Name: マウスの海馬領域の歯状回における樹状樹枝状分岐の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 学ぶ マウス海馬歯状回の樹状樹枝状分岐評価法。リアルタイム手動トレースと拡張被写界深度イメージングの2手法を比較し、樹状突起の形態計測と神経構造の定量的解析を行います。

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この研究は、LuMind Foundation、Research Down Syndrome、およびAlzheimer's Association（AS）からの助成金によって支援されました。CPは、アーカンソー州立大学のCollege of Nursing and Health Professionsからのファカルティディベロップメント助成金によって部分的に支援されました。

注：実験は、退役軍人パロ​​アルトヘルスケアシステムにおける動物研究委員会によって承認された倫理基準に従って行った。 1.ゴルジ - コックス染色<ol><li>脳抽出と染色<ol><li>第一日目には、深く放血を経由して安楽死の前に100mg / kgのケタミンおよび10mg / kgキシラジンでマウスを麻酔。 </li><li>慎重に頭蓋冠を削除し、脳を解剖する。 <ol><li>まず小脳の上に湾曲したハサミを置く、頭蓋骨の上に皮膚を除去し、軽くはさみの先で中心溝に頭蓋冠と平行を切断嗅球に向かう方向に移動する、外側に指摘した。両側にこのプロセスを繰り返します。 </li><li>嗅球に向かってそれを回しながら頭蓋冠を持ち上げるために、外科ピンセットを使用して、それを破る。その後、逆さまに頭蓋骨を反転し、視神経を切断するためにピックを使って神経や脳を緩めます。最後に、大後頭孔のレベルで脊髄から脳を分離するためにピックを使用しています。 </li></ol></li><li>すぐに市販の、希釈されていないゴルジ - コックス溶液15mlで脳を浸す。暗所で室温で蓋をし、20ミリリットルのガラス瓶にゴルジ液に脳に保管してください。 </li><li> 2日目、ゆっくりとソリューションを注ぐと15ミリリットル新鮮なゴルジ - コックス·ソリューションと交換してください。脳を含むボトルをおさらいし、暗所で別の9日間、平静なままにしておきます。 </li></ol></li><li>セクショニングと埋め込み<ol><li> 11日の日に、脱水のためのddH 2 O中で調製30％のショ糖溶液中で脳を、置く。 12時間後に、新たに調製した30％のスクロースを含むソリューションを変更します。 4℃で3日間、30％ショ糖溶液中で脳をインキュベートする。 </li><li>ブレードが覆われるまで14日目に、30％のショ糖液でビブラトームのリザーバを埋める。 1メートルに速度を設定しますメートル/秒0.95ミリメートルの振幅である。 </li><li>余分な水分を除去し、冠状に切断し、カミソリの刃を使用して、小脳を除去しキムワイプで脳ブロット。 </li><li>しっかりと瞬間接着剤を使用したビブラトームプラットフォームに全脳をマウントし、それが2-4分間に設定することができます。リザーバ内に付着した脳を持つプラットフォームを挿入し、脳のトップに刃を調整します。 </li><li>ビブラトームを使用して、3回目の脳の後にブレードを変更するには、覚えて、室温で150ミクロン厚の切片に脳スライス。 </li><li>小さ ​​な傾いてブラシを使用して、リザーバーからのセクションをピックアップし、のddH 2 Oで行われた0.3％ゼラチンを含むペトリ皿にそれらを浸すのセクションでは、ペトリ皿に残っている各スライド上の0.3％のゼラチンの0.5ミリリットルを追加し、スーパーフロスト+スライドを広げて、コーティングするためにブラシを使用している間。 </li><li>静かにペトリ皿から浸さセクションをピックアップし、ゼラチン化スライド上に配置します。による脳切片の向き唯一の彼らの側にしていないのトップスにそれらに触れる。 </li><li>約10分後、コート組織の前に30％のスクロースを含むセクションが完全に乾く。その後、空気は、3日間のスライドラックに暗い場所で準備スライドを乾燥させます。 </li><li>市販の希釈して10倍ののddH 2 Oを使用して1倍するソリューションの開発7-10分のためのソリューションの開発にスライドを浸す。のddH 2 Oにスライドを3回すすぎ</li></ol></li><li>脱水<ol><li>蒸留のddH 2 Oを使用して20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、および95％エタノール溶液を調製し</li><li> 10分ごとに、ますます高いエタノール溶液にスライドを浸す。 </li><li>各回10分間、100％エタノール溶液で3回スライドを浸し。 </li><li>彼らはカバースリップしているまで、最終溶液中のセクションを保ち、5分ごとに100％のキシレンに3回連続してスライドを浸す。 </li><li> DPXの寛大な量（キシレン中のジ-n-ブチルフタレート）マウンティング培地（ABを配置プラスチック転送ピペットを使用して、各スライドのうち1〜1.5ミリリットル）。慎重に泡を避けるために、カバースリップを配置。 </li><li>エアドライカバーが滑っ脳セクションを水平に3日間。 </li></ol></li></ol> 2.ダブルコルチン染色<ol><li>深く（ステップ1.1.1を参照）、動物を麻酔。 </li><li>リン酸緩衝液12で行われた、新たに調製した4％パラホルムアルデヒドで心臓灌流を行います。 </li><li>ロッキングシェーカー上で一晩4℃で4％パラホルムアルデヒドの45ミリリットル中の脳（1.1.2を参照）、店舗を抽出します。 </li><li> 30％のショ糖溶液に脳を移し、4℃で48時間、完全な脱水を待つ。ショ糖から脳を取り出し、ドライアイス上に置き、銅ブロックの上に直接配置します。 </li><li>最適な切削温度（OCT）化合物でブロックを記入し、ランドマークとして嗅球を用いて脳の向きをマーク。 </li><li>クライオスタットを用いて、-20ºCで70ミクロン厚の切片を切り出し、それらを配置凍結保護物質溶液（0.05 Mリン酸ナトリウム緩衝液中の25％エチレングリコール、25％グリセロール、pH7.4）で-20℃で使用するまで続ける。 </li><li> 50％の凍結保護剤および50％メタノールの溶液を作る。この溶液に、0.5％過酸化水素水（体積/体積）を加える。室温で30分間浮遊切片をインキュベートする。 </li><li>組織学的オーブンに入れて、30〜40分間、TBSで37ºC（トリス緩衝食塩水）でウォームセクション。 </li><li>免疫染色の前に室温で45分間、0.3％トリトンおよび3％の正常ウマ血清を持つセクションをインキュベートする。 0.3％トリトンと1％正常ウマ血清をTBSで500：1に希釈DCX抗体の3ミリリットル溶液中で一晩4ºCでのセクションをインキュベートします。 </li><li>次の日は、セクションをTBSで3回連続して（10分ずつ）洗浄します。 </li><li>室温で2時間：（TBS中200 1）ビオチン化ウマ抗ヤギを持つセクションをインキュベートします。セクションをTBSで3回連続して（10分ずつ）洗浄します。 </li><li> Tをインキュベート室温で1.5時間：ABC Liteの（千1）と裾。 </li><li> 1 Mトリス塩酸（pH7.6）で15mlに溶解DAB（3,3 &quot;-Diaminobenzidine）の溶液に10mgの1錠30％のH 2 O 2の5μLを加える。 5分間この溶液に、すぐにセクションをインキュベートする。 </li><li>氷冷TBSで室温でTBSで1回洗浄した三回、それらを洗浄することにより反応を停止。 </li><li>キシレンで透明なエタノール溶液（50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、5分毎）を用いた一連の切片を脱水した後、ステップ1.3のようDPXを用いてスリップをカバーする。 </li></ol> 3.可視化<ol><li>セクションの完全な乾燥の後、鋭利な刃で、スライドの上に過剰DPXを削除し、顕微鏡の走査ステージ上に置きます。システムは、走査ステージ、ジョイスティック、およびカラー12ビットのカメラを備えた顕微鏡で構成されている。 </li><li>プログラムを起動します。新しいデータファイルを開きます。 </li><li>場所任意の場所でマウスポインタでクリックすることで、画面上の基準点。これは、プログラムウィンドウのツールパネルからすべてのアイコンがアクティブになります。 </li><li>ツールバーの「ジョイスティック無料」アイコンをクリックし、第一項の海馬の歯状回を見つけるためにジョイスティックを使用しています。 </li><li>プログラムウィンドウの「ツール」タブで、「シリアル課長」を選択します。ウィンドウの左下隅の「新規セクション」アイコンをクリックします。これは「シリアルセクションの設定」ウィンドウが開きます。 </li><li>連続切片Setupウィンドウを選択してから、海馬領域を含むセクションの合計数を入力します。評価間隔を選択します。 （DCXのための70ミクロンとゴルジ染色切片のために150μm）の厚さをカットセクションを入力します。 </li><li>ツールバーの「フリーハンド輪郭描画」アイコンをクリックして歯状回領域トレースを開始。歯状回顆粒細胞層の概要を説明します。&lt;/ LI&gt; <li> 「倍率」メニューから「100X」を選択します。セクションのイマージョンオイルの滴を追加し、100Xに目標を切り替えます。この目的の下で歯状回顆粒細胞体と樹状突起の位置を確認します。 </li><li>選択したニューロンに焦点を当て、ツールバーの「ニューロントレース」アイコンをクリックしてください。歯状回顆粒細胞体の周囲をトレースします。トレースが終了したら、右の「完了セルボディ」をクリックして選択します。 </li><li> x、y、z方向に手動で樹状突起のトレースを開始し、ジョイスティック及びz運動ノブを使用して、各ブランチに従う。分岐または三分岐ノードでは、右クリックすると、ドロップダウンメニューからそれぞれのオプションを選択します。これらのノードから発生する枝のそれぞれをトレースします。各ブランチの終わりに右クリックし、ドロップダウンメニューから「エンディング」を選択します。 </li><li>ソフトウェアのウィンドウに矢印キーのアイコンを使用すると、ランダムに別の歯状回顆粒細胞を選択し、DESCRと同じ手順に従ってくださいステップ3.9から3.10にアイベッド。全体のトレースを保存します。 </li><li>ニューロンのトレースソフトウェアを起動します。 </li><li>実験群の最初のマウスからの第NRXデータファイルを開きます。実験群の第二のマウスのNRXファイルを追加します。このグループからすべてのNRXファイルが追加されるまで継続する。 </li><li>分析]タブの下で、「ファンインダイアグラム」を選択します。これはファンイン分析ウィンドウが開きます。マーク「樹状突起」をチェックして、マウスのこのグループ（ 図1）のための樹状突起の長さと分岐パターンを示しているディスプレイをクリックします。 </li></ol> 4. EDFI 注：この方法は、迅速に各フィールドのz軸を介して多数の画像を記録し、z軸全体のすべての集中画素を含む二次元画像を生成することを可能にする。その結果、収集した画像からのすべての集中画素を含む合成画像になります。 <ol><li>デジタルカムにマイクロスコープを接続時代。顕微鏡に接続された走査ステージに最初のセクションを配置して、10倍の対物レンズに切り替える。関心のある領域にステージを移動します。 </li><li>ビデオキャプチャプログラムを起動します。 </li><li>録音ボタンを押します。とすぐに録音ボタンを押している、4秒の合計セクションの上から下に移動するために、マクロフォーカスノブを使用しています。結果のビデオファイルを保存します。 </li><li>ファイルを開き、圧縮されていないファイル形式で保存することで、非圧縮フォーマットにAVIビデオファイルを変換するImageJのフリーウェアを使用してください。 </li><li>画像解析プログラムを起動し、AVIファイルを開きます。 「プロセス」メニューに移動し、「フィールドの拡張深さ」をクリックしてください。対応するビデオファイルを選択します。 「出力」オプションでは、「コンポジットベスト焦点画像の生成」を選択します。 </li><li> 「フォーカス解析」オプションでは、「正規化照明」と「最大局所コントラスト」オプションを選択します。その後、「Creを選択「食べた。結果の画像は、z軸（ 図2）を通してすべてのフォーカスピクセルを表す。 </li><li>結果の画像を保存します。 </li></ol> 5.極めて高解像度の画像を生成注：この方法では、ユーザーは自動的に自動化された方法で、高倍率·高解像度画像から低倍率で非常に高解像度の画像を生成することを可能にする。 <ol><li>顕微鏡に接続された走査ステージに最初のセクションを配置します。顕微鏡デジタルカメラに接続されている。関心のある領域にステージを移動します。 </li><li>画像取得プログラムを起動します。 </li><li>関心領域の画像は、少なくとも10％のオーバーラップを有することを確認して（xは3116 4076）10倍対物レンズを使用し、高解像度を取得し、保存する。 </li><li>イメージをステッチするイメージコンポジット·エディタを実行します。 </li><li>メニューをファイルに移動し、「新しいパノラマ」をクリックしてください。画像はSTされているフォルダを選択します論理和。同じ領域を押して「OK」に属している画像を選択します。 </li><li>ボタンを押して「ディスクに書き出し」とイメージを保存します。この画像は、分析および/ ​​または実演（ 図3）のために使用することができる関心領域の非常に高解像度の画像を表す。 </li></ol>

