを乾燥させる室温でWフード。 </li><li>蓋を交換し、逆さまにプレートを回し、37℃で一晩インキュベートする。 </li><li> 2コロニーとミニプレップのベクトルを選択してください。 </li><li> PCRは、構造物の特定のリバースプライマーとベクター特異的フォワードプライマー（ 例えば pOPIN_FOR GAC CGA AAT TAA TAC GAC TCA CTAタグのGG）を使用して、構文を確認してください。 </li></ol> E. 2.変容大腸菌のE XPRESSION株 注：前にこのプロトコルを実行するには、E。大腸菌コンピテント細胞を作製等分し、以前に記載13のように-80℃で凍結保存される。膜タンパク質の発現は、日常的に二つの株、Lemo21（DE3）およびC41（DE3）pLysS中でスクリーニングされる。結果の解釈を支援するためには、陽性対照、 例えば 、GFPを発現するプラスミドまたは発現することが知られているGFPに融合した膜タンパク質と空のベクターネガティブコントロールを含むように役立ちます。 <ol><li>アリを解凍quotted E.氷の上で大腸菌 。コンピテント細胞の各アリコートにミニプレップ発現プラスミドの3を添加する。 </li><li> 30分間氷上でミックスをインキュベートします。 </li><li> 42℃で30秒間の細胞を熱ショック。 </li><li>細胞は2分間氷上で回復した後、各チューブに電力ブロス300μlのを追加することができます。 </li><li> 37℃の静的なインキュベーター中で1時間インキュベートする。 </li><li> 50μg/ mlのカルベニシリンおよび35μgの/ mlのクロラムフェニコールを補充した、24ウェル組織培養プレートにLB寒天を準備する。 Lemo21（DE3）を含むウェルに0.25 mMの最終濃度にラムノースを追加します。 注：製品はC41（DE3）pLysS株を含有するウェルを1％（w / v）のグルコースを補充することができる毒性である可能性がある場合。 </li><li> LB寒天プレート上に形質転換混合物からの細胞の30μlのを転送します。 1.13から1.15に記載されているようにプレートを広げ、乾燥させます。 </li></ol>一晩スターター培養物の調製注：常に古い形質転換プレートから変換後に一日一晩培養を決して準備していない。 <ol><li> 50μg/ mlのカルベニシリンおよび35μgの/ mlのクロラムフェニコールを補充した96ウェルディープウェルプレートの各ウェルに0.7ミリリットル電力ブロスを加える。 0.25mmの最終濃度にLemo21（DE3）を含むウェルにラムノースを追加します。必要に応じて、1％（w / v）のグルコースC41（DE3）pLysS株を補完する。上記（2.6注）を参照してください。 </li><li>各ウェルに一晩形質転換プレートから1コロニーを採取。ガス透過性のシールでブロックをシール。 </li><li> 37℃で一晩小投（ 例えば 4.3ミリメートル軌道）で大投（ 例えば 25ミリメートル軌道）で、またはインキュベーターで600rpmでインキュベーター中で250rpmでブロックを振る。 </li></ol> 4.成長と文化の誘導<ol><li>電力ブロス3mlを各50μg/ mlのカルベニシリンおよび35μgの/ mlのクロラムフェニコールワットを補充追加24ウェルディープウェルプレートのエル。セクション3.1で説明したようにL-ラムノース（およびグルコース）を追加します。重複して収穫を可能にするために培養物を3mlを使用して、ガス透過性シールを通る水の一部の蒸発を可能にする。 </li><li> 24ウェルディープウェルブロックの各ウェルにLemo21（DE3）またはC41（DE3）pLysSを一晩培養の150μlのを追加することによって、発現培養を設定します。 </li><li> 595nmの平均ODがプレートを通して〜0.5になるまで37℃でブロックを振る。 </li><li> 1.0mMのIPTGの最終濃度まで培養物にIPTGを添加することにより発現を誘導する。 </li><li> 20℃で振とうしながら一晩培養物（18〜20時間）成長。 </li></ol>ゲル内蛍光によって発現の5.分析<ol><li>重複して収穫。平方よく、円錐底、96ウェルディープウェルブロックに、各ウェルからの培養の譲渡1ミリリットル。 注：収穫ブロックの破損の場合は、二重にまたはalternatiのテストを可能にする必要に応じて洗剤VEの。 </li><li>ブロックを密封し、10分間6000×gでの遠心分離によって細胞を回収。 </li><li>ブロックを反転し、メディアをデカント。残りのメディアを排出するためにペーパータオルの上に静かにブロックをタップします。 </li><li> 20分の最低-80℃でプレートや店舗を密封。必要に応じて、この時点での実験で便利な処理されたブロックを残す。 </li><li>室温で20分間ペレット化し、デフロスト。 </li><li>溶解緩衝液（50mMのNaH 2 PO 4、300mMのNaCl、10mMのイミダゾール、1％vの200μlの完全に細胞を再懸濁し、4℃で、マルチチャンネルピ ​​ペットまたはオービタルシェーカー（10分間、1000rpmで）のいずれかを使用/ vのトゥイーン20、NaOHを用いてpHを8.0に調整する）。 </li><li> DLPI溶液20μl（20μlのDNアーゼI（4000単位/ ml）、20mgのリゾチーム、および水2mlの最終容量20μlのプロテ​​アーゼ阻害剤カクテル）を加える。 4℃で（〜1000回転）しながら10分間インキュベートする。 </li><li&gt; 25の10％ずつのn -ドデシルβ-D-マルトシド（DDM）を追加します。 </li><li> 4℃で（〜1000回転）しながら60分間インキュベートする。 </li><li>遠心機で4℃で30分間6000×gでディープウェルブロック。 </li><li>マイクロタイタープレートへの転送をクリア溶解液を10μlおよびSDS PAGEゲルローディングバッファー（100 mMトリス、pH6.8の10μlの、W / SDS V 4％、0.2％W / Vブロモフェノールブルー、10パーセント（v / v）のβを追加メルカプトエタノール、および20％（v / v）のグリセロール）。 注意！ SAMPLEを沸騰しないでください 。 </li><li>負荷ステップ5.11からサンプルを10μl/ウェルのSDS PAGEゲル（S）上に、色素フロントが下（2〜2.5時間）に達するまで寒い部屋の中で100〜120 V（定電圧）で動作します。 </li><li> （GFP融合タンパク質を検出するために、青色フィルタを例 ）イメージャ上にゲルを配置する。露光時間は、明るいバンドが飽和されないように選択される。 </li></ol>細胞培養の6スケールアップ<ol><li>有能なのアリコートを変換する<em&gt; E。セクション2に記載された大腸菌のように。 </li><li> （セクション3で説明したように補足した）電力ブロスの10ミリリットルにコロニーを採取し、37℃で一晩成長する。 </li><li> 500ミリリットルパワーブロス中に一晩培養の5ミリリットルを希釈する。 </li><li> 595nmのODが〜0.5になるまで37℃で、250rpmで振とうしながら成長する。 </li><li> 1.0 mMの最終濃度までIPTGを添加することにより発現を誘導する。 </li><li> 20℃で、250rpmで振とうしながら一晩増殖。 </li><li> 15分間5000×gでの遠心分離により細胞を回収。 </li><li>上清を捨てる。細胞ペレットを-80℃で保存することができる。 </li></ol>膜の7。準備<ol><li>細胞ペレットのグラム当たり5ミリリットルの容量で1×PBS pH7.5中、室温で解凍し、再懸濁細胞（必要な場合）。粘度が鼻水一貫性に減少するまで、必要に応じて音量を上げます。 10μg/ mlの一つの最終濃度が1 mMの、DNアーゼIの最終濃度までのMgCl 2を追加細胞ペレットを20g当たりプロテアーゼ阻害剤錠剤をあらかじめパッケージ。 30 KPSIの圧力で冷やした細胞破壊を使用して開いた細胞を破壊。 </li><li> 4℃で15分間、30,000 gで破壊されていない細胞と破片をペレット化。超遠心チューブに上清を移し。 </li><li> 4℃で1時間20万×gで超遠心上清をスピンダウンすることにより、総膜画分を収集する。 </li><li>上清を捨てる。 </li><li>細胞ホモジナイザーを用いて氷冷した10mlのPBS pH7.5中膜ペレットを再懸濁する。 1mlの再懸濁させた膜を、各洗浄剤のために必要とされる。必要に応じて、この段階では、フラッシュは-80℃で液体窒素とストア内の膜懸濁液を凍結する。 </li></ol>膜画分の8溶化および分析<ol><li>解凍膜画分（必要な場合）、各洗浄剤のための可溶化のために使用される、1.5ミリリットル中に膜懸濁液のアリコートを、900μlのポリアロマーマイクロcentrifuGEチューブ。 </li><li>指定された1.5ミリリットルチューブに1％の最終濃度にそれぞれ新たに調製された洗剤を100μl（10重量％/ DDM、DMのVソリューション、Cymal-6およびLDAO）を追加します。真核生物の膜タンパク質のコレステロールヘミスクシネート（0.2％最終濃度）の可溶化のための界面活性剤に添加することができる。 </li><li>穏やかに撹拌しながら1時間4℃での混合物をインキュベートする。 </li><li> 45分間、4℃で15万グラムで、確実にチューブが少なくとも半分フルである、ベンチトップの超遠心機と洗剤不溶性画分をペレットおよび上清を保持します。 注：界面活性剤可溶化の効果は、同じ容量のPBS中に再懸濁させ、界面活性剤不溶性画分と可溶化した膜のGFP蛍光を測定することにより、蛍光プレートリーダーを用いて推定することができる。 </li><li>蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィーを用いて膜タンパク質複合体（FSEC）：異なる界面活性剤の単分散性を分析する。 </li><li> FSEC分析のために、広い画範囲を有するサイズ排除カラムを平衡化し、分子量5,000,000 例えば 5000、0.3ml /分の流速で緩衝液（20mMトリスpH7.5で、150mMのNaCl、0.03％DDM）を実行すると。それは試験した各洗剤のために変更されない。すなわち、すべてのサンプルについてこのバッファを使用します。 </li><li> /分0.3ミリリットルの流量でカラムに可溶化された膜を100μl注入する。蛍光光学系（488 nmでの励起および発光512 nmで）を使用した溶出プロファイルを監視します。インライン蛍光モニターを使用できない場合は、画分を回収し、プレートリーダーで蛍光を読み取る。 </li><li>グラフィック表示のための表計算プログラムにインポート溶出量と蛍光強度データ。 </li><li>項5に記載のようにゲル内蛍光によって残りの可溶化された膜材料を分析する。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

この資料に記載されたプロトコルでは、GFPレポーターベクターにライゲーション非依存性クローニングが急速E.で複数の膜タンパク質の相対発現をスクリーニングする蛍光検出と組み合わされ大腸菌 。ベクターは、第一の発現スクリーニングは、さらに週取ると4営業日で行うことができます。全細胞の洗浄剤溶解物のゲル内蛍光は、二次スクリーニングにおいて、さらなる分析のための発現ヒットをランク付けするために使用される。提示される一次式スクリーンが離れてディープウェルブロックで細胞を成長させるのに適しシェーカーインキュベーターからの専門家装置を必要としない。 96ウェルSBSプレートを含む他の全ての液体の取り扱いは、マルチチャンネルピペットを用いて行うことができる。プロトコルは容易に異なる発現条件（ 例えばより低い温度）の下で成長させ、他の大腸菌株を含むように修飾することができる。ラムノースのレベルを滴定LEMO21（DE3）の場合には（0から2.0 mMまで）いくつかの膜タンパク質7の発現レベルを増加させることができる転写速度を調節するために添加した。過酷な洗剤は、封入体からタンパク質を可溶化し、従って偽陽性を与えるかもしれないがDDM以外の界面活性剤は、一次スクリーニングで抽出のために使用することができる。明らかに、より多くの初期画面になる手の込んだ、より多くの時間のかかる実験を。 二次スクリーニングは、一次スクリーニングで同定された表現のヒットから全膜画分を調製することを含む。これは、Eの膜への融合タンパク質の局在を確認するように重要なステップであるcoli細胞 。異なる洗剤中のGFP融合タンパク質のその後の抽出は、界面活性剤 - タンパク質複合体の単分散性を評価するために、可溶化物質の蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィーによって監視される。それが最も適切な洗剤を識別するので、これはもう一つの重要なステップである後続の下流の処理のための膜タンパク質の可溶化。しかしながら、経験は、界面活性剤（単数または複数）の選択のさらなる最適化がまだ精製および結晶化の間に必要とされ得ることを示している。比較的小さなミセルのサイズ（ 例えば LDAO）を持つものを含む、様々な界面活性剤が均一動作の証拠は、原核生物の膜タンパク質14、少なくともよく回折する結晶を形成する傾向の良好な指標であると思われる。この点において、 図2Bの膜タンパク質について示されたプロファイルは非常に良好な表示。 GFPレポーターを使用することの主な利点は、未精製の試料における発現の迅速な読み出しを与えることである。欠点は、GFP融合タンパク質は、結晶化のためのタンパク質の精製中に除去しなければならないことである。ここで使用されるベクターの場合には、ライノウイルス3Cプロテアーゼ部位はGFPの切断を可能にする。あるいは、それは簡単である唯一のその後の精製のためにポリヒスチジンまたは他の親和性タグを追加するベクターへのスクリーニングで同定された再クローン候補タンパク質は、である。これは、GFPの融合が発現に必要ではないことを前提としています。膜タンパク質の発現および可溶化を検出するためのGFPへの融合を使用する主な代替案は、ヒスチジンタグを付加することである。しかし、このアプローチは、典型的には、多くの変形を評価するために非常に時間がかかるとなる膜画分15で始まる必要とする。 要約すると、この資料に記載されたプロトコルの主な目的は、膜タンパク質配列の多数の急速な発現および界面活性剤可溶化の点で評価され、より深い分析のために優先される変異を可能にすることである。

