Name: ケアの膠芽腫の標準のコンテキストにおける養子療法のためのCAR T細胞の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: 学ぶ、EGFRvIII標的CAR T細胞の生成と膠芽腫標準治療との併用療法。マウスモデルで放射線・テモゾロミドとの相乗効果を評価し、免疫療法の可能性を探索する。

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著者は、CARレトロウイルスコンストラクトを提供してくださったローラ・ジョンソン博士とリチャード・モーガン博士に感謝したいと思います。著者らはまた、全脳照射の線量測定を支援してくれたGiao Ngyuenに感謝します。この研究は、NIH NCIの助成金1R01CA177476-01によって支援されました。

<ol><li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).</li>
<li>Kantoff, P., Higano, C., Shore, N., Berger, E., Small, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sipuleucel-T+immunotherapy+for+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer.</a> N Engl J Med. (363), 411-422 (2010).</li>
<li>Hodi, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+survival+with+ipilimumab+in+patients+with+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma.</a> N Engl J Med. 363 (8), 711-723 (2010).</li>
<li>Schwartzentruber, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gp100+peptide+vaccine+and+interleukin-2+in+patients+with+advanced+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">gp100 peptide vaccine and interleukin-2 in patients with advanced melanoma.</a> N Engl J Med. 364 (22), 2119-2127 (2011).</li>
<li>Gross, G., Gorochov, G., Waks, T., Eshhar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+effector+T+cells+expressing+chimeric+T+cell+receptor+with+antibody+type-specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Generation of effector T cells expressing chimeric T cell receptor with antibody type-specificity.</a> Transplant Proc. 21 (1 Pt 1), 127-130 (1989).</li>
<li>Pule, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-specific+T+cells+engineered+to+coexpress+tumor-specific+receptors%3A+persistence+and+antitumor+activity+in+individuals+with+neuroblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma.</a> Nat Med. 14 (11), 1264-1270 (2008).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+depletion+and+remissions+of+malignancy+along+with+cytokine-associated+toxicity+in+a+clinical+trial+of+anti-CD19+chimeric-antigen-receptor-transduced+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells.</a> Blood. 119 (12), 2709-2720 (2012).</li>
<li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> N Engl J Med. 365 (8), 725-733 (2011).</li>
<li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+persistence+of+adoptively+transferred+autologous+CD19-targeted+T+cells+in+patients+with+relapsed+or+chemotherapy+refractory+B-cell+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias.</a> Blood. 118 (18), 4817-4828 (2011).</li>
<li>Wikstrand, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+against+EGFRvIII+are+tumor+specific+and+react+with+breast+and+lung+carcinomas+and+malignant+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas.</a> Cancer Res. 55 (14), 3140-3148 (1995).</li>
<li>Sampson, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFRvIII+mCAR-modified+T-cell+therapy+cures+mice+with+established+intracerebral+glioma+and+generates+host+immunity+against+tumor-antigen+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">EGFRvIII mCAR-modified T-cell therapy cures mice with established intracerebral glioma and generates host immunity against tumor-antigen loss.</a> Clin Cancer Res. 20 (4), 972-984 (2014).</li>
<li>Kuppner, M. C., Hamou, M. F., Sawamura, Y., Bodmer, S., de Tribolet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+lymphocyte+function+by+glioblastoma-derived+transforming+growth+factor+beta+2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Inhibition of lymphocyte function by glioblastoma-derived transforming growth factor beta 2.</a> J Neurosurg. 71 (2), 211-217 (1989).</li>
<li>Wintterle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+B7-related+molecule+B7-H1+by+glioma+cells%3A+a+potential+mechanism+of+immune+paralysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Expression of the B7-related molecule B7-H1 by glioma cells: a potential mechanism of immune paralysis.</a> Cancer Res. 63 (21), 7462-7467 (2003).</li>
<li>Fecci, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+regulatory+T-cell+fraction+amidst+a+diminished+CD4+compartment+explains+cellular+immune+defects+in+patients+with+malignant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Increased regulatory T-cell fraction amidst a diminished CD4 compartment explains cellular immune defects in patients with malignant glioma.</a> Cancer Res. 66 (6), 3294-3302 (2006).</li>