<ol><li>Bosch, M., Hayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity of dendritic spines.</a> Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 383-388 (2012).</li>
<li>Isaac, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synapse%3A+center+stage+for+many+brain+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The synapse: center stage for many brain diseases.</a> The Journal of Physiology. 587 (4), 727-729 (2009).</li>
<li>Sheng, M., Sabatini, B. L., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapses+and+Alzheimer%E2%80%99s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Synapses and Alzheimer’s disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , a005777(2012).</li>
<li>Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+physiological+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).</li>
<li>Huttenlocher, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+development+in+neocortex+of+children+with+mental+defect+and+infantile+spasms%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Dendritic development in neocortex of children with mental defect and infantile spasms.</a> Neurology. 24 (3), 203-210 (1974).</li>
<li>Marin-Padilla, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+origin+of+the+pericellular+baskets+of+the+pyramidal+cells+of+the+human+motor+cortex%3A+a+Golgi+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Double origin of the pericellular baskets of the pyramidal cells of the human motor cortex: a Golgi study.</a> Brain Res. 38 (1), 1-12 (1972).</li>
<li>Dang, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formoterol%2C+a+long-acting+%CE%B22+adrenergic+agonist%2C+improves+cognitive+function+and+promotes+dendritic+complexity+in+a+mouse+model+of+Down+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Formoterol, a long-acting β2 adrenergic agonist, improves cognitive function and promotes dendritic complexity in a mouse model of Down syndrome.</a> Biol Psychiatry. 75 (3), 179-188 (2014).</li>
<li>Dobrović, B., Curić, G., Petanjek, Z., Heffer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+morphology+and+spine+density+is+not+altered+in+motor+cortex+and+dentate+granular+cells+in+mice+lacking+the+ganglioside+biosynthetic+gene+B4galnt1+A+quantitative+Golgi+cox+study%5BTitle%5D)+AND+%22Coll+Antropol%22%5BJournal%5D)">Dendritic morphology and spine density is not altered in motor cortex and dentate granular cells in mice lacking the ganglioside biosynthetic gene B4galnt1 A quantitative Golgi cox study.</a> Coll Antropol. 35 (Suppl 1), 25-30 (2011).</li>
<li>Dijkmans, T. F., van Hooijdonk, L. W., Fitzsimons, C. P., Vreugdenhil, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+doublecortin+gene+family+and+disorders+of+neuronal+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Cent+Nerv+Syst+Agents+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The doublecortin gene family and disorders of neuronal structure.</a> Cent Nerv Syst Agents Med Chem. 10 (1), 32-46 (2010).</li>
<li>Guerra, E., Pignatelli, J., Nieto-Estévez, V., Vicario-Abejón, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+olfactory+bulb+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of olfactory bulb neurogenesis.</a> Anat Rec. 296 (9), 1364-1382 (2013).</li>
<li>Imayoshi, I., Shimojo, H., Sakamoto, M., Ohtsuka, T., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+visualization+of+notch+signaling+in+mammalian+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Genetic visualization of notch signaling in mammalian neurogenesis.</a> Cell Mol Life Sci. 70 (12), 2045-2057 (2013).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), 3564-3510 (2012).</li>
<li>Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Golgi-Cox+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The Golgi-Cox method.</a> Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).</li>
<li>Juraska, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+developmental+plasticity+in+the+visual+cortex+and+hippocampal+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Sex differences in developmental plasticity in the visual cortex and hippocampal dentate gyrus.</a> Prog Brain Res. 61, 205-214 (1984).</li>
<li>Gao, X., Deng, P., Zao, C. X., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderate+traumatic+brain+injury+causes+acute+dendritic+and+synaptic+degeneration+in+the+hippocampal+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Moderate traumatic brain injury causes acute dendritic and synaptic degeneration in the hippocampal dentate gyrus.</a> PLoS One. 6 (9), e24566(2011).</li>
<li>Zhang, L., Hernández, V. S., Estrada, F. S., Luján, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+CA+field+neurogenesis+after+pilocarpine+insult%3A+The+hippocampal+fissure+as+a+neurogenic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Hippocampal CA field neurogenesis after pilocarpine insult: The hippocampal fissure as a neurogenic niche.</a> J Chem Neuroanat. 56, 45-57 (2014).</li>
<li>Merz, K., Lie, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+Doublecortin+is+dispensable+for+the+development+of+adult+born+neurons+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evidence that Doublecortin is dispensable for the development of adult born neurons in mice.</a> PLoS One. 8 (5), e62693(2013).</li>
<li>Hussaini, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+antigen+retrieval%3A+an+effective+method+to+detect+and+identify+progenitor+cell+types+during+adult+hippocampal+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li>
</ol>

