Name: マウスリブを切除するための外科的手順：大規模ロング骨修復のためのモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 学ぶマウス肋骨切除手術による大規模骨修復モデルの構築法。皮膚切開、肋骨露出、骨切除、縫合の各ステップを解説し、骨再生の細胞・分子メカニズムをin vivoで観察するための信頼性の高い実験系を提供します。

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私たちは、原稿を批判的に読んでくださったマリアーニ研究室のメンバーに感謝します。私たちの資金源は、バクスター医学奨学生研究フェローシップ(MKSへ)、USC学部フェローシップ、プロボスト、ディーン・ジョアン・M・シェーファー、ローズヒルズフェローシップ(MKSへ)でした。また、パサデナシティカレッジ(TTTへ)を通じたCIRM BRIDGESフェローシップも認めています。ジェームズH.ザンバージ研究イノベーション基金、USC再生医療イニシアチブ、およびNIAMS NIHの賞番号R21AR064462(F.V.Mに)。

注：すべての手順は、南カリフォルニア大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認された動物のプロトコルに従っている。 外科1.準備<ol><li>必要な手術器具や消耗品（滅菌、アイテム1 - 材料のリストの18）をレイアウトし、フード内やダウンドラフトテーブルの上に解剖顕微鏡および光ファイバトランスイルミを手配。 </li><li>麻酔を誘導するために、4％イソフルランで誘導チャンバー内に（3ヶ月 - - 30グラム、1〜20）性的に成熟したマウスを置きます。 </li><li>足および/またはテールピンチテストで麻酔を確認してください。 </li><li>手術中に目の乾燥を避けるために、マウスの目に軟膏を適用します。 </li><li>顕微鏡ステージにマウスを移動します。メンテナンスホースのノーズコーンにマウスを置き、横方向に配置する。体温を維持するために動物に隣接した温暖化ポーチを提供します。 NOTE：マウスの​​位置は個人的な好み、および/または外科医の利き手に依存している、左または右のいずれかの側は問題ありません。 </li><li>メンテナンスのため、3％、および呼吸数を見て - 2にイソフルランを調整します。 </li><li> 25 G針を有する手術後の痛みのためにブプレノルフィン（0.05 mg / kgを）皮下（脚の横脇腹）を注入します。脚部は正常な反応であるけいれんがあります。 </li></ol> 2.オープニング切開<ol><li>触診が希望するリブを検出し、シェーバーで毛のエリアをクリア。 注：リブ1-7が肺に近いと11-13がかなり短いので、リブ8-10を推奨します。肋骨を数えるのは数1のような最も吻側リブで始める必要があります。 </li><li> （3Xは、多くの場合、動物使用プロトコルによって推奨）ポビドンヨードとイソプロパノール（70％）スワブを交互にエリアを準備します。 </li><li>真上中小マイクロサージェリーのはさみで希望の肋骨に平行、皮膚を介して2cmの切開をカット。 Incis下の筋肉と脂肪の層を介して電子。 </li><li>切開部のサイズを最小限に抑えながら、手術領域を露出させるために開創器にすべての3つの層（皮膚、筋肉、脂肪）を配置します。 </li></ol> 3.リブを切除<ol><li> 5.0ミリメートルのメスでリブの所望の部分の上にある肋間筋を切断。