<li>Wilmotte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-homolog+1+expression+by+human+glioma%3A+a+new+mechanism+of+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">B7-homolog 1 expression by human glioma: a new mechanism of immune evasion.</a> Neuroreport. 16 (10), 1081-1085 (2005).</li>
<li>Yang, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediation+of+enhanced+transcription+of+the+IL-10+gene+in+T+cells%2C+upon+contact+with+human+glioma+cells%2C+by+fas+signaling+through+a+protein+kinase+A-independent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mediation of enhanced transcription of the IL-10 gene in T cells, upon contact with human glioma cells, by fas signaling through a protein kinase A-independent pathway.</a> Journal of Immunology. 171 (8), 3947-3954 (2003).</li>
<li>Reilly, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temozolomide%3A+a+new+oral+cytotoxic+chemotherapeutic+agent+with+promising+activity+against+primary+brain+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Temozolomide: a new oral cytotoxic chemotherapeutic agent with promising activity against primary brain tumours.</a> Eur J Cancer. 29A (7), 940-942 (1993).</li>
<li>Newcomb, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Combination+of+Ionizing+Radiation+and+Peripheral+Vaccination+Produces+Long-term+Survival+of+Mice+Bearing+Established+Invasive+GL261Gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The Combination of Ionizing Radiation and Peripheral Vaccination Produces Long-term Survival of Mice Bearing Established Invasive GL261Gliomas.</a> Clin Cancer Res. 12, 4730-4737 (2006).</li>
<li>Park, B., Yee, C., Lee, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+radiation+on+the+immune+response+to+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The effect of radiation on the immune response to cancers.</a> Int J Mol Sci. 15 (1), 927-943 (2014).</li>
<li>Fritzell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral+temozolomide+synergizes+with+immunotherapy+in+a+T+cell-dependent+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Intratumoral temozolomide synergizes with immunotherapy in a T cell-dependent fashion.</a> Cancer Immunol Immunother. 62 (9), 1463-1474 (2013).</li>
<li>Park, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-priming+by+temozolomide+enhances+antitumor+immunity+of+dendritic+cell+vaccination+in+murine+brain+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Cross-priming by temozolomide enhances antitumor immunity of dendritic cell vaccination in murine brain tumor model.</a> Vaccine. 25 (17), 3485-3491 (2007).</li>
<li>Emens, L. A., Jaffee, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+the+activity+of+tumor+vaccines+with+cytotoxic+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Leveraging the activity of tumor vaccines with cytotoxic chemotherapy.</a> Cancer Res. 65 (18), 8059-8064 (2005).</li>
<li>Murphy, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+immunotherapy+screen+of+costimulatory+molecules+identifies+Fc-OX40L+as+a+potent+reagent+for+the+treatment+of+established+murine+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">An in vivo immunotherapy screen of costimulatory molecules identifies Fc-OX40L as a potent reagent for the treatment of established murine gliomas.</a> Clin Cancer Res. 18 (17), 4657-4668 (2012).</li>
<li>Newcomb, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+enhances+antitumor+effect+of+anti-CD137+therapy+in+a+mouse+Glioma+model%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy enhances antitumor effect of anti-CD137 therapy in a mouse Glioma model.</a> Radiat Res. 173 (4), 426-432 (2010).</li>
<li>Su, Y. B., Krown, S. E., Livingston, P. O., Wolchok, J. D., Chapman, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+lymphotoxic+is+dose-intensified+temozolomide%3F+The+glioblastoma+experience%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">How lymphotoxic is dose-intensified temozolomide? The glioblastoma experience.</a> J Clin Oncol. 23 (18), 4235-4236 (2005).</li>