この記事の発行手数料はMBFバイオサイエンスが主催している。

ここでは、2つの方法がRTIとEDFIと組み合わせて、従来の染色法を用いて、成熟した、新たに生まれたニューロンにおける樹状突起樹枝状分岐の程度を定量化するために記載された。ニューロンの高解像度画像の取得は、神経変性障害の有害な影響を試験するための非常に有用な方法を提供し、ひいては、海馬神経細胞を標的とする治療戦略を評価するための手段を提供する。 RTI方法は樹枝状分岐、および地形の程度に関係の深いデータをキャプチャするために利用されたが、EDFI方法は、個体のセグメントまたは木の複雑さに関する情報を提供することができない。それにもかかわらず、EDFI方法の利点は、高価なハードウェアを購入する必要がなく、少ない時間を消費しているという事実にある。 画像解析プログラムは、ビデオファイルにEDFIを実行するために使用された。高分解能かつ高速のアクセスを有するカメラは、各フィールドの厚さ全体にわたって多数の画像の収集を可能にし、真のx、y、およびz寸法を表す画像を生成する。 EDFI方法の1つの欠点は、複数の画素（同じxおよびy）z...

シナプスの数と構造の動的な変化は、開発の特徴で、高齢化、および多数の神経変性疾患1-3である。シナプスの情報を受信し、統合するための神経細胞の能力は、樹状形態とシナプス結合の動的な変化に依存している。確かに、正の相関が樹状突起棘と認知機能4に影響を与えるの両方シナプス数、間に存在する。従って、樹状突起棘の数のデクリメントが樹状突起棘の定量化に大きな関心を促し、神経疾患5-7多数の認知機能障害と関連していることは驚くべきことではない。それにもかかわらず、背骨密度の定量化は、樹状ツリー全体のシナプスの地形や流通に関する有用な情報を生成するのに失敗し、時間がかかり、面倒な作業のまま。一緒に幸いなことに、染色方法（ 例えば 、ゴルジ-コックスとダブルコルチン（DCX））高度なイメージング技術と現在の障壁を克服し、信頼性が高く、迅速な方法で樹枝状分岐の高解像度画像を生成するために利用することができる。ゴルジ-コックス染色法は、すべてのニューロン8の樹樹枝状分岐の状態を評価するために展開することができますが、DCXは、特に歯状回と脳室下帯9で新たに生まれたニューロンを標識するために展開することができ、重要な考慮事項は、神経新生の両方で発生していることを与えられた寿命10,11を通じて、これらの地域。 染色後、つの撮像方法は、樹状特性を評価するために配備された：i）のリアルタイムイメージング（RTI）及びフィールドイメージング（EDFI）のii）の拡張深度。 RTI技術は、個々の樹状セグメントと枝に沿って樹枝状分岐の長さと順序をトレースし、定量化するための平均値を提供します。したがって、それぞれの樹状ツリー占める総面積と体積を推定するために1を可能にします。以上のSpecifically、RTIの方法では、ユーザは、連続的セグメントを識別し、ソフトウェアを追跡するニューロンは、樹枝状構造のx、y、およびz座標を収集するように反復的に再集束及び3Dにおける樹枝状構造の軌道を再構成する。比較的、EDFI方法は全体z軸に関する情報を提供し、合成画像を生成することではなく、厚い組織標本において、樹状密度を評価するための比較的単純かつ迅速な手段を提供する。そうするために、ユーザは、セクションの厚さ全体の高解像度ビデオファイルを記録し、画素に焦点が完全であることを特徴とするポイントを識別するためにビデオフレームを検索するためのソフトウェアを使用する。その後、フォーカスピクセルがマージされ、高解像度、合成2D画像に統合される。この合成画像は関係なく、z軸での位置の中で、焦点となったすべてのピクセルが含まれています。これらの2D画像の定性的および定量的分析は、濃度を決定するためにその後に使用することができの樹状突起の各分野での分岐。 最後に、関心領域全体における樹枝状結晶の分析および評価のために非常に高解像度の画像を生成するパノラマの方法を提示する。この技術は、非常に高解像度で高価なデジタルカメラへのアクセスの欠如を克服するために展開することができる。この方法を使用して、一方がx軸とy軸に沿った異なる位置で連続画像を取得し、自動的にそれらを一緒にフリーウェアを使用してステッチ（ 例えば 、画像のコンポジット·エディタ）。特に、この方法は、かなり広範囲に樹状樹枝状分岐の定性的および定量的評価のために使用することができる。