リブとして非常に湾曲していない場合に、このようなchondrocostal共同の5 mmの近位の周りのこの切開がある。慎重に先端の細いピンセットで骨から筋肉を分離する。 </li><li>動物に骨膜を保持しながら、切除を作成するために、5.0ミリメートルメスとリブの長さに沿って、骨膜を切断。慎重に先端の細い鉗子で横方向に下にある骨から骨膜を分離する。骨膜は非常にデリケートですし、ゼラチン状の一貫性を持っていたように、注意して進みます。 </li><li>次に細かいマイクロハサミで一方の端部に骨の断面を作る。必要に応じて、との切除を測定顕微鏡や定規タイプのゲージでレチクル。その後、慎重に骨膜から骨を持ち上げ、もう一方の端をカット。 注：慎重に進みます。これは胸膜を引き裂くと気胸になります下の肋骨を切除せずに引き上げなど、ほとんどの繊細なステップ、である。胸膜が破れた場合胸腔の内部が見えるようになるので、これは容易に明らかであろう。 </li><li>出血を止めるために5秒 - 出血が骨の切断の結果として発生した場合、4用綿棒との切断端に圧力をかける。 注：出血が続くことをまれに、それはかなりの血液損失が回復が損なわれるように動物を停止し、安楽死が必要な場合があり（流体を交換することなく、安全に失われることができる最大血液量は、全血液容量の10％であるまたは7.7 - 。）を200μl9 - 8μL/ gの25グラムのマウスの場合、これは約180に相当します。 </li><li>すぐにに削除されたリブを配置今後の分析のために4％PFA。 注：骨と骨膜の両方の切除を行うべきである場合、骨膜切開分離（ ステップ3.2）を省略する。骨膜は非常に緊密胸膜に取り付けられているのでティアリングを回避するために、ピンセットで離れて胸膜から肋骨をからかって、慎重に進んでください。 </li></ol> 4.切開を閉じる<ol><li> 9-0縫合糸（2縫合糸は通常十分です）と残りの骨膜スリーブの上に肋間筋を縫合。手術の場所のための指標として機能するように、直接、リブの切断端の上に縫合糸を配置します。 </li><li>開創器を取り外します。 （ - 4縫合通常は十分である3）9-0縫合糸で覆っている筋肉と脂肪を縫合。筋肉および/ ​​または脂肪の特に厚い層を有するマウスでは、個別の層を縫合（ 例えば、筋肉層の縫合糸の1層および脂肪層のための縫合糸の1層）。 </li><li>閉じ（ - 5縫合糸、通常は十分であり、4）は7-0縫合糸で皮膚。 </li><li>大鉗子で一緒に端をつまんで、縫合糸接着剤で切開を固定します。 </li><li>ゆっくりと最初の数分間、1％に調整することで、オフイソフルランマウスを離乳してからオフにしてください。 </li><li> 10分 - 、5加熱ランプ下にマウスを置き、意識が回復されるまで残す。意識が回復した後、治癒期間中、マウスが移動し、正常に歩き回ると苦痛の兆候を示さないはずである。 </li></ol> 5.回復と分析<ol><li> 0.5ミリグラムの経口ゼラチン状のブプレノルフィンの投与を含む術後疼痛管理を提供/ 48時間ごとに12時間をキロ。経口投与は、胸部に痛みを引き起こす可能性が動物を拘束する必要はありません。 </li><li>治癒期間中に食物と水を自由にケージにマウスを維持します。切開が乾燥した後、雌の動物は、雄ながら同時収容することができるsは戦いを防ぐために分離したままにします。 </li><li>治癒期間の後、安楽死のために承認された手順に従ってください。固定および分析のために胸郭を削除します。 </li></ol>

