Name: ザ・卵内ニワトリ絨毛尿膜（CAM）アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 学ぶニワトリ絨毛尿膜（CAM）アッセイによる肝細胞がん（HCC）の血管化腫瘍モデル構築法。ヒトHCC細胞を卵内に移植し、生存率93%で三次元腫瘍を形成する技術を習得できます。

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A.S.は、国立衛生研究所(NIH)、国立歯科・頭蓋顔面研究所(5R03DE021741-02)、国立がん研究所(1K08CA154963-01A1)からの助成金によって部分的に支援されました。 
ハワード・ヒューズ医学研究所は、HHMI医学研究フェロープログラムを通じてM.L.に資金を提供しました。

1.卵のインキュベーション<ol><li> 8日齢の特定病原体フリーの孵化卵を入手します。 </li><li>卵トレイを回転させるに卵を置き、上向きに刻印が終了し、卵のインキュベーターの内側に回転トレイを置きます。 36°Cおよび50％の湿度で48時間の卵をインキュベートします。 </li></ol> 2. CAMを削除し、卵を開きます<ol><li>インキュベーターから卵を収集します。卵のラックに卵を置き、刻印側を上にし、層流フードにもたらします。 </li><li>部屋とフードライトをオフにします。 </li><li> CAMの血管系だけでなく、気嚢を露出するために卵キャンドラーに軽く卵の刻印の端を持ってください。 注：卵キャンドラーは、発生中の胚および関連気嚢と血管系を可視化するために使用される光源です。 </li><li>二つの主要な血管の間に鉛筆マークを配置します。 </li><li>ライトの電源をオンにし、PEで気嚢（刻印終了）上記の卵の先端と一つの穴に一つの穴を作るために、滅菌プッシュピンを使用ncilマーク。すべての方法を介してプッシュピンを押さないでください。深い3ミリメートルの周りの穴は、通常は十分であろう。 </li><li>ライトをオフにします。気嚢上の穴にしっかりと開放端を押して、安全電球を絞ります。 CAMは、鉛筆のマークでシェルから離れて落下させる、鉛筆のマークの穴に空気を引っ張るために吸引を適用します。 </li><li>気嚢がキャンドラーを使用して、鉛筆でマークされた穴に卵の刻印端から移動したことを確認してください。それはしていない場合、安全バルブを使用して再適用する吸引両方の穴が若干深くするために押しピンを使用して。 </li><li>ライトをオンにします。添付15/16インチカットオフホイールでDREMEL回転工具をオンにし、シェルを切断するだけの十分な深2の横方向のカットを行いますが十分な深さではないが押さまですべての方法をカットするために、片手で卵を開催CAM。離間長さ2センチ、1センチメートル周りのカットを行います。直径1cmシリコーンリングが通過できるように十分な幅のカットを作りますしかし、標準的なスコッチテープの幅よりも薄いです。 </li><li>次に、間に軽くシェルにカットオフホイールをタッチして、2つの横方向のカットの端部の1の長手方向のカットを行います。 </li><li>シェルにシェル片と並列の下で滅菌ピンセットをスライドさせます。ピンセットで殻の部分をつかみ、きれいに作品全体を削除します。 </li><li>除去を容易にするため自体に一端を超える倍にしてくださいすること、新しく開いたウィンドウの上にスコッチテープを配置します。 </li><li>接種時まで（NOT回転卵ラックで）卵トレイにインキュベーターに戻って卵を置きます。 </li></ol> 3.接種<ol><li> （重合を防止するため）とフードに置き、氷上で、そのようなマトリゲルとして、基底膜タンパク質の混合物を保管してください。 </li><li> 5分間組織培養インキュベーター中で - （T75フラスコあたり5ミリリットル4）と場所フラスコの細胞を分離するために2 mMのEDTAを使用してください。 </li><li>メディアで剥離した細胞を再懸濁し、血球計およびトリパンブルーを用いて数えます。 50万トンの間で使用します細胞株に応じて、CAM上に移植するための2,000,000細胞O。予備実験で適切な数を最適化します。 </li><li> 5分間500×gで適切な細胞数と遠心分離のために必要な測定量。 </li><li>上清を捨て、次いで、PBS ++の40μLと基底膜の混合物の20μLに細胞ペレットを再懸濁します。 注：細胞/基底膜の混合懸濁液に再懸濁することにより実験のために必要に応じて、この時点で、細胞は、薬物または他の試験薬剤で処理することができます。あるいは、薬剤は、移植後の細胞/基底膜の混合懸濁液にピペッティングすることができます。 </li><li>層流フード内でインキュベーターと場所から卵と卵のラックを取得します。 </li><li>ウィンドウのオフピールテープ、滅菌ピンセットを用いて低温バイアルのキャップから1ミリメートルのシリコンリングを取得し、窓からリングをドロップします。 </li><li>ピペットでPBSの60μlの細胞溶液++および基底膜mixtur電子直接、CAM上に載っているシリコーンリングの中心部へ。 </li><li>ウィンドウを再テープとバックインキュベーターに卵のラックを移動します。この時点で、卵を移動する際、リング、細胞懸濁液として十分注意してください、簡単に変位することができます。 </li><li>腫瘍は5〜7日間増殖できるようにします。 </li></ol> 4.収穫腫瘍<ol><li>フード内の下パッドに置きます。組織学のために必要に応じて、35×10 mmプレート及びパラホルムアルデヒドコンテナを準備します。各35×10ミリメートルプレートに1mlのPBS ++を入れてください。 </li><li>フード内でバイオハザードバッグを置きます。無菌解剖はさみを取り、刻印端付近の穴に卵の中に先端を挿入します。 </li><li>縦方向全体の卵の周りをカットします。 注：リング付きCAMおよび腫瘍は、ウィンドウを持つシェルの上半分に固執する必要があります。 </li><li>解剖ハサミとピンセットを使用して、離れたCAMから腫瘍を分析し、35×10ミリメートルプレートに腫瘍を配置します。測定し、腫瘍の重量を量ります。 paraformaldehyで修正された腫瘍その後、脱パラフィン - 埋め込み、それらを組織学および免疫組織化学の実験で使用するため。 </li></ol> 5.（オプション）：腫瘍細胞解離<ol><li> 35×10ミリメートルプレートに腫瘍をミンチする解剖ハサミを使用してください。 15mlの遠心チューブにみじん切り腫瘍を注ぎ、ピペッティングを介して可能な限り多くのPBS ++を削除します。 </li><li> （PBS中1mg / mlの++）コラゲナーゼの2ミリリットルを加え、数回にわたってチューブを回して、（数時間まで）、少なくとも37℃で30分間チューブをインキュベートします。 </li><li>各チューブに5ミリリットルのメディアを追加し、ダウン20ピペッティングにより完全に再懸濁 - 40倍。徹底したピペット操作は、完全な細胞解離のために重要です。 </li><li>沈殿物が沈降することを許可し、上清を新しいチューブに移します。 5分間500×gで遠心分離します。解離細胞ペレットを残し、上清を取り除きます。 注：この時点で、細胞ペレットは、種々の実験のために使用することができる（フローサイトメトリー、ウェスタンブロッティング、RNAの単離などで使用するために溶解します）。全腫瘍細胞数はまた、血球計およびトリパンブルー染色を用いて得ることができます。小さく、楕円形の細胞は、CAMからの鶏の細胞であり、腫瘍細胞としてカウントすべきではないことに注意してください。腫瘍は慎重に、CAMから離れて解剖されている場合は非腫瘍（CAM）細胞の混入の最小数があるはずです。 </li></ol>