<table><tbody><tr><td>改変ゴルジコックス染色液&nbsp;</td><td>ワイルコーネル医科大学</td><td>NA</td><td>ストア4&deg;C till use</td></tr><tr><td>1x Developing Solution (Stock 10x)</td><td>Weill Cornell Medical</td> College <td>NA</td><td>store at 4&deg;Cは</td></tr><tr><td>30%スクロースを使用するまで、</td><td>シグマ</td><td>CAS#57-50-1</td><td>は新鮮に&nbsp;ddH2O</td></tr><tr><td>0.3%ゼラチン</td><td>シグマ</td><td>CAS#9000-70-8</td><td>NA</td></tr><tr><td>等級エタノール溶液(20%、30%、40%、50%、80%、90%、95%、100%)</td><td>シグマ</td><td>CAS 603-003-00-5</td><td>NA</td></tr><tr><td>キシレン</td><td>シグマ</td><td>CAS#1330-20-7</td><td>NA</td></tr><tr><td>DPXミディアム</td><td>EMS&nbsp;</td><td>#13510</td><td>NA</td></tr><tr><td>スーパーフロスト(+)白色</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>71869-10</td><td>NA</td></tr><tr><td>カバースリップ22x50mm(VWR#48393-059)</td><td>VWR&nbsp;</td><td>#4811-703</td><td>NA</td></tr><tr><td>DCX 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8066</td><td>4 C</td></tr><tr><td>DAB</td><td>Sigma</td><td>CAS 番号 91-95-2 &nbsp;</td><td>△20</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-tek</td><td>4583</td><td>NA</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>CAS番号77-86-1 &nbsp;</td><td>NAの</td></tr><tr><td>ABC Lite</td><td>Vector</td><td>PK4000</td><td>NA</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>デジタルカメラ</td><td>Nikon</td><td>DS-Ri1</td><td></td></tr><tr><td>12ビットカメラ&nbsp;</td><td>Q想像&nbsp;</td><td>01 MBF2000RF-CLR-12</td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida System</td><td>MBF Bioscience</td><td>V.10</td><td></td></tr><tr><td>Image Composite Editor</td><td>Microsoft</td><td>1.4.4.0</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>Nikon</td><td>F 3.0</td><td></td></tr><tr><td>Image Pro Plus</td><td>Mediacy</td><td>Versin 7.00</td><td></td></tr></tbody></table>

マウスの海馬領域の歯状回における樹状樹枝状分岐の評価

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

樹状突起樹状突起形成は、ニューロンの構造的および機能的完全性を調べるための信頼できるマーカーであることが示されています。実際、樹状突起の樹状化の複雑さと程度は、これらの細胞のシナプス可塑性とよく相関しています。樹状突起の樹状突起形成を評価するための信頼性の高い方法は、これらの構造に対する神経障害の有害な影響を特徴付け、治療的介入の影響を決定するために必要です。しかし、これらの構造の定量化は、その複雑で動的な性質を考えると、手ごわい作業であることが証明されています。幸いなことに、高度なイメージング技術を従来の染色方法と組み合わせて樹状突起の樹状化の状態を評価することができ、より信頼性が高く迅速な評価手段を提供します。以下は、これらのイメージング技術を染色方法と組み合わせて、野生型マウスの樹状突起樹状突起形成を特徴付けた例です。これらの補完的なイメージング法は、海馬領域内のかなり広い領域にまたがる樹状突起の樹状突起化を定性的および定量的に評価するために使用できます。

現存及び新生歯状回顆粒細胞から生じる樹枝状分岐の程度は、ゴルジコックスまたはDCX染色（ 図1）のいずれかを使用して、野生型マウスにおいて分析した。 DCX陽性細胞の樹状突起セグメントは、13-36ミクロンの長いことが判明した。樹状長さの正規分布は、コルモゴロフ-スミルノフ検定を用いて試験した（D = 0.1217のp &lt;0.01、Liliefors pは&lt;0.001; 図4および図5）。 樹枝状分岐のオーダーごとのセグメントの長さの分析では、最も長いセグメントは、樹枝状分岐の最初の注文（38.38 + 1.45ミクロン）で発見された。同様のパターンは、表面（111.98 + 3.93平方ミクロン）と体積（27.93 + 1.03立方ミクロン）について見出された。これらのセグメントによって占められたセグメントの長さおよび表面積及び/または体積の間の線形相関も試験した。表面た（p = 0.001、rは2 = 0.873）およびボリュームた（p = 0...

