マウスリブを切除するための外科的手順：大規模ロング骨修復のためのモデル

この手順の目的は、骨格修復のモデルとして、肋骨の骨部分に大規模な切除部位を作製することです。まず、動物の側面の皮膚を切開し、開口部を作製します。次に、切除対象となる肋骨を露出させます。

次に、周囲の結合組織鞘または骨膜と共に、あるいは骨膜を残した状態で、肋骨の一部を切除します。最後のステップとして、切開部を縫合し、動物を回復させます。最終的に、この骨修復モデルを用いて、大規模な骨格修復中に起こる細胞および分子レベルの現象を示すことができます。

哺乳類において、この手法の視覚的なデモンストレーションは極めて重要です。手術器具の操作には精密さが求められ、手術を成功させるには異なる組織がどこに位置しているかを把握する必要があるためです。手順のデモンストレーションを行うのは、私の研究室の大学院生であるMarissa RoarとNikita Tripperです。手術部位および必要な滅菌器具と備品を準備した後、マウスを4%イソフルランが入った導入チャンバーに入れ、麻酔を導入します。

マウスを麻酔した後、眼に軟膏を塗布し、麻酔深度を確認します。足指をピンチすることで、足指への刺激に対して反応がないことを確認してください。マウスを解剖顕微鏡のステージ上のヒートパッドの上またはその隣に置き、麻酔維持用ホースのノーズコーンをマウスの鼻に当てます。

マウスが側臥位であることを確認します。維持のためのイソフルラン濃度を2～3%に調整し、呼吸数を観察します。その後、25ゲージの針を用いてブプレノルフィンを皮下注射します。

術後の先行的な疼痛により脚が痙攣することがありますが、これは正常な反応です。まず、最も吻側の肋骨を1番として数え、触診によって目的の肋骨を選択します。このビデオでは、第10肋骨の一部を切除します。

肋骨上の領域を剃毛し、ポビドンヨードで洗浄した後、イソプロパノールで3回洗浄します。切除する肋骨の上方の皮膚、筋肉、および脂肪層に2 cmの切開を加えた後、切開創のサイズを最小限に抑えつつ術野を露出させるため、これら3つの層をリトラクターで固定します。次に、5 mmのメスを使用し、肋骨がそれほど強く湾曲していない、胸肋関節から近位に5 mmの位置で肋骨上の肋間筋を切開します。その後、微細チップ鉗子を用いて、筋肉を骨から慎重に剥離します。

次に、動物の骨膜を保持したまま切除を行うため、肋骨の長さに沿って骨膜を切開します。その後、先端の細いピンセットを使用して、骨の下にある繊細な骨膜を外側に向かって非常に慎重に剥離します。必要に応じて、顕微鏡下の定規または定規型のゲージを用いて切除範囲を測定してください。

次に、精細なマイクロ剪刀を用いて骨の横断面を作成します。片端で骨を骨膜から慎重に持ち上げ、もう一方の端を直ちに切断します。摘出した肋骨を、後の解析のために4%パラアルデヒドに浸します。

骨の切断により出血が生じた場合は、綿棒で切断端を4〜5秒間圧迫して止血します。切開部を閉じるため、残った骨膜スリーブの上に肋間筋を3〜4本の9-0非連続縫合で縫合します。手術部位の指標となるよう、肋骨の切断端の直上に縫合糸を配置してください。

リトラクターを取り外し、その上の筋肉と脂肪を9-0の不連続縫合で縫合します。特に筋肉や脂肪の層が厚いマウスの場合は、各層を個別に縫合してください。皮膚を4〜5本の7-0縫合糸で閉鎖し、最後に組織用接着剤で切開部を固定します。

大型鉗子で端を合わせてつまみます。イソフルランの濃度を1%に調整して数分間かけて徐々に低減させ、その後、イソフルランを停止します。マウスを保温ランプの下に置き、意識が回復するまで待ちます。

意識が回復した後、および治癒期間中、マウスが正常に移動・歩行し、苦痛の兆候を示さないことを確認してください。切開部位が乾燥したら、餌と水が自由に利用できる清潔なケージにマウスを収容します。雌は同居させることができますが、雄は喧嘩を防ぐため単独飼育としてください。また、術後の疼痛管理として、Buprenorphineの経口ジェンフォーム剤を0.5 mg/kg、12時間ごとに48時間投与してください。

経口投与では動物を拘束する必要がないため、胸部領域に痛みを与える可能性を回避できます。この画像は、手術直後に採取された4.5 millimeterの肋骨切除片を示しています。骨片は一切残っていません。

サンプルをザリンレッドで染色し、80% glycerolで透明化した。矢印は切断端の位置を示している。これは前図の肋骨郭から取り出した肋骨部分であり、骨膜は除去されている。

ここに示すヘマトキシリン・エオシン染色を施した組織切片は、左側の黄色い矢印で示されるように、骨に付着している骨膜が最小限であること、および右側には骨膜が存在しないことを示しています。黄色いアスタリスクは骨髄腔を示しています。この画像は、骨膜が付着したままの摘出された肋骨の一部であり、この組織切片では、黄色いブラケットで示されるように、骨を覆う無傷の骨膜が確認できます。

黄色いアスタリスクは、再び骨髄腔を示しています。この画像は、骨膜を温存した状態で切除を行い、2ヶ月間の治癒期間を経た後の骨格標本であり、当該領域の完全な修復が観察されます。先ほど示した骨格標本のこの組織切片では、層板骨壁と骨髄腔の再生が確認できます。

この画像は、3ヶ月間の治癒期間後の骨格標本を示しています。肋骨の一部と周囲の骨膜を除去したところ、パネル左側に示されている切断端での修復は最小限にとどまっていました。黄色の矢印はchocos関節を指しています。

先に示した骨格標本のこの組織切片では、切除部位に肉芽組織、脂肪組織、および筋細胞が充填していることがわかります。この手法に習熟し、本手順に従って適切に実施すれば、1時間以内に完了させることができます。肋骨の軟骨部分に切除を行うなど、他の方法を用いることで、「軟骨の大規模な修復はどのように起こるのか」といった追加の疑問に答えることが可能です。

このビデオを視聴することで、骨格修復の研究を行うために、肋骨の骨部分に切除部位を作成する方法について十分に理解できるはずです。