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</ol>

A.S.は、Advaxis Pharmaceutical社から資金提供を受け、研究者主導の臨床試験を支援しています。

このプロトコルのいくつかの重要なステップは、ほとんど改善された胚の生存率だけでなく、腫瘍増殖の信頼性向上を占めています。気嚢に吸引を適用することにより、離れたシェルからCAMを削除すると（卵、鈍的切開などからアルブミンを除去するために、針を使用して）他の既存の方法よりも低侵襲性です。この方法のために必要な2つの小さな穴を作成するために、無菌のプッシュピンを使用すると、プロトコルの最も挑戦的な部分です。あまりにも多くの力を使用すると、プッシュピンをオーバー浸透を通じてCAMとその血管系に損傷を与えることができ、さらには卵を割れや破壊をもたらすことができます。ハンズオン非受精し、食料品買った卵に小さな穴がCAMを落とすの最初の試みの間のミスを最小限に抑えることができます作るためにプッシュピンを使用して練習。さらに、エタノールまたはシェルを清掃するために、他の殺菌剤溶液の使用は、胚の生存率を減少させ、避けるべきです。最後に、無菌のシリコーンリングを使用することに＆＃8220;腫瘍増殖のアシストを播種後1特定の場所にある腫瘍細胞」畜舎や腫瘍の高い率に貢献するには、我々のプロトコルで見てください。 <p class="jove_conte...

肝細胞癌（HCC）は、世界1におけるがん死亡率の3 番目の主要な原因です。現在、HCC患者のわずか30％が治癒の可能性の外科的治療2、および全身化学療法の対象となる3有効ではありません。そのため、新たな肝細胞癌治療のための押し満たされていない臨床的必要性、および新しい薬剤の効率的な試験に適したモデル系の開発があります。ニワトリ絨毛尿膜（CAM）アッセイは、再現可能な、費用対効果、及びインビボでの潜在的な抗腫瘍薬を試験する迅速ミディアムスループット方法を提供します。 CAMアッセイは、血管新生4を研究するために広く使用されています。また、正常神経膠芽腫5、6膵臓癌、黒色腫7-9、および骨肉腫10-11含む、癌の腫瘍異種移植片モデルに開発されました。どちらOVO 12とEX卵内13の技術は、プロトコルからのプロトコルに様々な詳細は、文献に利用されてきました。 50％11-14 - CAM異種移植モデルに対する一つの大きな課題は、25に至るまで公表されたニワトリ胚死亡率で、卵の操作後胚死亡の発生率が比較的高いです。 この記事では、我々は確実に組織学的に未分化HCCに似ている三次元の、血管新生化腫瘍の増殖を生産HCCの卵内異種移植モデルの開発について説明します。まずオソウスキら 14によって記載されたプロトコルを適応していると非常に高い腫瘍の生着に93％までのヒヨコ胚の生存率を達成しています。

<table><tbody><tr><td>プレミアム孵化卵</td><td>チャールズリバー</td><td>N/A</td><td>http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx</td></tr><tr><td>卵インキュベーター</td><td>GQF</td><td>Hova-Bator 2362N</td><td></td></tr><tr><td>回転卵トレイ</td><td>GQF</td><td>1611 自動エッグターナー</td><td></td></tr><tr><td>エッグキャンドラー</td><td>リヨン</td><td>ハイパワー 950-070</td><td></td></tr><tr><td>ドレメル 100 回転工具 15/16 カットオフホイール付き</td><td>ドレメル</td><td>100-N / 7</td><td></td></tr><tr><td>滅菌鉗子、プッシュピン、解剖はさみ、スコッチテープ</td><td></td><td></td><td></td>、</tr><tr><td>マトリゲル</td><td>BDバイオサイエンス356234</td><td></td><td></td></tr><tr><td>極低温バイアル、シリコーンワッシャー付きおねじ</td>コー<td>ニング</td><td>430659</td><td></td></tr>クロス<tr><td>トリジウムヒストリチカムのコラゲナーゼ</td><td>シグマ</td><td>C9891</td><td></td></tr></tbody></table>