私たちは、マウスモデルの海馬における樹状突起形成の可視化と定量化のための2つの方法、すなわちリアルタイムイメージングと拡張被写界深度イメージングについて説明します。前者の手法では、高度な地形トレースや分岐範囲の定量化が可能になるのに対し、後者では樹状突起樹のスピーディーな可視化が可能です。

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

本実験の全体的な目的は、マウスモデルの海馬における樹状突起の分枝の程度を調べることです。これは2つの異なる手法を用いて行われます。1つ目の手法では、各切片の全厚にわたって、樹状突起を手作業でリアルタイムにトレースします。トレース後、樹状突起の樹状構造全体を再構築し、解析することができます。異なるマウスから得られたさまざまなファンダイアグラム（扇状図）の解析を用いることで、客観的な比較手段として利用可能です。2番目の手法は、拡張被写界深度（EDF）イメージングを用いて、樹状突起の分岐を可視化する方法です。最後に、パノラマ法を用いて複数の高倍率画像を繋ぎ合わせ、関心領域全体の樹状突起を定性的および定量的に評価するための1枚の高解像度合成画像を作成します。この手順のデモンストレーションには、私の研究室のGI mobi. AMIリサーチフローを使用します。既存の手法に対するこれらの技術の主な利点は、操作が簡単であること、および画像取得とデータ収集の速度が速いことです。この手法は、影響を受けた脳領域における樹状突起の評価や、さまざまな治療法が樹状突起に及ぼす影響の評価など、神経生物学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。この手順では、マウスの脳を4% Paraform aldehydeで固定した1日後、脱水のため、4°Cで48時間ショ糖溶液に浸します。ショ糖溶液から脳を取り出し、ドライアイス上に配置した銅ブロックの上に直接置きます。ブロックをOCTで充填し、嗅球を指標として脳の方向をマークします。クライオスタットを用いて-20 °Cで厚さ70 µmの切片を作成し、クライオプロテクタント溶液に入れ、使用時まで-20 °Cで保存します。切片をメタノール調製過酸化水素溶液中で室温で30分間インキュベートし、続いてTBS中で37 °Cで30分間温めます。翌日のDCX抗体による染色の前に、切片を0.3% Tritonおよび正常馬血清と共に室温で45分間インキュベートする。切片をTBSで3回連続して洗浄し、ビオチン化馬抗 IgGと室温で2時間インキュベートする。切片をTBSで10分ずつ3回連続して洗浄し、B, C lightと共に1.5時間インキュベートする。室温で、DAB溶液に過酸化水素を加え、直ちに切片をこの溶液中で5分間インキュベートし、氷冷TBSで3回洗浄して反応を停止させます。続いて、室温のTTBSで1回洗浄します。一連のエタノール溶液を用いて切片を脱水します。クリアリング剤とキシレンにそれぞれ5分間浸し、その後DPXを用いてカバーガラスを被せます。切片が完全に乾燥した後、スライド表面の余分なDPXを鋭利な刃で取り除き、顕微鏡のスキャニングステージに1枚ずつ配置します。可視化システムは、スキャニングステージ用ジョイスティックと12ビットカラーカメラを備えた顕微鏡で構成されています。次に、neuro lucitaプログラムを起動し、新しいデータファイルを開きます。マウスポインターで画面上の任意の場所をクリックして基準点を設定し、プログラムウィンドウのツールパネルにあるすべてのアイコンを有効にします。その後、ツールバーのジョイスティックフリーアイコンをクリックし、ジョイスティックを使用して海馬の歯状回を特定します。プログラムウィンドウのツールタブにある最初のセクションで、serial section managerを選択します。ウィンドウの左下隅にあるnew sectionアイコンをクリックして、serial section setupウィンドウを開きます。その後、serial section setupウィンドウを選択し、海馬領域を含むセクションの総数を入力します。次に評価間隔を選択し、切片の厚さを入力します。ツールバーにあるフリーハンド輪郭描画アイコンをクリックし、歯状回領域のトレースを開始してください。続いて、歯状顆粒細胞層を囲みます。倍率メニューから100xを選択します。次に、切片上に浸油を1滴滴下し、対物レンズを100xに切り替えます。この対物レンズ下で、歯状顆粒細胞の細胞体と樹状突起を確認します。次に、選択したニューロンに焦点を合わせ、ニューロン・トレース・アイコンをクリックします。ツールバーを使用して、歯状回顆粒細胞の細胞体の外周をトレースしてください。トレースが完了したら、右クリックして「finish cell body」を選択します。次に、樹状突起の手動トレースをX、Y、Z方向に行い、ジョイスティックとZモーターノブを使用して各分枝を追跡します。分岐点（二分叉または三分叉ノード）では、それぞれのオプションを選択してください。ドロップダウンメニューから、これらのノードから生じる各分枝をトレースします。各分枝の末端では、右クリックしてドロップダウンメニューから「ending」を選択してください。ソフトウェアウィンドウ内の矢印キーアイコンを使用して、別の歯状回顆粒細胞をランダムに選択し、先ほど示したトレース手順を繰り返します。トレース全体を保存してください。次に、ニューロン解析のためにNeuroLucida Explorerを起動します。