<li>Neyns, B., Tosoni, A., Hwu, W. J., Reardon, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-dense+temozolomide+regimens%3A+antitumor+activity%2C+toxicity%2C+and+immunomodulatory+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Dose-dense temozolomide regimens: antitumor activity, toxicity, and immunomodulatory effects.</a> Cancer. 116 (12), 2868-2877 (2010).</li>
<li>Muranski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+intensity+lymphodepletion+and+adoptive+immunotherapy-how+far+can+we+go%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Clin+Pract+Oncol%22%5BJournal%5D)">Increased intensity lymphodepletion and adoptive immunotherapy-how far can we go.</a> Nat Clin Pract Oncol. 3 (12), 668-681 (2007).</li>
<li>Wrzesinski, C., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Less+is+more%3A+lymphodepletion+followed+by+hematopoietic+stem+cell+transplant+augments+adoptive+T-cell-based+anti-tumor+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Less is more: lymphodepletion followed by hematopoietic stem cell transplant augments adoptive T-cell-based anti-tumor immunotherapy.</a> Current Opinion in Immunology. 17 (2), 195-201 (2005).</li>
<li>Dudley, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cell+therapy+for+patients+with+metastatic+melanoma%3A+evaluation+of+intensive+myeloablative+chemoradiation+preparative+regimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Adoptive cell therapy for patients with metastatic melanoma: evaluation of intensive myeloablative chemoradiation preparative regimens.</a> J Clin Oncol. 26 (32), 5233-5239 (2008).</li>
<li>Sanchez-Perez, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloablative+Temozolomide+Enhances+CD8%28%2B%29+T-Cell+Responses+to+Vaccine+and+Is+Required+for+Efficacy+against+Brain+Tumors+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Myeloablative Temozolomide Enhances CD8(+) T-Cell Responses to Vaccine and Is Required for Efficacy against Brain Tumors in Mice.</a> Plos One. 8 (3), (2013).</li>
<li>Su, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+CD4%2B+lymphopenia+in+melanoma+patients+treated+with+temozolomide%3A+a+toxicity+with+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Selective CD4+ lymphopenia in melanoma patients treated with temozolomide: a toxicity with therapeutic implications.</a> J Clin Oncol. 22 (4), 610-616 (1200).</li>
<li>Dummer, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+homeostatic+proliferation+elicits+effective+antitumor+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">T cell homeostatic proliferation elicits effective antitumor autoimmunity.</a> J Clin Invest. 110 (2), 185-192 (2002).</li>
<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+homeostatic+cytokine+sinks+by+lymphodepletion+enhances+the+efficacy+of+adoptively+transferred+tumor-specific+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Removal of homeostatic cytokine sinks by lymphodepletion enhances the efficacy of adoptively transferred tumor-specific CD8+ T cells.</a> J Exp Med. 202 (7), 907-912 (2005).</li>
<li>Wrzesinski, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+intensity+lymphodepletion+enhances+tumor+treatment+efficacy+of+adoptively+transferred+tumor-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Increased intensity lymphodepletion enhances tumor treatment efficacy of adoptively transferred tumor-specific T cells.</a> J Immunother. 33 (1), 1-7 (2010).</li>
<li>Hughes, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+a+TCR+gene+derived+from+a+patient+with+a+marked+antitumor+response+conveys+highly+active+T-cell+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Transfer of a TCR gene derived from a patient with a marked antitumor response conveys highly active T-cell effector functions.</a> Hum Gene Ther. 16 (4), 457-472 (2005).</li>
<li>Morgan, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+glioma+stem+cells+by+genetically+modified+T+cells+targeting+EGFRvIII+and+development+of+adoptive+cell+therapy+for+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Recognition of glioma stem cells by genetically modified T cells targeting EGFRvIII and development of adoptive cell therapy for glioma.</a> Hum Gene Ther. 23 (10), 1043-1053 (2012).</li>
<li>Kerkar, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+murine+CD8%2B+and+CD4%2B+T+cells+for+preclinical+adoptive+immunotherapy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies.</a> J Immunother. 34 (4), 343-352 (2011).</li>
</ol>