ザ・<em&gt;卵内</em肝細胞癌の効率的な異種移植モデルとして&gt;ニワトリ絨毛尿膜（cam）アッセイ

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

ヒヨコ漿尿膜（​​CAM）は、CAMはその腫瘍の移植のための理想的なシステム作り、自然免疫及び高度に血管新生である受精後7日目までに開発を開始し、12日目により成熟します。さらに、CAMはその腫瘍の浸潤や転移を研究するための魅力的なモデル作り、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、インテグリンα（v）のベータ3、およびMMP-2のような細胞外マトリックスタンパク質が含まれています。科学者は、長い血管形成のモデルとして使用することによってCAMの生理機能の利点をとっています。より最近では、CAMアッセイは、基本的なインビトロでの作業がより複雑な動物癌モデル間のギャップを埋めるために、種々の癌のインビボ異種移植モデルシステムとして動作するように変更されています。 CAMアッセイは、コストと時間が効果的である生物学的に関連するシステムにおける腫瘍増殖、抗腫瘍療法、およびプロ腫瘍分子経路の研究を可能にします。ここでは、CAMのXenの開発を説明最大93％の胚の生存率と肝細胞癌（HCC）のograftモデルと信頼性の腫瘍は、三次元の、血管新生化腫瘍の成長につながる取ります。

プロトコルにおける重要なステップの代表的な画像がここに表示されます。 図1（a）は、胚、気嚢、およびCAMの血管系を可視化するキャンドラーの使用方法を示します。 図1B-1Cは、することによって、CAMをドロップするプロセスを示します二つの穴と、その後の安全電球を使用して負圧を加えると、 図1Dが正常に鉛筆でマークされた穴の下に大きな気泡とCAMを落とし示したものである。 図1E及び図1Fは、必要に応じて行うためにDREMELロータリーツールの使用法を示します気泡と内に露出血管新生し、CAMとのシェルで開いたウィンドウ上のシェルの削減。 三次元の血管化腫瘍は、正常ヒトHCC細胞株HUH7（ 図2A-2B）及びPLC / PRF / 5（ 図2C-2D）を使用して成長させました。 HUH7とPLC / PRF / 5細胞から増殖した腫瘍こんにちはst...

ニワトリ絨毛尿膜(CAM)は免疫不全で高度に血管新生されているため、腫瘍の成長と血管新生の自然なin vivoモデルとなっています。このプロトコルでは、CAMアッセイを使用して3次元の血管新生肝細胞がん(HCC)腫瘍を増殖させる信頼性の高い方法について説明します。

