Name: 遺伝的に改変された細胞移植のためのマイクロパターン培養プレート上スフェロイド細胞に対する遺伝子導入 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 学ぶマイクロパターン培養プレート上スフェロイド細胞への遺伝子導入法。ラット肝細胞またはMSCを用いて3Dスフェロイドを形成し、ポリプレックスナノミセルで遺伝子導入を行い、移植後の長期遺伝子発現と細胞機能維持を実現する細胞移植システムです。

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私たちは深く感熱マイクロパターン培養プレートと同様に科学的助言を提供するための東洋合成工業、東京、日本の博士武池谷と技術スタッフに感謝します。また、動物実験での技術支援のためにさんさとみ小倉さん沙鈴木さんあすか三好さんとかつえ森井に感謝します。この作品は、財政的に日本学術振興会科研費科学研究費補助金によって部分的にサポートされていた、イノベーション（COI）プログラムのセンターと独立行政法人科学技術振興機構（JST）からのS-イノベーションプログラム、およびJSPSコア - のコアプログラム、A.先端研究ネットワーク。

すべての動物実験は、東京大学の動物実験委員会、東京、日本の承認を得て実施しました。 1.細胞の調製<ol><li>初代肝細胞の場合は、変更された二段階コラゲナーゼ消化プロセス13,14によってラットから肝細胞を単離するためのプロトコルに従ってください。 <ol><li>イソフルラン吸入麻酔下でのスプラーグドーリー（SD）ラット（雄、5週齢）を麻酔。チャンバーのためにイソフルランを提供するために、麻酔装置に接続されたチャンバ内にラットを置きます。眠りに落ちる後のラットを取り出し、マスクを使用して換気を手術台の上に置きます。ラットの条件をチェックすることにより、0.7リットル/分 - イソフルランが0.4で約フロー制御。 8グラム/ L塩化ナトリウムからなる特殊な溶液（NaCl）で、400 mg / Lの塩化カリウム（KCl）、78ミリグラムで肝門脈のスプラーグドーリー（SD）ラット（雄性、5週齢）の肝臓を灌流/ Lリン酸二水素ナトリウム二水和物（のNaH 2 PO 4·2H 2 O）、151 mg / Lのリン酸水素二ナトリウム十二し（Na 2 HPO 4·12H 2 O）、2.38グラム/ Lの2- [4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸（HEPES）、190 mg / Lのエチレングリコール四酢酸（EGTA）、350 mg / Lの炭酸水素ナトリウム（NaHCO 3）、および900 mg / Lのグルコース。 </li><li>肝臓を通してコラゲナーゼ溶液を循環させます。 注：溶液を、500 mg / Lのコラゲナーゼで構成されている、9.8グラム/ Lハンクス緩衝塩2.38グラム/ mlのHEPES、556 mg / mlの塩化カルシウム水和物（のCaCl 2·H 2 O）、350ミリグラム/ LのNaHCO 3、そしてpHが50 mg / Lのトリプシン阻害剤は、7.2に調整しました。 </li><li>慎重に肝臓を取り出し、手術用メスの刃を使用して皿に静かにミンチ、追加ダルベッコ改変イーグル培地、10％ウシ胎児血清（FBS）を補充した（DMEM）、および100ミクロンを介して細胞懸濁液をフィルタリングナイロンメッシュ。追加の破片を除去するために、1分間20×gで細胞懸濁液を遠心してください。このステップでは、肝細胞は、上清中にあります。 </li><li>二回（3遠心分離の合計）遠心分離工程を繰り返します。最後に、遠心3分間50×gで肝細胞をペレットの形でそれらを回収します。 </li><li> 10％FBSを補充したDMEMから成る特殊な培養培地中に4×10 5細胞/ mlの濃度、1％ペニシリン-ストレプトマイシン-供給過剰（PSQ）、1％ジメチルスルホキシドに肝細胞を再懸濁（DMSO）、0.1モル/ Lのデキサメタゾン、0.5 / mlのインスリン、10ミリモル/ Lのニコチンアミド、0.2ミリモル/ Lのリン酸化アスコルビン酸（ASC-2P）、および10 ngの/ mlのヒト上皮増殖因子（hEGF）15。