これは、膜タンパク質は、ヒトゲノム2を含むすべての配列決定されたゲノム1で符号化された遺伝子の約20~30％を占めると推定されている。多くの生物学的プロセスにおけるその重要な役割を考慮すると、代謝産物、エネルギー生成および薬物標的としての、例えば輸送のために、それらの三次元構造の決定に強い関心がある。しかし、可溶性タンパク質と比較して、膜タンパク質は、タンパク質データバンクで表さアンダー高度である。実際には、PDB（で99624リリース構造から<a href="http://www.rcsb.org/pdb/">http://www.rcsb.org/pdb/</a> ）のみ471（ <a href="http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/">http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/</a> ）膜タンパク質に分類される。これは、自然に、比較的低レベルで発現される膜タンパク質での作業の技術的な問題を反映しロドプシンは、いくつかの例外を除き3,4の一つです。組換えバージョンの過剰発現異種細胞中のSは、多くの場合、生産の全体的なレベルを制限し、膜にミスフォールディングと貧しいターゲティングになる。一旦発現膜タンパク質の抽出および可溶化のための最高の洗剤を選択すると、その後の精製が困難になると慎重な最適化を必要とする。 大腸菌は、72％（占め膜タンパク質のための最も一般的に使用される発現宿主まま<a href="http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/">http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/</a>細菌源からほぼ排他的であり、今日まで解 ​​析された構造の）。具体的なE.大腸菌株C41（DE3）およびC43（DE3）は、膜タンパク質の過剰発現をもたらし、したがって、他のBL21のために観察された毒性は5,6株の影響を回避しない単離されている。組換え膜タンパク質の発現のレベルを調整すると、生産6,7のレベルを最適化するために重要であると思われる。 6-8を利用するためにアミノ末端およびカルボキシ末端欠失、複数のオーソログを含む、複数のバージョンの評価を必要としてきた。したがって、並列に複数の膜タンパク質の発現をスクリーニングするための方法が不可欠である。 1つの一般的に使用されるアプローチは、タンパク質を精製することなく、追跡される緑色蛍光タンパク質（GFP）の発現を可能にするタンパク質を融合することである。このように、異なる洗剤中の発現レベル、安定性、および動作に関する情報は、未精製物質9-12少量で評価することができる。 この記事では、Eにおける膜タンパク質のクローニングおよび発現スクリーニングのための合理化されたプロトコルを記述洗剤の生産とその後の特性化のレポーターとしてGFPとの融合を使用して大腸菌 ：タンパク質COMPlexes（ 図1）。

<table><tbody><tr><td>pOPIN-N-GFP</td><td>addgene (www.addgene.org)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pOPINE-3C-GFP</td><td>addgene (www.addgene.org)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C41(DE3)pLysS</td><td>Lucigen (http://lucigen.com/)</td><td>60444-1</td><td></td></tr><tr><td>LEMO21(DE3)</td><td>New England Biolabs</td><td>C2528H</td><td></td></tr><tr><td>In-Fusion HD EcoDry Cloning System, 96 Rxns</td><td>Clontech/Takara</td><td>639688</td><td></td></tr><tr><td>パワーブロス</td><td>分子寸法 (http://www.moleculardimensions.com/)</td><td>MD12-106-1</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤錠剤</td><td>ロシュ</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete、ミニ、EDTAフリー;プロテアーゼ阻害剤カクテル&nbsp;</td><td>ロシュ</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>L-ラムノース一水和物</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>83650</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8849</td><td></td></tr><tr><td>DNAse 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>リゾチーム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7651</td><td></td></tr><tr><td>コレステロール