ザ・<em&gt;卵内</em肝細胞癌の効率的な異種移植モデルとして&gt;ニワトリ絨毛尿膜（CAM）アッセイ

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

この実験の全体的な目的は、肝細胞癌の信頼性の高いCAM異種移植モデルを構築することです。まず、接種に向けて卵を孵卵させます。次に、卵の漿膜および卵黄嚢膜（CAM）を脱落させ、卵殻に窓を開けます。次に、腫瘍を成長させるため、卵殻のウィンドウを通じてヒト肝細胞癌細胞を接種します。その結果、ヒト肝細胞癌細胞株を用いて、三次元的な血管新生を伴う腫瘍を正常に成長させることができました。本プロトコルを用いることで、最大93%の胚生存率が達成されました。マウス腫瘍モデルなどの他のin vivo手法と比較したCAMアッセイの主な利点は、実験期間が短いこと、実験コストが低く抑えられること、そして再現性が得られやすいことです。CAMアッセイは、血管新生、腫瘍、細胞浸潤、および転移の研究に利用できます。また、低分子化合物や薬剤が腫瘍の成長および発達に及ぼす影響を判定するためにも使用可能です。卵の準備には、検卵、血管系の特定、気室付近および卵頂部への液漏れさせない小孔の穿孔など、さまざまな工程が含まれるため、本手順を視覚的に提示することが重要です。卵殻を割らずに窓を開口させることや、すべての工程を通じて胚が損傷していないことを確認することは、初心者にとって困難な場合があります。まず、配置します。スタンプされた端を上に向けて回転式卵トレイに配置した、胚齢8日の特定病原体不在（SPF）在来鶏卵を用意します。回転トレイを36 °C、湿度50%に設定した卵インキュベーターに入れ、48時間孵化させます。孵化後、卵をスタンプされた端が上になるように卵ラックに配置し、ラミナーフローフード内に設置します。室内の照明とフード内の照明を消し、卵のスタンプがある側をエッグキャンドラーに軽く当てて、CAM（絨毛尿膜）として知られる雛の脈管系と気室を露出させます。2本の主要な血管の間に鉛筆で印を付けます。次に、スタンプがある側の気室上の卵の先端に1か所目の穴を開け、鉛筆で印を付けた箇所に2か所目の穴を開けます。滅菌済みのプッシュピンを用い、深さ約3 mmの穴を開けます。セーフティーバルブ内の空気を押し出し、バルブの開放端を気嚢（エアサック）上の穴にしっかりと押し当てます。バルブをゆっくりと放して吸引し、鉛筆で印をつけた穴から空気を吸い出すことで、カムを殻から離して脱落させます。検卵器を用いて、気室が卵の刻印のある端から鉛筆で印をつけた穴へと移動したことを確認します。移動していない場合は、両方の穴をわずかに深くし、安全バルブで再度吸引します。次に、1/16インチのカットオフホイールを取り付けたロータリーツールを使用し、卵を片手で保持します。カムに触れないように、殻に対して2本の横方向の切り込みを入れます。切り込みの長さは2 cmとし、間隔を1 cm空けてください。次に、2本の横方向の切り込みの両端で、カットオフホイールを殻に軽く接触させながら、縦方向に切り込みを入れます。滅菌済みピンセットを殻の破片の下に平行に差し込み、殻を除去します。ピンセットで破片を掴み、きれいに取り除きます。テープの一端を折り返して持ち、卵の開口部を覆うように貼り付けます。卵をエッグトレイに入れ、接種前の2〜3時間以内まで、回転させずにインキュベーター内にセットします。接種の準備として、重合を防ぐためにMatrigelなどの基底膜タンパク質混合物を氷上に置きます。次に、フラスコあたり2 mMのEDTA溶液を4〜5 mL使用して腫瘍細胞を剥離させ、フラスコを組織培養インキュベーターに5分間置きます。剥離した細胞を培地で懸濁し、細胞数をカウントします。細胞株に応じて、CAMへの移植に500,000個から200万個の細胞を使用します。次に、適切な細胞数を得るために必要な容量を新しいチューブに移し、5分間遠心分離します。500 ×gで遠心分離し、上清を捨てて細胞ペレットを再懸濁します。再懸濁には、カルシウムおよびマグネシウムを含むPBS（PBS++）40 µLと基底膜混合液20 µLを使用します。この時点で、薬剤やその他の試験剤を細胞懸濁液に添加することが可能です。次に、エッグトレイをラミナーフローフード内に設置します。卵のテープを剥がし、凍結保存バイアルから1 mmの滅菌済みシリコンリングを取り出し、開口部を通してカムパイプ上に落とします。細胞、PBS++、および基底膜混合物の60 µL溶液をシリコンリングの中央に注入し、ウィンドウを再度テープで固定して、エッグトレイを慎重にインキュベーターに戻します。腫瘍を5〜7日間成長させます。腫瘍を採取するため、フード内にアンダーパッドとバイオハザードバッグを準備します。組織学用に、1 mLのPBS++を含む35 mm × 10 mmのプレートとパラホルムアルデヒド容器を必要数準備します。滅菌した解剖用鋏の尖端を、スタンプのある末端付近の穴から卵の中に挿入し、卵の全長に沿って切開します。これにより、リングを伴う腫瘍とカムが、開口部のある殻の上半分に付着した状態になります。解剖用器具、鋏、およびピンセットを用いて、CAMから腫瘍を摘出し、35 mm × 10 mmのプレートに移します。腫瘍の大きさを測定し、重量を量ります。組織学的検査および免疫組織化学的実験に使用するため、腫瘍をパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋します。腫瘍を採取した後、解剖用ハサミを用いてプレート上で腫瘍を細かく刻みます。次に、刻んだ腫瘍を15 mL遠心チューブに移し、ピペッティングによってPBS++を除去します。PBS++で調製した1 mg/mLのコラゲナーゼ溶液を2 mL加え、チューブを数回反転させて混ぜ合わせます。チューブを37°Cで少なくとも30分間、最大で数時間インキュベートします。次に、5 mLの培地をチューブに加え、ピペッティングを20〜40回行い、十分に混合します。これは、細胞を完全に解離させるために不可欠な工程です。沈殿後、snatを新しいチューブに移し、500 ×gで5分間遠心分離し、上清を除去して解離した細胞ペレットを残します。HUH-7腫瘍細胞をCAMに播種すると、リング内に血管化した腫瘍が確認されました。5日間の培養後、CAMアッセイによるHUH-7腫瘍の組織学的検査の結果、腫瘍細胞は未分化な肝細胞癌細胞に類似していることが示されました。本手法を用いる際は、細胞種や薬剤が異なる場合に、一定の最適化が必要になる可能性があることに留意してください。例えば、一部の細胞株では、3次元腫瘍を形成させるためにより高い、あるいはより低い細胞密度が必要となる場合があります。