この特別な培地は、 インビトロ条件下で肝機能を維持するために必須です。 </li></ol></li><li>ラットMSCを得るためには、isoflurの過剰投与によりスプラーグドーリー（SD）ラット（雄、5週齢）を安楽死させますANE。大腿骨と脛骨を切除し、DMEM 10mlでそれをフラッシュするために、骨の軸に22 G針を挿入することによって、骨髄を収集し、10％FBSを補充しました。 100μmのナイロンメッシュを通して濾過することにより細胞を収集します。 </li><li> 10％FBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEMを用いて10cmの培養皿に細胞をシード。回転楕円体の実験のために、5通路内でMSCを使用します。 </li></ol> 3Dスフェロイドの作製<ol><li>市販の細胞接着性領域は規則的にPEGマトリックスによりコーティング非接着性領域によって囲まれ、二次元的に直径100μmで配列されたマイクロパターン培養プレートを得ます。 注：細胞移植のために、感熱性ポリマーPIPAAmと追加のコーティングは、プレートを冷却することにより、細胞剥離を可能にするために必要である（ステップ5.1参照）。温度変動は、このポリマーの化学的性質の変化を誘導することができます8-10。 37℃では、PIPAAmは、細胞が正常な条件下で培養することができるように、わずかに疎水性です。 32℃以下の温度の低下は、細胞の自発的な離脱につながる、ポリマーの急速な水和になります。 </li><li>ウェル5％CO 2を含む加湿雰囲気中で37℃でそれらをandincubate / 4×10 5細胞の密度で12ウェルマイクロパターンプレート上の肝細胞やMSCをシード。細胞は、マイクロパターンの接着領域に蓄積され、徐々に2日間で丸スフェロイドを形成することになります。 注：単層培養で対照細胞を調製するために、通常の12ウェルプレートを使用し、上記と同様の手順に従って、同一の密度で細胞を播種。 </li></ol>ポリプレックスナノミセルの調製<ol><li>ブロック共重合体を合成し、PEG-PASP（DET）（ポリ[N &#39; - [N - （2-アミノエチル）-2-アミノエチル]アスパルトアミド]）（PEG Mwは12、000、重合度PASP（DET）のセグメント（DP）= 59）、および以前に著者ら11によって記載された手順に従って、唯一のカチオン性セグメント[PASP（DET）（DP = 55）から構成されているホモポリマー、 16、17。 </li><li> 33.3μgのにポリマーの濃度を調整することにより、10mMのHEPES緩衝液（pH 7.3）中の残留アミノ基の等モル比でPEG-PASP（DET）ブロック共重合体の混合溶液とPASP（DET）ホモポリマーを準備/ mlおよびそれぞれ19.1μgの/ mlで、。 注：上述のポリマー濃度変化させることができる10 N / P比のpDNA（N / P比）中のリン酸基への2つのポリマーの全アミノ基の残存モル比でナノミセルを調製するための代表的な値であります細胞のタイプと目的に応じて（詳細については、議論を参照）。 2つのポリマーの併用は、エンドソームを高めるために効果的なPEGシールドとPASP（DET）の機能の両方を達成することができますエスケープ18（詳細については、説明を参照）。 </li><li> pCAG-GSプラスミドにそれぞれの遺伝子を発現するセグメントをクローニングすることによりpDNAをコードするガウシアルシフェラーゼ、GL4ルシフェラーゼ、またはエリスロポエチンの準備（http://www.cdb.riken.jp/pcs/protocol/vector/map/m36.html ）を製造者のプロトコールに従って市販のキットを用いてCAGプロモーター /エンハンサー下式を得ます。コンピテント大腸菌株でのpDNAを増幅し、エンドトキシンフリーのプラスミドDNA精製システムを使用して精製します。 