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</ol>

著者は開示するものは何もありません

最初のこのプロトコルを学習するとき、どこに挑戦することができます最初の切開を見つけるには、決定する。しかし、安楽死させたマウスでの練習は、外科医が最初の切開を置き、切​​除されるべき所望のリブを公開する場所を学​​ぶことができます。死体に作業することも骨膜の有無にかかわらずリブ部分を除去するために必要な細かい運動能力を向上させます。また、この手順に新しい誰かが困難に細かいツールと薄い縫合糸を操作するかもしれません。オフ抱き合わせながら、余分な縫合糸を引っ張ると組織を引き裂くことができる。このように、死体にもいくつかの練習の縫合は有用である可能性があります。外科医はげっ歯類での外科的処置に新規の場合最後に、もう一人は、最初の数の手術中に麻酔を監視し、調整を支援持っていると便利な場合があります。 このプロトコルの最も重要なステップは、胸膜スパで気胸（空気の異常なコレクションを誘発することなく、骨を切除されている胸膜は、外科的に閉じることが薄すぎるので、マウスで治療が困難であるのce）。リブに劣る筋肉と壁側胸膜の層が非常に薄く、デリケートです。従って、正確な動きは、切除領域の下にある胸膜...

骨格傷害、慢性変形性関節症を衰弱させる、と再建手術に関連した重大な問題は、経済生産性、家族の幸福、そして生活の質に影響を与える。小休憩と病変がかなりよく癒すことができますが、人間は大きな欠陥を修復することができないため、構造と機能を回復するために再建手続きに頼らなければならない。復興は、同種またはheterogeneic移植片、morcellized骨、移植された足場、または伸延骨形成を伴ってもよい。残念ながら、だけでなく、これらの治療法はなく、修復骨の本来の強さはほとんど達成されていないに関連した永続的な罹患率の要因があります。このため、新たな臨床アプローチが必要とされている。 分節欠損を治療するための革新的な方法を開発する一方向は、大規模な修復が天然に存在する状況を研究することである。哺乳類が目に限定されると考えている間に両生類は有名、骨格要素を再生成することができます能力である。しかし、20 世紀の初頭以来、人間のリブにおける再生の報告はほとんど人間が1-4そのように限定されないかもしれないことを示唆して発表されている。現在、この現象は、最高の顎、顔、耳再構成のために隔壁材料を使用する外科医に知られているが、それは、より広く5が認識されない。より詳細には、この修復を研究するために、我々は、マウスを使用して、外科的モデルを開発した。このプロトコルを使用して、研究者は、関連する生来の因子を特定し、他の場所で骨治癒を促進するためにこの情報を使用することができる。 骨修復を研究するためのモデルとしてのリブを使用することには多くの利点がある。 （大腿骨6,7の切除と比較して）まず、周囲のリブは自然な固定器を提供する。これは、内部​​と外部固定の罹患リスクを減少させ、手術手順を簡素化します。胸のWAの第二に、薄い筋肉層LL頭蓋冠切除8の利便性の検定に匹敵する簡単なアクセスと優れた視認性を提供する。第三に、膜内骨化によってその形、軟骨内骨化によってリブ形と中央骨幹のいずれかの端部に位置する成長板に拡張を介して長さに成長する頭蓋冠とは対照的である。そのため、リブの修理は、四肢骨格の長骨の修理により匹敵し得る。さらに、我々は、大腿骨と比べて、リブの骨膜が厚く、より簡単に操作することができることを見出した。このように、骨膜を研究または細胞治療、薬理学的薬剤、および/または組織足場をテストする目的で、骨修復を検定したい研究者らは、この外科的モデルが役に立つでしょう。要約すると、このリブ切除モデルは、一般的に使用されるそのようなモデルは、現在存在しないように、哺乳動物において天然の大規模骨修復を研究するためにその中にコンテキストを提供する。

<table><tbody><tr><td>中型マイクロ解剖ハサミ(Vannas-T&uuml;ビンゲンスプリングはさみ5ミリメートル)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>ファインマイクロ解剖はさみ(バンナススプリングはさみ - 2ミリメートルの刃先)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15000-04</td><td>湾曲した先端は有益です</td></tr>マイクロ<tr><td>メス5.0ミリメートル</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>10315-12</td><td>他の細かいメスは、</td></tr><tr><td>デュモン55鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>に置き換えることができますリトラクター&nbsp;</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>17004-05</td><td>の調整性は便利です</td></tr><tr><td>マイクロニードルホルダー</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>12060-01</td><td></td></tr><tr><td>9.0ナイロン縫合糸(エチロン)、テーパーポイント最高</td>エ<td>チコン</td><td>2819Gまたは同様の</td><td>テーパーポイント最高ですが、逆切断も良好です</td></tr><tr><td>7.0プロレン縫合糸(プロレン)</td><td>エチコン</td><td>8700Hまたは同様の</td><td>6-0も使用でき、針先は異なる場合があります</td></tr><tr><td>大型鉗子(アドソン鉗子)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11006-12</td><td>他のブランドは、細かい</td></tr><tr><td>潤滑剤、目の軟膏(アクワの涙)、</td><td>アコーン</td><td>17478-062-35</td><td></td></tr><tr><td>縫合糸の接着剤(GLUture局所組織接着剤)、</td><td>アボット</td><td>32046-01</td><td>は、優れた作業時間</td></tr>シェー<tr><td>バー</td><td>ウォール</td><td>9918-6171または同様の</td><td></td></tr><tr><td>クランプランプ</td><td>動物園メッド</td><td>LF-5</td><td>を持っています</td></tr><tr><td>赤外線電球、75W</td><td>Zoo Med</td><td>RS-75</td><td></td></tr><tr><td>RC2げっ歯類麻酔システム</td><td>VetEquip&nbsp;</td><td>922100</td><td></td></tr><tr><td>IsoFlo (イソフルラン)</td><td>Abbot</td><td>05260-05</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine (Buprenex)</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>12496-0757-1</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue Frederick 67618015017</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flavored Gelatin, raspberry</td><td>Jell-O</td><td>B000E1FYL0</td><td>made up firm, to the consistency of 'jigglers'</td></tr></tbody></table>

