マウスの海馬領域の歯状回における樹状樹枝状分岐の評価

次の実験の全体的な目標は、マウスモデルの海馬における樹状突起樹状突起化の程度を研究することです。これは、2つの異なる方法で実現されます。最初の方法では、樹状突起は、各セクションの厚さ全体にわたってリアルタイムで手動でトレースされます。

トレース後、樹枝状樹状樹全体を再構築して分析できます。異なるマウスから得られたさまざまなファンダイアグラムのファンダイアグラム分析を使用して、客観的な比較手段として使用できます。2 つ目の方法は、被写界深度を延長したイメージングで樹状突起の樹状突起化を視覚化することです。

最後に、パノラマ法を使用して、複数の高倍率画像をつなぎ合わせて、関心領域全体における樹状突起の定性的および定量的評価のための1つの高解像度合成画像を生成し、この手順を実証するのがGIモビである。AMIの研究は私の研究室から流れています。これらの手法が既存の金属よりも優れている主な点は、使いやすさと、取得とデータ収集の速さです。

この方法は、影響を受けた脳領域の樹状突起化の評価や、樹状突起に対するさまざまな治療法の影響の評価など、神経生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手順では、マウスの脳を4%パラホルムアルデヒドに固定した翌日、ショ糖溶液に入れて4°Cで48時間脱水します。スクロースから脳を取り除き、ドライアイスの上に置かれた銅ブロックに直接置きます。

ブロックをOCTで満たし、嗅球を目印として脳の向きをマークします。厚さ70ミクロンの切片をクライオスタットでマイナス20°Cで切断し、クライオプロテクタント溶液に入れてマイナス20°Cで使用まで保ちます。過酸化水素中の切片をメタノール中で室温で30分間インキュベートした後、TBSで摂氏37度で30分間温めます。

切片を0.3%Tritonおよび正常ウマ血清と室温で45分間インキュベートした後、翌日DCX抗体で染色します。切片をTBSで3回連続して洗浄し、ビオチン化ウマのアンティゴで切片を室温で2時間インキュベートします。切片をTBSで3回連続して10分間洗浄し、B、Cライトで1.5時間インキュベー

室温で、過酸化水素をDAB溶液に加え、この溶液で切片を直ちに5分間インキュベートし、氷冷TBSで3回洗浄し、続いて1回洗浄して反応を終了します。TT BSで室温で洗ってください。一連のエタノール溶液を使用して切片を脱水します。

各5分間、透明とキシレン、その後、DPXを使用してスリップを覆います。切片が完全に乾いたら、スライド表面の余分なDPXを鋭利な刃で洗浄し、一度に1つずつ顕微鏡の走査ステージに置きます。可視化システムは、スキャニングステージジョイスティックを搭載した顕微鏡と12ビットカラーカメラで構成されています。

次に、neuro lucita プログラムを起動し、新しいデータ ファイルを開きます。マウスポインタで任意の場所をクリックして、プログラムウィンドウのツールパネルからすべてのアイコンをアクティブにするために、画面上の参照点を配置します。次に、ツールバーのジョイスティックのフリーアイコンをクリックし、ジョイスティックを使用して海馬の歯状回を見つけます。

プログラムウィンドウの[ツール]タブの最初のセクションで、[シリアルセクションマネージャー]を選択します。ウィンドウの左下隅にある新しいセクションアイコンをクリックして、シリアルセクション設定ウィンドウを開きます。その後、シリアルセクション設定ウィンドウを選択し、海馬領域を含むセクションの総数を入力します。

次に、評価間隔を選択し、セクションの厚さを入力します。歯状回のトレースを開始するには、ツールバーのフリーハンド輪郭描画アイコンをクリックします。続いて、歯状顆粒細胞層の輪郭を描きます。

倍率メニューから100倍を選択します。次に、セクションにイマージョンオイルを一滴加え、対物レンズを100 xに切り替えます。この目標の下で歯状顆粒細胞体と樹状突起を見つけます。