10mMのHEPES緩衝液（pH 7.3）で150 / mlの溶液を得た260 nmでの吸光度でのpDNAの濃度を決定します。 </li><li> （体積比）1：ポリプレックスナノミセルを調製するために、十分のpDNA溶液（10mMのHEPES緩衝液中の150μgの/ mlで）および2の比率で2つのポリマーのプレミックス溶液を混合します。 </li></ol>スフェロイドに4遺伝子のトランスフェクション<ol><li>細胞（肝細胞をインキュベート成熟したスフェロイドの形成を可能にするためにマイクロパターンプレート上に播種後72時間、またはMSCS）。遺伝子トランスフェクションのために、新鮮な培地1 mlの培養液を交換した後、各ウェルに（pDNAを10μgのを含む）ポリプレックスナノミセル溶液100μlを添加します。 24時間ナノミセル溶液でインキュベーションを続けます。 </li><li>脂質ベースのトランスフェクション試薬を使用して制御するために、3の重量比試薬/のpDNAで試薬とのpDNA溶液を混合脂質ベースの試薬とナノミセル法の両方のために等しくなるようにpDNAの最終用量を調整します。 </li></ol>スフェロイドの5回復と移植<ol><li>チルド200μlのPBSと培地を交換し、氷上にプレートを配置します。 注意：一般的に、スフェロイドは、約15分で取り外すことができ、移植のための懸濁液の形態で回収することができます。 </li><li>ゆっくり200μlの細胞を吸引in vivoでの注射用23 Gまたは27 G針で注射器を使用してサスペンション。 </li></ol>導入遺伝子発現の6評価<ol><li>正確に24時間新鮮な培地と交換した後、培地100μL -培養液中に分泌型ガウシアルシフェラーゼの発現の in vitroでの評価のために、50を収集します。商業ウミシイタケルシフェラーゼアッセイシステムと製造業者のプロトコルに従って、ルミノメーターを用いてルシフェラーゼ発現を推定します。 注：ガウシアルシフェラーゼは、1週間以上培養培地中で安定なままです。このように、導入遺伝子発現のリアルタイムの効率を評価するためのサンプル媒体を収集する前に、新鮮なものを含む培地を交換してください。培地交換のタイミングは柔軟であることができます。 </li><li>細胞移植後の宿主動物における導入遺伝子発現の in vivo評価のために、BALB / cヌードマウス（雌を麻酔; 7週間イソフルラン吸入麻酔下に古いです）。 <ol><li>チャンバーのためにイソフルランを提供するために、麻酔装置に接続されたチャンバ内にマウスを置きます。眠りに落ちる後にマウスを取り出し、マスクを使用して換気を手術台の上に置きます。マウスの状態をチェックすることによって、0.5リットル/分 - イソフルランは0.2で約フロー制御。 </li><li>腹部の皮下組織に（4.1で説明したように）GL4ルシフェラーゼ発現のpDNAをトランスフェクトしたスフェロイドを含む200μlの細胞懸濁液を注入します。 </li><li> （150ミリグラム/ kgで、静脈内経路）直後D-ルシフェリンを注入した後、製造業者のプロトコルに従ってIVISイメージングシステムを使用して、ルシフェラーゼ発現を測定します。 </li></ol></li><li>細胞移植の治療効果を評価するために、中にエリスロポエチンをコードするpDNAを用いてトランスフェクトされたスフェロイドを含む200μlの細胞懸濁液を注入腹部の皮下組織。 <ol><li>血液19の約200μLを得るために、顎下出血によって血液サンプルを収集します。血液サンプル分析装置を用いてヘモグロビンおよびヘマトクリット値を測定します。 注：移植のための細胞数をプレート上に播種した数によって調節されます。スフェロイド内の数字は測定できないので、残念ながら、それは、正確な細胞数を決定することは困難です。 </li></ol></li><li>実験の後、麻酔から覚醒するまで、温度コントローラーに接続された加熱パッドの上にマウスを置きます。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