ヘミスコハク酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6512</td><td></td></tr><tr><td>CYMAL-6 (6-Cyclohexyl-1-Hexyl-&β;-D-Maltoside)</td> <td>Anatrace</td><td>C326</td><td></td></tr><tr><td>DDM (n-Dodecyl &beta;-maltoside)</td><td>ジェネロン</td><td>D97002</td><td></td></tr><tr><td>DM (n-デシル &β;-マルトシド)</td><td>ジェネロン</td><td>D99003</td><td></td></tr><tr><td>LDAO (N,N-ジメチル-n-ドデシルアミン N-オキシド)</td><td>ジェネロン</td><td>D71111</td><td></td></tr><tr><td>E1 ClipTip Eq384 8&nbsp;チャンネル1-30&マイクロ;l</td><td>サーモサイエンティフィック&nbsp;</td><td></td><td></td>4672030</tr><tr><td>レイニンピペット Pipet-Lite XLS 6ch 100-1,200 &micro;l LTS スペーサー</td><td>Anachem</td><td>LA6-300XLS</td><td></td></tr><tr><td>レイニンピペットライト XLS+ 8ch 2-20 &micro;l LTS</td><td>Anachem</td><td>L8-20XLSPLUS</td><td></td></tr><tr><td>ピペット Pipet-Lite XLS 8ch 100-1,200 &micro;l LTS Tip</td><td>Anachem</td><td>L8-1200XLS</td><td></td></tr><tr><td>24 well V bottom deep well blocks</td><td>Porvair sciences 360115</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BenchMark Fluorescent Protein Standard</td><td>Life Technologies</td><td>LC5928</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi Protein Gels, 26 well</td><td>Life Technologies</td><td>WG1203BOX</td><td></td></tr><tr><td>XCell4 SureLock Midi-Cell</td><td>Life Technologies</td><td>WR0100</td><td></td></tr><tr><td>Vibramax 100</td><td>Heidolph</td><td>544-21200-00</td><td></td></tr><tr><td>テンションローラーアタッチメント</td><td>Heidolph</td><td>549-81000-00</td><td></td></tr><tr><td>ptima L-100 45-Tiローターを実行する超遠心分離機</td><td>Beckman Coulter</td><td>393253</td><td></td></tr><tr><td>TLA-55ローターを実行するOptima Max-XP超遠心分離機</td><td>Beckman Coulter</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>JA-17を実行するAvanti J-26S XPIおよびJS-5.3ローター&nbsp;</td><td>ベックマン・コールター</td><td>B14535</td><td></td></tr><tr><td>プロミネンスUFLC RF-20A蛍光検出器付き</td><td>島津</td><td></td><td></td></tr><tr><td>セファロース 6 10/300 GL サイズ排除列</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>SSI5R-HS SHEL LAB フロアモデル振とうインキュベーター、5 Cu.Ft.(144&nbsp;L)、30-850 rpm</td><td>シェルラボ&nbsp;</td><td>SSI5R-HS</td><td></td></tr><tr><td>Innova44R インキュベーター</td><td>ニューブランズウィック /Eppendorf</td><td>Innova44R</td><td></td></tr><tr><td>TS シリーズ 0.75 kW ディスラプター 230 V 50 Hz 1&nbsp;PH (40 kpsi)</td><td>L</td><td></td>-ラムノース一水和物 Sigma 83650 PL083016<td></td>定システム</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