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ひよこ絨毛尿膜の収穫:鶏卵から腫瘍移植片含有絨毛膜を単離する方法

ザ<em&gt;卵で</em肉腫のためXenograftmodelとして&gt; CAMアッセイ

ペリニューラル侵来は、頭頸部扁平上皮癌および他の腫瘍に対する積極的な表現型である。ひよこ絨毛膜モデルは、血管新生、癌の侵入、転移の研究に使用されています。ここでは、このモデルを生体内のペリニューラル侵入を評価するためにどのように利用できるかを示します。...

頭頸部癌のペリオラル侵食を評価する生体内モデルにおけるひよこチョリオアラントIC膜

転移性透明細胞腎細胞癌は、徹底的な前臨床調査のための包括的な動物モデルのない疾患である。このプロトコルは、この疾患の2つの新しい動物モデルを示している:異所的に移植されたマウスモデルと鶏絨毛アラント膜モデルは、いずれも臨床症例に似た肺転移を示す。...

マウス腎臓と鶏絨毛性膜に確立された転移性透明細胞腎細胞癌モデルの比較

我々は、婦人科および泌尿器科癌細胞株および患者由来腫瘍の生着のための代替、移植可能なインビボモデルとして鶏絨毛アラント膜モデルを提示する。...

生体内における鶏絨毛性膜モデルを用いて婦人科癌と泌尿器科癌を研究する

このプロトコルでは、造影剤増強超音波イメージングとマイクロバブル媒介薬物送達を研究するためのin...

造影剤増強超音波イメージングおよびマイクロバブル媒介薬物送達研究のためのin vivoモデルとしてのニワトリEx Ovo胚および絨毛尿膜血管の調製

ここでは、ヒト卵巣組織のニワトリ絨毛膜(CAM)異種移植モデルを開発するためのプロトコルについて説明し、技術の有効性、移植片血行再建術の時間枠、および6日間の移植期間にわたる組織の生存率を示します。...

卵巣組織移植を研究するためのツールとしてのひよこ絨毛膜(CAM)モデル

学ぶニワトリ絨毛尿膜（CAM）アッセイによる肝細胞がん（HCC）の血管化腫瘍モデル構築法。ヒトHCC細胞を卵内に移植し、生存率93%で三次元腫瘍を形成する技術を習得できます。

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