このプロトコルでは、遺伝子導入及びスフェロイド回収工程中のスフェロイドの3次元構造を維持することが重要です。細胞が細胞死または細胞活性の損失を回避することが有利な微小環境を維持するために不可欠です。従来の単層培養中の肝細胞が急速に数日12を播種した後、それらの分泌能力を失いつつ例えば、アルブミン分泌、肝細胞の代表的な先天性機能は、よく、肝細胞スフェロイドに保存されます。 for MSCSは、スフェロイドが大幅脂肪生成および骨形成に関与する遺伝子の発現レベルの増加と、脂肪細胞または骨芽細胞への分化のその効率を向上させ、ダウンレギュレーション遺伝子のMSC自己再生表現型4を維持します。 遺伝子導入のために、様々なトランスフェクション試薬は、脂質ベースのもの（ 図3、4）を含む、以前に試験されました例えば、ポリエチレンイミンなどのポリマーベースのもの、。残念ながら、試薬のいずれも、回転楕円体の構造を破壊することなく、成功した遺伝子導入を提供しませんでした。導入遺伝子の発現があってもマイクロパターンプレート上の残...

細胞移植療法は、様々な難治性疾患を治療するために広く注目を集めています。移植された細胞によって分泌される生物活性因子の活性及び半減期は、細胞移植システムの改良された治療効果のために不可欠です。移植前の細胞の遺伝子改変は、生物活性因子の分泌などの細胞機能を調節して操作するための有益な技術です。これは、細胞死または細胞活性の喪失を回避するための細胞のための良好な微環境を維持することも重要です。細胞間相互作用が十分に保持された3次元（3D）スフェロイド細胞培養物は、（初代肝細胞のアルブミン分泌を改善し、間葉系幹細胞の多系列分化を促進するために、例えば、この目的のためにMSCを約束しています）1-7。 spheroiのこの研究では、新規な組み合わせシステムD培養および遺伝子トランスフェクションは、遺伝的に改変された細胞移植のためのプラットフォームとして機能するように使用されます。スフェロイド細胞を作成するための、マイクロパターン培養プレート上でスフェロイド培養系を用いています。これらのプレート上で、100ミクロン直径の細胞接着領域が規則的に二次元的に配列され、PEGマトリックス3によって被覆された非接着性領域によって囲まれています。細胞の十分な数を播種することにより、直径100μmの3Dスフェロイドのアレイは、マイクロパターン培養ベッドに対応して形成されています。 スフェロイドは、感熱性細胞培養プレートを使用して、3D構造を破壊せずに回収される感熱性ポリマー、ポリ（イソ-プロピル）（PIPAAm）8-10でコーティングしたもの。マイクロパターンアーキテクチャは、感熱板（カスタムビルド）上に構築されています。単にプレートの温度を下げることにより、スフェロイド培養ベッドから離脱して分散されていますリン酸中のdは、緩衝生理食塩水（PBS）。従って、100μmの均一なサイズを有する球状の多数の注射懸濁液の形態で得ることができます。 <img alt="図1" p="" src="/files/ftp_upload/52384/52384fig1.jpg" /> 図1マイクロパターンプレート上でスフェロイド培養システムの概略図。遺伝的改変は、元の非ウイルス遺伝子キャリア、ポリプレックスナノミセルを用いた遺伝子導入によって達成されます。これは、プラスミドDNA（pDNAを）およびポリエチレングリコール（PEG）-polycationブロック共重合体11で構成されています。これらは、治療目的のために11細胞への安全かつ効果的な遺伝子導入を可能にする、PEGシェルと凝縮pDNAの内部コアからなる特徴的なコア-シェル構造を有している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52384/52384fig1large.jpg" target="_blank">THIの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください</a>のフィギュア。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52384/52384fig2.jpg" /> 核酸およびPEG-ブロック-ポリカチオンブロック共重合体の複合体によって形成された。本研究ではポリプレックスナノミセルの図2の構造は 、この技術の主な利点は、回転楕円体の構造はナノミセルによる遺伝子トランスフェクションの際に破壊されないことです。ラット初代肝細胞スフェロイドのナノミセル媒介性トランスフェクションの後、長期の導入遺伝子の発現は、トランスフェクトしていないスフェロイド12のそれに匹敵するレベルで肝細胞からの連続アルブミン分泌と1ヶ月以上得られます。スフェロイドからの導入遺伝子発現およびアルブミン分泌も感熱プレートからの回復後も維持されています。これは、ナノミセル安全HEPの生来の機能を損なうことなく、遺伝子導入を容易にすることができることは明らかですatocytes。このように、ナノミセルを用いた遺伝子導入と感熱マイクロパターンプレート上で培養したスフェロイド細胞の組み合わせは、遺伝的に改変された細胞の移植のための有望なプラットフォームです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52384/52384fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>Pen-Strep-Glut</td><td>GIBCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td>和<td>光純薬工業</td><td>041-18861</td><td></td></tr>ニコ<tr><td>チンアミド</td><td>和光純薬工業</td><td>141-01202</td><td></td></tr><tr><td>ハンク緩衝塩・L-アスコルビン酸 2-リン酸 (Asc-2P)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>ヒト上皮成長因子 (hEGF)</td><td>東洋紡PT10015</td><td></td><td></td></tr><tr><td>セル型マルチウェルプレート</td><td>東洋合成</td><td>PP-12</td><td></td></tr><tr><td>感熱性細胞培養プレート (Upcell)</td><td>CellSeed Inc</td><td></td><td>.マイクロパターン化されたアーキテクチャは、感熱プレート(東洋合成によるカスタムビルド)上に構築されています脂質</td></tr><tr><td>ベースのトランスフェクション試薬(FuGENE HD)</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Renilla Luciferase Assay System</td><td>Promega</td><td>E2810</td><td></td></tr><tr><td>pGL4 Luciferase Reporter Vector</td><td></td><td></td> Gaussia <td></td></tr><tr><td>luciferase</td><td>New England BioLabs</td><td>N8082S</td><td></td></tr><tr><td>マウスエルトロポエチン発現ベクター</td><td>Origene</td><td>MC208445</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-GS</td><td></td><td></td><td>提供:発生生物学研究センター多能性細胞研究室 理研</td></tr><<tr><td>em>Escherichia coli DH5&alpha; コンピテントセル</td><td>宝</td><td>9057</td><td></td></tr><tr><td>エンドトキシンフリープラスミドDNA精製システム</td><td>日本ジェネティクス</td><td>NucleoBond Xtra EF</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ</td><td>和光 純薬工業</td><td>639-00951</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン阻害剤</td><td>GIBCO</td><td>R-007-100</td><td></td></tr><tr><td>ルミノメーター</td><td>プロメガ</td><td>GloMax&trade; 96 マイクロプレート ルミノメーター</td><td></td></tr><tr><td>IVIS イメージングシステム</td><td>Xenogen Corp.</td><td>Xenogen IVIS in vivoイメージングシステム</td><td></td></tr><tr><td>血液サンプル分析装置</td><td>Sysmex</td><td>pocH-100i 全自動血液分析装置</td><td></td></tr></tbody></table>