実験群の1匹目のマウスから得られた最初のNRXデータファイルを開きます。実験群の2匹目のマウスのNRXファイルを追記し、この群のすべてのNRXファイルが追記されるまでこの操作を繰り返します。分析（analysis）タブで、図の中のファン（fan）を選択して「fan in analysis」ウィンドウを開きます。「dendrites」にチェックを入れ、「display」をクリックして、このマウス群における樹状突起の結合と分岐パターンを表示させます。この手順では、顕微鏡をデジタルカメラに接続します。顕微鏡に接続されたスキャンステージに切片を置き、10x対物レンズに切り替えます。次に、ステージを目的の領域まで移動させます。ビデオキャプチャプログラムを起動し、録画ボタンを押してください。録画ボタンを押した直後に、マクロフォーカスノブを使用して切片の上端から下端まで計4秒かけて移動させます。得られたビデオファイルを保存する前に、フリーウェアのImage Jを用いてAVIビデオファイルを非圧縮形式に変換してください。画像解析プログラムを起動し、VIファイルを開きます。プロセスメニューから「extended depth of field」をクリックします。出力オプションで、対応するビデオファイルを選択してください。フォーカス解析オプションで「generate composite best focus image（合成ベストフォーカス画像の生成）」を選択します。「normalized illumination（正規化照明）」と「max local contrast（最大局所コントラスト）」のオプションを選択してください。次に「create」をクリックして結果画像を生成します。これにより、Z軸全体でフォーカスが合ったすべての画素を反映した画像が作成されます。その後、得られた画像を保存します。このステップでは、顕微鏡に接続されたスキャンステージに切片を設置します。ステージを移動させ、目的の領域に合わせます。次に、10倍対物レンズを使用して画像取得プログラムを開始し、関心領域から高解像度画像を撮影して保存します。この際、画像間に少なくとも10%のオーバーラップがあることを確認してください。その後、Image Composite Editorを実行して画像をスティッチします。ファイルメニューから「新規パノラマ」をクリックします。画像が保存されているフォルダを選択してください。次に、同一領域に属する画像を選択し、「Okay」を押します。「export to disc」ボタンを押し、画像を保存してください。この画像は、解析に使用可能な関心領域の極めて高解像度な写真を示しています。この図は、EDFI法の有無による樹状突起の分枝の可視化を示しています。最適な焦点面を決定する従来の手法をEDFIと比較したところ、樹状突起の面積において有意に高い値が得られました。EDFI法を用いて解析を行った。ここでは、異なる分岐次数における樹状突起の長さおよび占有体積の定量結果を示す。最大長および最大体積は、次数1で達成された。これは歯状回顆粒細胞の樹状突起長のヒストグラムです。DCX染色されたDDRsの樹状突起セグメントの大部分は、長さが13から26でした。この赤の点線は、本手順に従って提示されたデータの正規分布を示しています。樹状突起が占める体積や面積に関するさらなる疑問を解決するために、NeuroLucidなどの他の古典的な手法を用いることも可能です。本ビデオで紹介した手法は、神経生物学分野の研究者が神経構造の評価を行うだけでなく、厚い脳切片中のミクログリアのような非神経性の微小構造を評価する際にも非常に有用です。このビデオを視聴することで、比較的短期間で神経突起の広がりの程度を評価する方法について、十分に理解できたはずです。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

実体顕微鏡下で成体マウスから海馬歯状回の除去のための解剖手法は、このビデオに記録されたプロトコルで実証された。...

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正確に特定および蛍光抗体法を用いた海馬スライスにおけるシナプスの分析のためのプロトコルは、この資料に記載されています。...

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高周波刺激によるマウスの海馬歯状回の活性化のための侵襲的な方法

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成体マウスのデンテート・ジラスにおける全細胞記録と神経再建のための、逆海馬からの急性スライスの作製

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海馬および前頭前野における樹状突起脊椎の可視化のための迅速なゴルジ染色

海馬の歯状回は、学習と記憶において重要で明確な機能を果たします。このプロトコルは、自由に動くマウスの歯状回における顆粒細胞の in vivo...

マウス海馬歯状回における顆粒細胞のin vivoカルシウムイメージング 

学ぶ マウス海馬歯状回の樹状樹枝状分岐評価法。リアルタイム手動トレースと拡張被写界深度イメージングの2手法を比較し、樹状突起の形態計測と神経構造の定量的解析を行います。

マウスの海馬領域の歯状回における樹状樹枝状分岐の評価

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