次に、選択したニューロンにフォーカスし、ニューロントレースアイコンをクリックします。ツールバーで、歯状顆粒細胞体の円周をトレースします。トレースが終了したら、右クリックしてセル本体の終了を選択します。

次に、樹状突起を手動でX、Y、Z方向にトレースし始め、ジョイスティックとZモーターノブを使用して各分岐をたどります分岐または分岐ノードで、それぞれのオプションを選択します。ドロップダウンメニューから、各ブランチの最後にあるこれらのノードから発生する各ブランチをトレースします。右クリックして、ドロップダウンメニューから[ending]を選択します。

ソフトウェアウィンドウの矢印キーアイコンを使用します。別の歯状顆粒細胞をランダムに選択し、示したようにトレース手順を繰り返します。トレーシング全体を保存します。

次に、ニューロン分析用のneuro lucita explorerを起動します。実験グループの最初のマウスから最初のNRXデータファイルを開きます。実験グループの2番目のマウスのNRXファイルを追加し、このグループのすべてのNRXファイルが追加されるまで続けます。

解析タブで、ダイアグラム内のファンを選択して解析ウィンドウでファンを開き、樹状突起にチェックマークを付け、このマウスグループの樹状突起のリンクと分岐パターンの表示をクリックします。この手順では、顕微鏡をデジタルカメラに接続します。顕微鏡に接続された走査ステージにセクションを置き、10 x対物レンズに切り替えます。

次に、ステージを関心のある領域に移動します。ビデオキャプチャプログラムを開始し、録画ボタンを押します。録画ボタンを押すとすぐに、マクロフォーカスノブを使用してセクションの上部から下部に合計4秒間移動します結果のビデオファイルを保存する前に、Image Jフリーウェアを使用してVIビデオファイルを非圧縮形式に変換します。

画像解析プログラムを起動し、a VIファイルを開きます。プロセスメニューに移動し、拡張被写界深度をクリックします。出力オプションで対応するビデオファイルを選択します。

フォーカス解析オプションで、合成ベストフォーカス画像の生成を選択します。正規化された照明と最大ローカル コントラストのオプションを選択します。次に、[作成] をクリックして、Z 軸全体のフォーカスされたすべてのピクセルを表す結果の画像を生成します。

その後、結果の画像を保存します。このステップでは、顕微鏡に接続された走査ステージにセクションを配置します。ステージを対象領域に移動します。

次に、10倍の対物レンズを使用して画像取得プログラムを開始し、関心領域から高解像度の画像を取得して保存し、画像間のオーバーラップが少なくとも10%であることを確認します。次に、画像合成エディタを実行して、後で画像をステッチします。ファイルメニューに移動し、新しいパノラマをクリックします。

画像が保存されているフォルダを選択します。次に、同じ地域に属する画像を選択し、[OK]を押します。ディスクへのエクスポートボタンを押して、画像を保存します。

この画像は、解析に使用できる対象領域の非常に高解像度の画像を表しています。この図は、EDFI法を使用した場合と使用しない場合の樹状突起樹状突起化の視覚化を示しています。最適な焦点面を見つける従来の方法は、EDFIおよび樹状突起面積の有意に高い値と比較されました。

EDFI法を使用していることがわかりました。ここでは、樹状突起がさまざまな分岐順序で占める長さと体積の定量化を示します。最大の長さと体積は、注文1で達成されました。

これは、歯状顆粒細胞の樹状突起の長さのヒストグラムです。DCX染色DDRの樹状突起セグメントの大部分は、長さが13〜26でした。この赤い点線は、この手順に従って表示されるデータの正規分布を示しています。

ニューロルシッドのような他の古典的な方法は、樹状突起が占める体積と面積に関する追加の質問に答えるために使用できます。ここで紹介したこの手法は、神経生物学の研究者が神経細胞の構造を評価するだけでなく、脳の厚い部分にあるミクログリアのようなニューロン以外の小さな構造を評価するのに非常に役立ちます。このビデオを見れば、比較的短時間でニューロンの投射の程度を評価する方法についてよく理解できるはずです。