遺伝的に改変された細胞移植のためのマイクロパターン培養プレート上スフェロイド細胞に対する遺伝子導入

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

細胞移植の治療効果を改善するために、遺伝的に改変された、注射可能なスフェロイドの移植システムを開発しました。細胞スフェロイドは、感熱性ポリマーでコーティングされたマイクロパターン上でプレート培養系で調製されます。スフェロイドの数は、ポリエチレングリコール（PEG）マトリックスによって被覆されている非接着性領域によって囲まれ、定期的に二次元的に配列された直径100μmの細胞接着領域に対応する、プレート上に形成されています。スフェロイドは、容易にプレートの温度を低下させることにより液体懸濁液として回収することができ、その構造は、ウェル（27 G上の）十分に大きな口径の注射針に通して維持されます。遺伝子改変は、球状構造を破壊することなく細胞に遺伝子を導入することが可能である元の非ウイルス遺伝子キャリア、ポリプレックスナノミセルを用いた遺伝子導入によって達成されます。プリムのためのアルブミンの発現によって示されるように、ルシフェラーゼを発現する遺伝子でトランスフェクト進肝細胞スフェロイドは、ルシフェラーゼは持続、保存肝細胞機能と共に、移植動物において得られます。このシステムは、間葉系幹細胞を含む種々の細胞型に適用することができます。