著者には宣言すべき利益相反はありません。

ここに記載されている治療のタイムラインはケアの臨床標準をモデル化し、CAR養子療法のためにその効果を活用するために設計されました。 CAR T細胞の用量、TMZ療法、および放射線療法の投与は、in vivoで T細胞活性、リンパ球枯渇、および腫瘍殺傷を増強するように改変することができる。 TMZレジメンは、宿主骨髄破壊及び養子移入細胞の30の増加した膨張を得るために増加させることができる。したがって、SOCの殺腫瘍特性を回避、 - （6Gyの4）単一フラクション全身照射（TBI）さらに、TMZのlymphodepletive効果は低用量によって要約させることができる。ここに適用される放射線レジメンは60 Gyでの生物学的等価線量を模倣。しかしながら、画分分数投与回数は、他の臨床投与量（ 表2）を模倣するように調整することができる。重要なことは、SOCの我々のモデルは、外部ビーム放射線が腫瘍とMAに限局的に配信するのではなく、WBIの生物学的に同等の用量を利用rginsは、としては、多くの場合、臨床で利用され、従って、腫瘍に送達される放射線のより少...

神経膠芽腫（GBM）は、最も一般的な原発性悪性脳腫瘍であると常に致命的である。ケア化学療法および放射線療法の非特異的に結合された標準の外科的切除が完全にこの疾患を有する患者における1未満の15ヶ月の予後不良をもたらす、悪性細胞を排除することができない。対照的に、免疫療法は、腫瘍細胞を特異的に標的化するための正確なアプローチを提供し、したがって、担保毒性2-4リスクの減少と非常に効果的な治療プラットフォームとして機能する可能性がある。キメラ抗原受容体（車を）を発現するようにex vivoでを設計し 、T細胞が腫瘍免疫療法のための多目的な戦略を提供します。是正は、複雑な、完全長の主要組織適合性の代わりに、一つ以上の細胞内のT細胞シグナル伝達分子（単数または複数）を有する抗体の細胞外可変領域を融合することによって生成される（MHC）は、T細胞受容体5を拘束性。抗体様抗原のこのモードrecognitiには、反応性の抗原特異的T細胞はMHCの非存在下で認識腫瘍抗原に応答することを可能にし、実質的に無限の抗原レパートリーに適合させることができる。 腫瘍抗原の多様に対して設計さCARのT細胞は、診療所6-9に前臨床有効性と優れた将来性を示している。具体的には、GBM、上皮成長因子受容体変異体III（EGFRvIIIの）、細胞表面10上に発現される腫瘍特異的な変異を標的CAR T細胞プラットフォームの文脈において、神経膠腫を有するマウス11の生存を延長することが示された。汎用性にもかかわらず、しかし、CAR養子療法の臨床的利点は、完全に起因する腫瘍関連免疫抑制および免疫回避12-16ならびに確立およびin vivoで抗原特異的T細胞を維持する際の課題の一部は、実現されていない。免疫療法とケア（SOC）の標準を活用することは、潜在的にこれらのLのいくつかを克服することができる模造品、両方の前臨床および臨床の場で強化された有効性になる。 切除後GBMのためのSOCは、高用量のテモゾロミド（TMZ）、DNAアルキル化剤17、及び全脳照射（WBI）から成る1。これらの治療は、腫瘍MHC発現18-20および死腫瘍細胞17,19,21,22による抗原の脱落のアップレギュレーションを介して、腫瘍ワクチンと相乗作用することが推定される。実際、前臨床設定における免疫ベースの治療法の強化された抗腫瘍効果にTMZ 20,23-またはWBI 18,24リードの追加。さらに、多くの非特異的な細胞傷害性化学療法のように、TMZは、養子療法プラットフォーム27-29に対するホスト空調手段として活用することができる全身リンパ球25,26を引き起こすことが知られている。 TMZ媒介リンパ球枯渇は、ADOPの効力の増大をもたらす、抗原特異的T細胞の頻度及び機能を増強することが示されている頭蓋内腫瘍30に対して電性治療プラットフォーム。 CAR療法の文脈では、リンパ球枯渇は、内因性サプレッサーT細胞31の数を減らし、従って、抗腫瘍活性11,34を増強サイトカイン33削減競争を介して恒常的増殖32を誘導することの両方によってホスト調節手段として機能する。 GBM SOCと免疫療法のプラットフォーム間の相乗関係を考えると、SOCの文脈における新規養子療法とワクチンプラットフォームを評価する有効性に関する意味のある結論を引き出すために重要である。 このプロトコルでは、（処理タイムラインについては図1を参照）のEGFRvIII陽性頭蓋内腫瘍を有するマウスにおけるTMZとWBIと一緒にマウスのEGFRvIII特異CARのT細胞の生成および静脈内投与のための方法を概説する。簡単に言えば、CAR T細胞は、レトロウイルス形質導入によりエクスビボで行われる。ヒト胚腎臓（HEK）293T次いで、細胞を採取し、並行して培養し、活性化マウス脾細胞を形質導入するために使用されるウイルスを生成する（CARベクトルとしたpCL-エコプラスミドを含む）、DNA /脂質複合体を用いてトランスフェクトされる。 CARの生成の過程において、EGFRvIIIの陽性頭蓋内腫瘍を有するマウスのホストは、臨床SOCに匹敵する用量で分画した全脳X線照射および全身TMZ処置を投与する。 CAR T細胞を、lymphodepletedホストに静脈内に送達される。 腫瘍を有するマウスにテモゾロミドの（1）投与、腫瘍を有するマウスの（2）全脳照射、（3）トランスフェクション、（4）、脾臓摘出及びT細胞の調製、（5：以下の手順は、7つの別々の相に記載されている腫瘍を有するマウスに）形質導入、（6）CAR T細胞培養および収穫、及び（7）CARのT細胞の投与。これらの相は6〜7日にまたがると並行して行われるいくつかのステップで構成されています。