マウスリブを切除するための外科的手順：大規模ロング骨修復のためのモデル

A Surgical Procedure for Resecting the Mouse Rib: A Model for Large-Scale Long Bone Repair

このプロトコルは、マウスのリブを利用した大規模な骨修復のための新しいモデルに研究者を紹介しています。 、周囲の肋間筋から目的の肋骨を露出させ、胸部体壁を開いて気胸を誘発することなく、リブの所望の部分を切除し、切開部を閉じる、手術のための動物の準備：手順は、以下の詳細を示します。四肢骨格の骨と比較すると、リブは非常にアクセス可能です。また、全く内部または外部固定器は、隣接するリブは自然な固定を提供するので必要ありません。手術は、市販品を使用して、学ぶことは簡単であり、そして動物によって十分に許容さ。手順は、または周囲の骨膜を除去することなく行うことができるので、修理の骨膜の寄与を評価することができる。 2ヶ月 - 結果は、骨膜が保持されている場合、強固な修復が1で発生したことを示している。私たちは、このプロトコルの使用が期待リブの補修に及び所見は体の周りの他の場所で骨修復を刺激するための新しい方法の開発を容易にするような研究を刺激する。

動物は、一般的に切開がうまく癒す、このプロシージャからすぐに回復し、動物は正常な挙動を示す。手順は、市販品を使用して練習した後、1時間の下で完了させることができる。実験データを生成するために、この手順を使用する前に、任意の大きい骨片を切除ゾーン内に残っているかどうかを判断するために、0日目の時点で切除を分析することが重要である。これは、典型的には、特別な放射線安全承認を必要とするであろうが、適切な手順を評価する一つの方法は、術後X線またはマイクロCT画像化によって動物を評価することである。代わりに、別の単純な評価は、 図1Aに示されるように、骨格染色の準備を行うことによって完了することができる。これは標準的なプロトコル11を使用して、アリザリンレッドで、胸郭を収集EtOHにそれを固定し、染色が含まれます。これは、股関節のように（軟組織を離れて消化するために使用される）、水酸化カリウムを省略することが有用であり得る所望であれば、サンプルトンまだ組織学的分析のために後で使用することができる。重なる体壁筋層が薄いため、試料は、依然として80％グリセロール中にクリアすることにより水酸化カリ...

この手順の全体的な目標は、マウスの肋骨から骨の一部を成功裏に切除することです。この手技は、大規模な長骨修復を研究するためのモデルとして開発されました。

This protocol introduces researchers to a new model for large-scale bone repair utilizing the mouse rib. The procedure details the following: preparation ...