ガウシアルシフェラーゼを発現するpDNAの遺伝子トランスフェクションは、ポリプレックスナノミセルまたは対照脂質ベースのトランスフェクション試薬12を使用して、肝細胞またはMSCのことで形成された球状体で実施しました。対照試薬が大幅にトランスフェクション（ 図3）の翌日の構造を破壊し、一方ナノミセルは、マイクロパターンプレート上の非トランスフェクトスフェロイドと比較スフェロイド構造はほとんど変化を誘導しませんでした。ナノミセル、一貫性のアルブミン分泌およびトランスジーン（ガウシアルシフェラーゼ）式を用いてトランスフェクションした後だけでなく、ほぼ月に維持しました。コントロール試薬を用いた場合に導入遺伝子の発現の程度はナノミセル（ 図4）12から得られたものと同様であったものの、全くアルブミン分泌は観察されませんでした。 感熱マイクロパターンプレート、3Dのを使用して、スフェロイド回復中スフェロイドのtructureはよく初代肝細胞と冷却プレート（ 図5）</...

このプロトコルは、遺伝子組み換え、注射可能なスフェロイドを使用した細胞移植システムについて説明しています。細胞スフェロイドをマイクロパターン化した培養プレート上で培養し、遺伝子導入後にポリプレックスナノミセルを用いて回収します。このシステムは、移植された細胞からの宿主動物への長期にわたる導入遺伝子発現を促進しながら、細胞の本来の機能を維持します。

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

この手順の全体的な目的は、遺伝子改変された注入可能なステロイドを用いて細胞移植を行うことです。まず、ラット肝細胞またはMSCを用いて、マイクロパターン化された培養プレート上に3D細胞OIDを調製します。次に、ポリマーとプラスミドDNA溶液を十分に混合し、plex nano my cellsを調製します。次に、plex nmy細胞溶液を培地に添加することで、PHEをトランスフェクションします。最後に、プレートを氷上に置き、剥離したステロイド細胞を吸引して回収します。最終的に、懸濁液中の遺伝子改変ステロイド細胞を細胞移植に使用することで、細胞本来の機能を維持しつつ、宿主動物における移植細胞からの長期的な外来遺伝子発現を実現します。本手順のデモンストレーションは、当研究室のUla氏、Yha氏、鈴木氏、松井氏、およびThey博士によって行われています。肝細胞を単離するには、テキストプロトコルに記載されている専用の溶液を用い、Sprague Dawley系雄ラットの門脈から肝臓を灌流させます。灌流後、コラゲナーゼ溶液を肝臓に循環させます。灌流が完了したら、慎重に肝臓を取り出し、メスを用いて穏やかに細切します。次に、培地を加え、細胞懸濁液を100 µmのナイロンメッシュでろ過して、さらに不純物を除去します。細胞懸濁液を20 Gsなどの低速で1分間遠心分離します。その後、肝細胞を含む上清を新しいチューブに移して再度遠心分離し、これを計3回繰り返します。肝細胞を50 Gsなどの高速で3分間遠心分離して細胞をペレット化し、テキストプロトコルに記載されている特殊な培養液を用いて、細胞濃度を4 × 10⁵ cells/mLになるように再懸濁してラットMSCを得ます。大腿骨と脛骨を切除した後、10 mLの培養液を満たしたシリンジに装着した22ゲージの針を骨幹に挿入し、洗浄して骨髄を回収します。肝細胞またはMSCを12ウェルマイクロパターンプレートに4 × 10⁵ cells/wellの密度で播種し、5% CO2を含む加湿雰囲気下、37 °Cでインキュベートします。細胞はマイクロパターン接着領域に蓄積し、2日以内に徐々に円形のスフェロイドを形成します。テキストプロトコルに記載されているPEG-PASP-DB block共重合体およびPASP-DBホモポリマーを合成した後、ポリマー濃度をそれぞれ33.3 µg/mLおよび19.1 µg/mLに調整し、10 mM HEPESバッファー中で残留アミノ基のモル比が等しくなるように混合溶液を調製します。次に、これら2つのポリマーの混合溶液をPDNA溶液に2:1の容量比で加え、十分に混合します。遺伝子導入を行うため、細胞を72時間インキュベートして成熟したスフィアを形成させた後、培地を1 mLの新鮮な培地に交換し、各ウェルに100 µLのplex

gene-transfection-toward-spheroid-cells-on-micropatterned-culture

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

このビデオでは、共培養された膵臓がん細胞と線維芽細胞の3D磁気バイオプリンティングについて説明しています。膵臓がん細胞と活性化した膵臓線維芽細胞を、生体適合性ナノ粒子集合体を用いて共培養・磁化し、磁力の影響下でスフェロイドを作製します。...