構造的および機能的研究のための組換え膜タンパク質の生産が低レベルの発現一度洗浄剤中で可溶化し、多くの膜タンパク質の固有の不安定性のために技術的に困難なままである。プロトコルは、GFP蛍光によって検出された大腸菌で発現GFP融合体などの膜タンパク質のライゲーション非依存性クローニングを組み合わせることが記載されている。これは、時間と労力のさらなる投資に適した候補を同定するために、複数の膜タンパク質/バリアントの構築および発現のスクリーニングを可能にする。 GFPレポーターは、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）は、次のGFP蛍光を可視化することにより式の一次スクリーニングに使用される。自由GFPの不在によって示されるように、最小の劣化で高い発現レベルの両方を示す膜タンパク質は、二次スクリーニングのために選択される。これらの構築物は、スケーリングされ、総膜画分を調製し、可溶化されている4異なる界面活性剤の研究開発。界面活性剤不溶性の物質を除去するために超遠心分離に続いて、溶解物を、蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィー（FSEC）によって分析される。 GFP蛍光によってサイズ排除プロフィールを監視することは別の洗剤中の膜タンパク質の単分散性と完全性についての情報を提供します。タンパク質：ほとんど、あるいはまったく自由GFPと最小集約対称のピークで溶出洗剤の組み合わせは、その後の精製のための候補である。上記の方法論を用いて、E。で異種発現SED（形状、伸長、除算、および胞子）菌の47の異なる種からのタンパク質の大腸菌を分析した。これらのタンパク質は、典型的には10の膜貫通ドメインを有し、細胞分裂に必須である。結果は、EにSEDのオルソログの生産大腸菌は、発現レベルおよびGFP融合タンパク質の完全性に関して非常に可変であった。実験Iさらなる調査のためのサブセットをdentified。

タンパク質のSEDSファミリー（形状、伸び、部門、および胞子形成）は、細菌の細胞分裂に不可欠である。これらの一体型のタンパク質は通常、細胞内のアミノ末端およびカルボキシ末端の両方を持つ10の膜貫通領域を持っている。上述のプロトコールを例示するために、47 SEDのオルソログは、ベクターpOPINE-3C-eGFPの中にクローニングした。構築物の小規模発現画面は2つのE .coli株で実施した、0.25ミリモルの存在下で増殖させLemo21（DE3）は、日常的に、膜の発現のために使用されるリーキーな発現およびC41（DE3）pLysS株を、ブロックするラムノースタンパク質5-8。 誘導培養の洗剤可溶化した溶解物をSDSポリアクリルアミド電気泳動により分析した。ゲル内蛍光を使用することで発現GFP融合タンパク質は、47 SEDの構築物のうちの2株の間38が生成されることが示された可視化する。興味深いことに2発現株との間に差はなかった。 38構築物を発現し、わずか18は14だけLemo21（DE3）および6のみC41で（DE3）pLysS中で発現し、両系統を作製した。の全体的に、C41（DE3）pLysS株（24対38）に比べLemo21（DE3）のためのより高い成功率があった。しかし、いくつかのタンパク質は、株特異的であるように思われた観察は、両方のスクリーニングで有用であることを意味する。 47のSEDの24のための代表的なデータは、構築物は、図1に示されている。バンドの強度は、しかし、両方の株でよく、追加の表現、例えば 、図1A及び図1BのウェルC4における融合タンパク質の発現のレベルの指標を与える低分子量のバンドは、タンパク質が部分的に分解されることを示唆している。多くのレーンにGFP単独のサイズに対応するバンドが存在する。タンパク質の完全性の定性的評価は、自由GFPの融合タンパク質の相対的強度を調べることによって行うことができる。Lemo21（DE3）にいくつかの完全なタンパク質（ 図1A）があるのに対し、 例えば G4およびH4は完全にC41でのフリーGFP（DE3）pLysSを（ 図1B）に分解される。 38発現されたタンパク質のうち14の空きGFPバンドの強度は、（遊離GFPバンドの強度は、融合タンパク質および融合タンパク質の少数のそれよりも大きい21のために、3融合タンパク質と同様である/ 38は、 図1Aに） 例えば F6及びG6を発現した融合タンパク質と比較して比較的少ない自由GFPを有する。 一次スクリーニングのB5（遊離GFP融合タンパク質のための高強度バンド）及びG6（少し自由GFP）で十分に発現構築物のうちの2つが発現し、総膜画分を500mlの細胞培養物から調製した。再懸濁した膜は、アリコートに分割し、蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィー（FSEC）により分析した。 FSECプロファイルはFIGURに提示されているE 2Aおよび2Bそれぞれと2 SEDのタンパク質が試験した4つの洗剤に異なる挙動を示すことを示している。 