<table><tbody><tr><td>pCL-Eco レトロウイルス パッケージングベクター</td><td>Imgenex</td><td>10045P</td><td>CARレトロウイルスを生成するヘルパーベクター</td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2010</td><td>T細胞の増殖とウイルス形質導入を誘導する非特異的マイトジェン</td></tr><tr><td>レトロネクチン</td><td>ClonTech/Takara</td><td>T100B</td><td>T細胞のレトロウイルス形質導入を促進する</td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668-019</td><td>トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>DMEM、高グルコース、ピルビン酸</td><td>Life technologies</td><td>11995-065</td><td>HEK293 培地</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>T 細胞培養培地</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11058-021</td><td>トランスフェクション培地</td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>T細胞培養培地サプリメント</td></tr><tr><td>100 mM ピルビン酸ナトリウム</td><td>生命技術</td><td>11360-070</td><td>T 細胞培養培地サプリメント</td></tr><tr><td>100X MEM 非必須アミノ酸溶液</td><td>生命技術</td><td>11140-050</td><td>T 細胞培養培地サプリメント</td></tr><tr><td>55 mM 2-メルカプトエタノール</td><td>生命技術</td><td>21985-023</td><td>フリーラジカルを除去する還元剤</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000U/ml)</td><td>ライフテクノロジー</td><td>15140-122</td><td>T細胞培養培地サプリメント</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン (50 mg/ml)</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 15750-060</td><td>T細胞培養培地サプリメント</td></tr><tr><td>GemCell 米国起源 胎児ウシ血清</td><td>ジェミニバイオプロダクツ</td><td>100-500</td><td>in vitro細胞増殖ウ</td></tr><tr><td>シ血清アルブミン(BSA)、フラクションV&ndashのための成長因子と栄養素を提供します。標準グレードの</td><td>ジェミニバイオ製品</td><td>700-100P</td><td>は、レトロウイルスのレトロネクチンコーティングプレートへの非特異的結合をブロック</td></tr><tr><td>します Pharm Lyse(10倍濃縮物)</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td>脾細胞処理中に赤血球を溶解</td></tr>します <tr><td>70 &mu;m 滅菌細胞ストレーナー</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>脾細胞処理中に大きな組織粒子をろ過します</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine 100 mm BioCoat 培養皿</td><td>Corning</td><td>356469</td><td>HEK293細胞接着を促進し、トランスフェクション</td></tr><tr>後の増殖を最大化します<td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>テモゾロミド</td><td>Best Pharmatech</td><td>N/A</td><td>投与日に調製した凍結乾燥粉末</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>シグマライフサイエンス</td><td>D2650</td><td>テモゾロミドの完全な溶解に必要</td></tr><tr><td>生理食塩水</td><td>ホスピーラ</td><td>IM 0132 (5/04)</td><td>テモゾロミドとケタミン/キシラジンの溶媒</td></tr><tr><td>ケタテシアHCl</td><td>ヘンリー・シャイン アニマルヘルス</td><td>11695-0701-1</td><td>ケタミン溶液</td></tr><tr><td>AnaSed</td><td>Lloyd Inc</td><td>N/A</td><td>キシラジン滅菌溶液 100 mg/ml</td></tr></tbody></table>