磁気的にバイオプリントされた3Dスフェロイド共培養:癌細胞と線維芽細胞の共培養法

このビデオは、ヒト多能性幹細胞(hPSC)の球状脳オルガノイドへの変換を示しています。特異的な阻害剤を用いることで、hPSCは神経細胞の系統に分化するように誘導され、神経外胚葉コロニーを形成します。その後、特別な成長因子が導入され、コロニーの自己組織化と増殖が促進され、最終的には球状の脳オルガノイドが形成されます。...

ヒト多能性幹細胞からのスフェロイドの作製

我々は、市販のマイクロウェルプレートを使用して、均一なサイズや組成制御の腫瘍スフェロイドの大量（数十万、何千）の生成のためのプロトコルを紹介する。...

マイクロウェルプレートを用いてサイズ制御の腫瘍球、多数の生産

前臨床試験からヒト試験に移行する新規薬物標的を特定することは、科学的な優先事項です。そのために、ここでは、遺伝子の枯渇ががん細胞株スフェロイドに与える影響を調べるための機能ゲノミクスアプローチについて説明します。これは、in...

癌細胞スフェロイド培養における潜在的に新規薬剤標的を同定するためのスクリーニング機能ゲノミクスを利用

ここでは、3D懸濁液培養における表皮スフェロイドの系統的培養のためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは、様々な上皮組織タイプで使用し、いくつかのヒト疾患および状態のモデリングのための幅広い用途を有する。...

ケラチノサイト幹細胞の可塑性をモデル化する高スループット表皮球面培養システムの確立

本プロトコルは、3Dプリントされたスタンプ様デバイスを使用して、大規模かつ費用対効果の高い方法で組織スフェロイドを作製する技術を記載している。...

3Dプリントされたスタンプ状デバイス による 組織スフェロイドの生成

再現性の高いスフェロイドを増殖させるためのプロトコルと、画像キャプチャとプロテオミクスを用いた表現型特性評価について紹介します。...

機能的3Dスフェロイド細胞培養の半自動表現型解析(英語)

この記事では、3次元腫瘍スフェロイドを構築するための標準化された方法を示します。また、自動イメージングシステムを用いたスフェロイド観察と画像ベースの深層学習解析の戦略についても説明します。...

医薬品評価研究のための3D腫瘍スフェロイドの作製

本稿では、光ピンセットを用いたハイブリッドスフェロイド製造のプロトコールを提案する。この方法により、他の方法では達成できないスフェロイド形成プロセスの初期段階を正確に制御することができます。...

ハイブリッドスフェロイドの生成のための光ピンセットの使用

この研究では、アガロース型にマイクロウェルを作製するためのスタンプベースのシステムを使用して、3D細胞構造を生成するための費用対効果が高く効率的な方法論を提示します。このシステムは、均一なスフェロイド/オルガノイドの形成を促進し、細胞相互作用を改善します。このアプローチは、実験のばらつきを減らし、薬物試験や組織工学への応用をサポートします。...

新規スタンプデバイスを用いた二次元細胞培養からの三次元スフェロイド/オルガノイドの作製

学ぶマイクロパターン培養プレート上スフェロイド細胞への遺伝子導入法。ラット肝細胞またはMSCを用いて3Dスフェロイドを形成し、ポリプレックスナノミセルで遺伝子導入を行い、移植後の長期遺伝子発現と細胞機能維持を実現する細胞移植システムです。

遺伝的に改変された細胞移植のためのマイクロパターン培養プレート上スフェロイド細胞に対する遺伝子導入

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