1ケース（ 図2A：サンプルB5）において、タンパク質は、したがって、その後の精製の ​​ための選択の洗剤だろうDDMに少し凝集対称ピークを与えた。対照的に、他の融合タンパク質（ 図2B：サンプルG6）は、試験した全ての界面活性剤で同様のプロフィールを示した。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52357/52357fig1highres.jpg" width="700px" /> 図1：E.、膜タンパク質の発現をスクリーニングするためのワークフローの図GFPレポーターを使用して大腸菌 。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52357/52357fig2highres.jpg" /> 図2：ゲル内蛍光を用いた膜タンパク質の発現の主画面。 </strongEの&gt;洗剤溶解物大腸菌細胞はブルー落射照明と28分の530フィルターを使用して画像化SDS-PAGEおよびゲルで分析した。結果は、（96ウェルプレート内の位置に基づいて、A4-H6ラベル）24の構築物について示されている。自由GFPおよびGFP融合タンパク質のためのバンドの位置が示されている。Lemo21（DE3）（B）C41（DE3）pLysS中で発現されたタンパク質で発現（A）タンパク質である。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52357/52357fig3highres.jpg" /> 図3：膜タンパク質の発現の二次スクリーン蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィー（FSEC）を使用して、合計の膜画分は、4つの異なる界面活性剤で抽出し、可溶化した膜タンパク質は、蛍光検出器に結合されたFPLCシステムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。 （A）膜タンパク質B5および（B）はFSECプロファイル</s·チョン&gt;膜タンパク質G6。凝集したタンパク質、可溶化されたGFP融合タンパク質および遊離GFPに対応するピークの位置が示されている。テスト洗剤は、プロファイルの下に示されている。

緑色蛍光タンパク質の融合に基づく大腸菌における組換え膜タンパク質の発現についてスクリーニングする効率的なアプローチが提示される。

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

この手順の全体的な目的は、構造および機能解析のために、SIA coliで発現した膜タンパク質を同定することです。まず、細菌を回収し、溶解させ、SDS-PAGEで分析することで、GFP蛍光による正しく折りたたまれたGFPタンパク質の可視化を行います。次に、目的の膜タンパク質を発現していると判断されたE. coliの生産規模を拡大し、タンパク質発現の誘導後、細胞から全膜画分を調製します。最後に、全膜分画を4種類の異なる界面活性剤で可溶化し、可溶化したGFPタンパク質の単分散性をサイズ排除クロマトグラフィーにより解析します。最終的に、タンパク質を蛍光でモニターし、溶出プロファイルをプロットすることで、サンプル中の凝集状態、単分散性、および遊離GFPの状態を評価します。構造的および機能的研究のための組換え膜タンパク質の調製は、溶解度が低く、界面活性剤で抽出した後に不安定になるため、依然として技術的な課題となっています。これまでの経験から、異なる種のオーソログなどの膜タンパク質の複数のバリアントをスクリーニングすることで、膜タンパク質発現の成功率を向上させることができることが示されています。また、正しいフォールディングを確認するためのレポーターとして、緑色蛍光タンパク質との融合が用いられています。膜タンパク質およびe coliの発現スクリーニングのためのGFPベースのプロトコルの最初のステップでは、全細胞からの界面活性剤溶解液のインゲル蛍光を用いて、スクリーニングでの発現レベルに基づき、さらなる解析対象となる膜タンパク質構築物を特定します。次に、サイズ排除クロマトグラフィーに結合した蛍光検出を用いて、膜タンパク質と異なる界面活性剤の選択挙動を評価します。これにより、界面活性剤-タンパク質複合体の単分散性に関する情報が得られます。IPTG誘導による細菌発現を解析するには、まず、オーバーナイト培養した24深孔ブロックから、IPTG処理したe coli 1 mLを96深孔ブロックへ重複して移し、ブロックを密封した後、室温で6,000 ×gにて10分間遠心分離して細胞を沈殿させます。その後、ブロックを反転させて培地をデカンテーションし、ペーパータオルの上に軽く叩いて残った液体を切り出します。プレートを再び密閉し、少なくとも20分後にマイナス80 degrees Celsiusで細胞を保存します。ペレットを室温で20分間解凍し、マルチチャンネルピペットを用いて200 µLのライシスバッファーで細胞を完全に再懸濁します。細胞に20 µLのDLPI溶液を加え、1000 RPM、4 °Cで10分間振盪しながら処理します。