ケアの膠芽腫の標準のコンテキストにおける養子療法のためのcar t細胞の生成

Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care

Adoptive T cell immunotherapyは、悪性神経膠腫を特異的に標的とし、排除するための有望な戦略を提供します。T細胞は、神経膠腫抗原に特異的なキメラ抗原受容体(CAR T細胞)を発現するようにex vivoで操作できます。養子移植されたCAR-T細胞の増殖と機能は、標準治療の化学療法および放射線療法のリンパ球減少作用および殺腫瘍作用によって増強することができる。神経膠腫特異的抗原であるEGFRvIIIを標的とするCAR-T細胞を作製し、神経膠芽腫の標準治療のマウスモデルと組み合わせた場合の有効性を評価する方法について説明します。T細胞は、抗EGFRvIII CAR遺伝子を含むレトロウイルスベクターによる形質導入によって操作されます。腫瘍担持動物は、テモゾロミドのコースと、臨床標準治療をモデル化するように設計された用量レジメンでの全脳照射による宿主条件付けを受けます。その後、CAR-T細胞をプライミングした宿主に静脈内投与します。この方法は、標準治療の文脈でCAR-T細胞の抗腫瘍効果を評価するために使用できます。

CAR T細胞を、EGFRvIIIのCARレトロウイルスベクター11での形質導入によって生成されます。このベクターは、MSGV1は、マウス幹細胞ウイルス（MSCV）の長い末端反復配列、拡張ギャグ領域およびエンベロープスプライス部位（スプライスドナー、sdは、スプライスアクセプター、sa）の、およびウイルスが含まSFGtcLuc_ITE4ベクトル35から開発されたパッケージングシグナル（ψ）。マウスCD8TMと並行して、ヒト抗EGFRvIIIの一本鎖可変フラグメント（scFv）で139を含むEGFRvIIIのCARは、CD28、4-1BB、およびCD3ζの細胞内領域は、下流のレトロウイルスベクターのNcoI部位にクローン化した（ 図3） 。 形質導入の後、CAR T細胞を定量することができるし、フローサイトメトリーにより表現型。 EGFRvIIIのCAR T細胞は、ストレプトアビジン - フィコエリトリン（SA / PE）からなる2色のパネルを視覚化することができるbiotynlated EGFRvIII...

化学療法と放射線標準治療のリンパ球除去および免疫調節効果は、T細胞免疫療法の抗腫瘍効果を高めるために活用することができます。EGFRvIII特異的キメラ抗原受容体(CAR)T細胞を作製し、膠芽腫の標準治療の文脈でそれらを投与する方法を概説します。

ケアの膠芽腫の標準のコンテキストにおける養子療法のためのCAR T細胞の生成

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo ...