この手順の目的は、骨格修復のモデルとして、肋骨の骨部分に大規模な切除部位を作製することです。まず、動物の側面の皮膚を切開し、開口部を作製します。次に、切除対象となる肋骨を露出させます。次に、周囲の結合組織鞘または骨膜と共に、あるいは骨膜を残した状態で、肋骨の一部を切除します。最後のステップとして、切開部を縫合し、動物を回復させます。最終的に、この骨修復モデルを用いて、大規模な骨格修復中に起こる細胞および分子レベルの現象を示すことができます。哺乳類において、この手法の視覚的なデモンストレーションは極めて重要です。手術器具の操作には精密さが求められ、手術を成功させるには異なる組織がどこに位置しているかを把握する必要があるためです。手順のデモンストレーションを行うのは、私の研究室の大学院生であるMarissa RoarとNikita Tripperです。手術部位および必要な滅菌器具と備品を準備した後、マウスを4%イソフルランが入った導入チャンバーに入れ、麻酔を導入します。マウスを麻酔した後、眼に軟膏を塗布し、麻酔深度を確認します。足指をピンチすることで、足指への刺激に対して反応がないことを確認してください。マウスを解剖顕微鏡のステージ上のヒートパッドの上またはその隣に置き、麻酔維持用ホースのノーズコーンをマウスの鼻に当てます。マウスが側臥位であることを確認します。維持のためのイソフルラン濃度を2～3%に調整し、呼吸数を観察します。その後、25ゲージの針を用いてブプレノルフィンを皮下注射します。術後の先行的な疼痛により脚が痙攣することがありますが、これは正常な反応です。まず、最も吻側の肋骨を1番として数え、触診によって目的の肋骨を選択します。このビデオでは、第10肋骨の一部を切除します。肋骨上の領域を剃毛し、ポビドンヨードで洗浄した後、イソプロパノールで3回洗浄します。切除する肋骨の上方の皮膚、筋肉、および脂肪層に2 cmの切開を加えた後、切開創のサイズを最小限に抑えつつ術野を露出させるため、これら3つの層をリトラクターで固定します。次に、5 mmのメスを使用し、肋骨がそれほど強く湾曲していない、胸肋関節から近位に5 mmの位置で肋骨上の肋間筋を切開します。その後、微細チップ鉗子を用いて、筋肉を骨から慎重に剥離します。次に、動物の骨膜を保持したまま切除を行うため、肋骨の長さに沿って骨膜を切開します。その後、先端の細いピンセットを使用して、骨の下にある繊細な骨膜を外側に向かって非常に慎重に剥離します。必要に応じて、顕微鏡下の定規または定規型のゲージを用いて切除範囲を測定してください。次に、精細なマイクロ剪刀を用いて骨の横断面を作成します。片端で骨を骨膜から慎重に持ち上げ、もう一方の端を直ちに切断します。摘出した肋骨を、後の解析のために4%パラアルデヒドに浸します。骨の切断により出血が生じた場合は、綿棒で切断端を4〜5秒間圧迫して止血します。切開部を閉じるため、残った骨膜スリーブの上に肋間筋を3〜4本の9-0非連続縫合で縫合します。手術部位の指標となるよう、肋骨の切断端の直上に縫合糸を配置してください。リトラクターを取り外し、その上の筋肉と脂肪を9-0の不連続縫合で縫合します。特に筋肉や脂肪の層が厚いマウスの場合は、各層を個別に縫合してください。皮膚を4〜5本の7-0縫合糸で閉鎖し、最後に組織用接着剤で切開部を固定します。大型鉗子で端を合わせてつまみます。イソフルランの濃度を1%に調整して数分間かけて徐々に低減させ、その後、イソフルランを停止します。マウスを保温ランプの下に置き、意識が回復するまで待ちます。意識が回復した後、および治癒期間中、マウスが正常に移動・歩行し、苦痛の兆候を示さないことを確認してください。切開部位が乾燥したら、餌と水が自由に利用できる清潔なケージにマウスを収容します。雌は同居させることができますが、雄は喧嘩を防ぐため単独飼育としてください。また、術後の疼痛管理として、Buprenorphineの経口ジェンフォーム剤を0.5 mg/kg、12時間ごとに48時間投与してください。経口投与では動物を拘束する必要がないため、胸部領域に痛みを与える可能性を回避できます。この画像は、手術直後に採取された4.5 millimeterの肋骨切除片を示しています。骨片は一切残っていません。サンプルをザリンレッドで染色し、80% glycerolで透明化した。矢印は切断端の位置を示している。これは前図の肋骨郭から取り出した肋骨部分であり、骨膜は除去されている。ここに示すヘマトキシリン・エオシン染色を施した組織切片は、左側の黄色い矢印で示されるように、骨に付着している骨膜が最小限であること、および右側には骨膜が存在しないことを示しています。黄色いアスタリスクは骨髄腔を示しています。この画像は、骨膜が付着したままの摘出された肋骨の一部であり、この組織切片では、黄色いブラケットで示されるように、骨を覆う無傷の骨膜が確認できます。黄色いアスタリスクは、再び骨髄腔を示しています。この画像は、骨膜を温存した状態で切除を行い、2ヶ月間の治癒期間を経た後の骨格標本であり、当該領域の完全な修復が観察されます。先ほど示した骨格標本のこの組織切片では、層板骨壁と骨髄腔の再生が確認できます。この画像は、3ヶ月間の治癒期間後の骨格標本を示しています。肋骨の一部と周囲の骨膜を除去したところ、パネル左側に示されている切断端での修復は最小限にとどまっていました。黄色の矢印はchocos関節を指しています。先に示した骨格標本のこの組織切片では、切除部位に肉芽組織、脂肪組織、および筋細胞が充填していることがわかります。この手法に習熟し、本手順に従って適切に実施すれば、1時間以内に完了させることができます。肋骨の軟骨部分に切除を行うなど、他の方法を用いることで、「軟骨の大規模な修復はどのように起こるのか」といった追加の疑問に答えることが可能です。このビデオを視聴することで、骨格修復の研究を行うために、肋骨の骨部分に切除部位を作成する方法について十分に理解できるはずです。

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Research

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Medicine

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