次に、各ウェルに10% DDM溶液を25 µL添加し、さらに60分間振盪しながら細胞をインキュベートします。DDM処理後、ディープウェルブロックを遠心分離し、上清のライセートを10 µL分マイクロタイタープレートに分注して、SDS-PAGEゲル用ロードバッファーを10 µL添加します。次に、各ウェルに10 µLの溶出バッファー溶液をロードし、コールドルームにて100～120 Vの定電圧で、ダイアフラムが底部に達するまで2～2.5時間電泳を行います。その後、ゲルの融合タンパク質を検出し細胞培養をスケールアップさせるため、青色光フィルターを備えたイメージャーにゲルを設置します。コンピテントセル化したE. coliにEloquaを形質転換した後、コロニーをピックアップして10 mLのpower brothに加え、37 °Cで一晩培養します。翌朝、一晩培養した菌液 5 mL を 500 mL のパワーブロスで希釈し、250 RPM、37 °C で振盪培養を継続します。595 nm における OD が約 0.5 に達したら、最終濃度 1 mM となるように IPTG を添加して発現を誘導し、その後、今度は 20 °C で一晩振盪培養します。翌朝、遠心分離により細胞を回収し、ペレットを -80 °C で保存します。細胞膜を調製します。室温の3番目のペレットを、細胞ペレット1gあたり5mLのPBSで再懸濁し、粘度が低下して流動的になるまで必要に応じて液量を増やします。次に、塩化マグネシウムを最終濃度1mM、DNAを最終濃度10µg/mLになるように加え、さらに細胞ペレット20gあたり1錠の市販のプロテアーゼ阻害剤タブレットを添加します。次に、冷却した細胞破砕機を用い、30 KPSIの圧力で細胞を破砕し、その後、未破砕の細胞とデブリを30,000 ×g、4 °Cで15分間遠心分離してペレット化します。上清を超遠心管に移し、上清を200,000 ×g、4 °Cで1時間遠心分離して、全膜画分を回収します。その後、細胞ホモジナイザーを用いて膜ペレットを10 mLの氷冷PBSに再懸濁し、使用する各界面活性剤で膜を可溶化させます。膜懸濁液900 µLを1.5 mLポリセントリフュージチューブに分注します。次に、調製直後の各界面活性剤100 µLを対応する1.5 mLチューブに加え、4 °Cで緩やかに撹拌しながらインキュベートします。1時間後、ベンチトップ超遠心機を用いて界面活性剤および可溶化画分をペレット化します。その際、チューブが少なくとも半分まで満たされていることを確認し、蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィー（FEC分析）用に上清を回収して保持します。次に、分画範囲の広いEquatorサイズ排除カラムを用い、流速0.3 mL/minで平衡化バッファーを流します。続いて、可溶化させた膜サンプル100 µLを同流速でカラムに注入し、蛍光光学系を用いて溶出プロファイルをモニターします。最後に、溶出量と蛍光強度のデータをスプレッドシートプログラムにインポートしてグラフ表示し、残存する可溶化膜物質をインゲル蛍光法で分析します。前述の通り、当該タンパク質ファミリーは細菌の細胞分裂に不可欠です。これらの画像には、当該構築物のうち24/47個について、代表的なゲル内蛍光可視化の結果を示しています。バンドの強度は、発現レベルの指標となります。例えば、レーン4の融合タンパク質は、両方の株で良好に発現しています。しかし、低分子側のバンドが追加で認められることは、多くのレーンにおいてタンパク質が部分的に分解していることを示唆しています。また、GFP単体と同等のサイズに相当するバンドも確認されます。例えば、C41(DE3) pLysS株では、G4およびH4は完全に分解されて遊離GFPになります。一方、LEMO 21(DE3)では、これらのグラフにおいて一部のタンパク質が完全な状態で存在しています。一次スクリーニングで良好な結果を示した2つのコンストラクトを蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィーで解析すると、試験した4種類の界面活性剤のいずれを用いるかによって、タンパク質の挙動が異なることがわかります。例えば、このタンパク質はDool Multisideにおいて、わずかな凝集を伴う対称的なピークのみを示し、その結果、以降の精製において最適の界面活性剤として選択されました。対照的に、もう一方の融合タンパク質は、テストしたすべての界面活性剤で同様のプロファイルを示しました。このプロトコルは、例えば、異なる発現条件下で培養した異なるE. coli株の導入や、一次および二次スクリーニングにおける追加の界面活性剤の検討など、容易に拡張することが可能です。要約すると、本プロトコルの主な目的は、多数の膜タンパク質の発現および可溶化についてスクリーニングを行い、詳細な解析に向けた候補を特定することです。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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