本手順の目的は、遺伝子改変キメラ抗原受容体（CAR）マウスT細胞を作製し、標準治療におけるその有効性を評価することです。高グレードグリオーマの場合、まずマウスに標準治療である全脳照射およびテモゾロミド投与を行い、次にCARベクターを発現するレトロウイルスを作製し、その後、マウスT細胞をこのCARレトロウイルスで形質導入することでこれを達成します。最後に、標準治療を施したマウスにCAR T細胞を投与します。最終的には、全脳照射およびテモゾロミドと併用してCAR T細胞を投与します。この投与は、標準治療による宿主のコンディショニングが、養因 T細胞プラットフォームの有効性を高めるかどうかを検証するために行われます。この手法は、高グレードグリオーマに対する標準治療下における新規免疫療法の抗腫瘍効果など、脳腫瘍免疫療法の分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法は、高悪性度グリオーマに対する遺伝子改変miおよびT細胞の有効性に関する知見を得ることができますが、メラノーマや肺癌、およびその他の脳転移腫瘍モデルに対するT細胞療法の評価など、他の系にも適用可能です。一般的に、本手法に不慣れな方は、複数の手順を並行して行う必要があるため、習得に時間を要する場合があると考えられます。したがって、タスクの計画と整理が極めて重要です。手順のデモンストレーションは、私の研究室の優秀な大学院生であるCatherine UniとCarter s Devaが行います。DMSOで3 mg/mLのテモゾロミド（TMZ）を調製した後、溶液をビーカーに入れた水に入れ、ホットプレートを用いて65 °Cで10〜15分間加熱します。TMZが完全に溶解すると、溶液は淡黄色になります。1 mLシリンジ15本にTMZ溶液を完全に充填してください。TMZの析出を防ぎ、全脳照射を行うため、TMZは調製後90分以内に投与する必要があります。X線照射器の電源を入れ、ウォーミングアップを行わせてください。また、適切なフィルターが装着されていることを確認し、正しい電圧および電流設定を入力してください。テキストプロトコルに従ってマウスを鎮静させた後、鎮立させたマウスをグリッド上に配置し、頭部が最も高いX線強度を受ける領域にくるようにします。全身へのX線照射を遮断するため、頸部から下までを鉛チューブで遮蔽してください。X線照射が完了したら、マウスをX線装置内から出してください。動物を照射器から取り出します。動物が十分に意識を回復し、胸腹臥位を維持できるようになったら、適切なケージに戻します。テキストプロトコルに従ってD 10培地を調製し、HEC 2 93 T細胞を回収した後、10 mLのD 10培地を含む16個の10 cmポリLリシンコートプレートに、7.5 × 10⁶ cells/mLの細胞懸濁液を1 mLずつ加え、翌日まで一晩インキュベートします。テキストプロトコルに記載された手順でCARプラスミドとトランスフェクション試薬を調製した後、リポフェクションDNA複合体をHEK 293T細胞に滴下し、6〜8時間インキュベートします。次に、培地を12 mLの新鮮なT細胞培地（TCM）に交換します。続いて、1つの脾臓を70 µmのメッシュセルストレーナーに注ぎ、5 mLシリンジの内側の鈍端を用いて分散させ、単一細胞懸濁液を作成します。新鮮なTCMプールを調製した後、TCMを含む50 mLコニカルチューブ内で脾臓を分散させ、遠心して細胞をペレット化します。脾臓1個あたり5 mLの1x lysis bufferを用いて細胞を再懸濁し、ピペッティングで穏やかに混ぜ合わせることで赤血球を除去します。細胞懸濁液を37 °Cのウォーターバスで5分間インキュベートします。ライシス反応液をウォーターバスから取り出し、反応を中和させるためにlysis bufferと同量（1:1の比率）のTCMを加え、300 Gで10分間遠心して洗浄します。上清を吸引した後、脾臓1個あたり2 mLのTCMを用いてペレットを再懸濁します。細胞数を計測するには、細胞懸濁液10 µLを190 µLのトリパンブルーに加えます。総細胞数を算出した後、2 µg/mLのCon Aおよび50 IU/mLのリコンビナントヒトインターロイキン2を添加したTCMを用いて、細胞濃度を2×10⁶ cells/mLに調整します。脾摘の翌日に、24ウェル処理済み組織培養プレートの各ウェルに2 mLまたは4×10⁶ cellsを分注し、37 °C、5% CO2条件下で一晩インキュベートします。25 µg/mLの組換えヒトフィブロネクチン断片（RHFF）を含むPBSを調製します。非組織培養処理済みの24ウェルプレートの各ウェルにこの溶液を0.5 mLずつ添加し、翌日までコーティングします。ウェルから溶液を除去し、2% BSA含有PBSを1 mL/ウェル添加して、室温で30分間インキュベートします。次に、プレートをしっかりと逆さまにしてBSAを除去し、2 mLのPBSを加えて洗浄します。HEC 2 93 T細胞からウイルス上清を回収した後、RHFFコート済みウェルの数に3 mLを加えた最終容量になるように、新鮮なTCMを添加します。インキュベーターから培養した脾細胞を取り出し、各ウェルで2〜3回緩やかにピペッティングして再懸濁します。細胞懸濁液を50 mLコニカルチューブに移します。次に、ウイルス上清を用いて細胞を1×10⁶ cells/mLに再懸濁します。その後、RHFFコートプレートの各ウェルに、この懸濁液を1 mL/wellずつ分注します。次に、プレートを32°C、770 gで90分間遠心分離します。この際、加速度は4、ブレーキ設定は0にしてください。TCMを用いて、50 IU/mLの組み換えヒトIL-2を調製します。遠心分離後、各ウェルに培地を1 mLずつ加え、一晩インキュベートします。T細胞が80%以上のコンフルエンスに達した場合は、各ウェルでピペッティングを2〜3回静かに行い、細胞を分散させます。その後、各ウェルから1 mLを、新しい24ウェル組織培養処理プレートの各ウェルに分注します。各ウェルに、50 international units/mLのIL-2を含む新鮮なTCMを1 mL添加します。細胞が80%以上のコンフルエンスに達していない場合は、各ウェルの上層から培地を1 mLゆっくりとピペッティングで除去し、50 international units/mLのリコンビナントヒトIL-2を含む新鮮なTCM 1 mLで半分培地交換します。各ウェルで静かに3回ピペッティングしてCAR T細胞を再懸濁し、250 mL遠心チューブに移します。細胞を300 GSで10分間遠心分離します。次に、ペレットを乱さないように上清を完全に吸引除去します。PBSを用いて細胞を洗浄し、2回目の洗浄を行う前に細胞数をカウントします。一般的なCAR-T細胞の回収量は、PBSでの再懸濁後、1ウェルあたり約1×10⁶個です。細胞を5×10⁷個/mLの濃度で懸濁し、200 µLの容量で1×10⁷個を注入します。腫瘍担がんマウスへの注入には、27〜31ゲージの針を使用し、気泡が完全に抜けていることを確認しながらインスリン用注射器に500〜1000 µLを充填してください。CAR-T細胞は、 murine stem cell virus（MSCV）ロングターミナルリピートを含むEGFRv3 CARレトロウイルスベクターを用いて形質導入することで作製しました。拡張gag領域、エンベロープ splicing site、およびウイルスパッケージングシグナル。ヒト抗EGFRv3単鎖可変断片（scFv）を含むEGFRv3 CAR。1 39を、マウスCD8 tm、CD28 4 1 BBB、およびCD3ζ細胞内領域と共にレトロウイルスベクターにクローニングした。トランスダクション後、EGFRv3 CAR T細胞は、ストレプトアビジン結合ビオチン化EGFRv3由来マルチマーおよび抗CD3 FITCからなる2色パネルを用いたフローサイトメトリーにより、定量および表現型解析が可能である。本ビデオで説明するプロトコルを用いれば、CD3陽性のマウスT細胞の55%から70%において、ルーチンにCARの発現が観察される。この例に示すように、2色のCARパネルに他の蛍光標識抗体を加えることで、CAR T細胞をさらに表現型解析することが可能です。CD8およびCD4の染色結果から、導入されたCARの70%がCD8陽性T細胞であり、20%がCD4陽性T細胞であることがわかります。この手法を習得すれば、適切に実施することで1週間で12時間以内に完了させることができます。本手順に続き、さらなる疑問を解決するために、ELISA、ELISpot、または細胞内サイトカイン染色などの他の方法を実施することがあります。例えば、キメラ抗原受容体を導入したT細胞は抗原認識に対して機能的に反応し、その機能は抗原特異的であるでしょうか。レトロウイルス、テモゾロミド、X線照射を扱う操作は極めて危険であり、BSL 2条件下での操作、個人用保護具の着用、指定区域での実験実施、および適切な動物ハンドリングトレーニングの受講などの対策が必要であることに留意してください。また、これらの手順を行う際は、常にX線装置の使用に注意を払ってください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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マウスキメラ抗原受容体(CAR)-T細胞の効率的な作製

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ヒトキメラ抗原受容体制御性T細胞の作製

このプロトコルは、がん免疫療法のために非統合mRNAを使用して一過性キメラ抗原受容体(CAR)T細胞を生成するための詳細な手順を概説し、CAR-T細胞とその細胞毒性機能を評価するための信頼性の高い方法を提供します。...

がん免疫療法のためのmRNAを用いた一過性キメラ抗原受容体T細胞を作製するための非ウイルス性アプローチ

学ぶ、EGFRvIII標的CAR T細胞の生成と膠芽腫標準治療との併用療法。マウスモデルで放射線・テモゾロミドとの相乗効果を評価し、免疫療法の可能性を探索する。

ケアの膠芽腫の標準のコンテキストにおける養子療法のためのCAR T細胞の生成

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