Name: の栽培 Heligmosomoides Polygyrus：免疫調節虫寄生虫とその分泌製品 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: 学ぶHeligmosomoides polygyrusの培養法と分泌産物の回収技術。マウス腸管から成虫を分離し、組織培養で免疫抑制性ES分子を収集・濃縮する方法を解説。アレルギーや自己免疫疾患治療への応用可能性を探る。

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著者は、エジンバラ臨床アカデミックトラック(C.J.C.J.)およびプログラム助成金(Y.H.およびR.M.M.)およびフェローシップ(J.R.G.)の資金提供を通じてウェルカムトラストから資金提供を受けており、BBSRC(G.C.)、アメリカ喘息財団(E.R.、H.J.McS.およびR.M.M.)、英国喘息(H.J.MCS.)、およびレイニン財団(D.J.S.およびRMM)を通じて資金提供を受けています。

注：このプロトコルですべての手順は、英国内務省とエディンバラ獣医サービスの大学が定めたガイドラインに従って行われる。 強制経口マウスの1。感染<ol><li> 4℃で6ヶ月までのための蒸留水に保管Heligmosomoides polygyrus L3幼虫。 </li><li>使用前に、L3幼虫を蒸留水で3回洗浄：（ブレーキ付）10分間300×gで遠心分離し、水500μlのが、すべてを削除（ペレット化L3幼虫を乱さないように）、ペレットたびに懸濁します。 </li><li> 3回目の洗浄のために、その開口部を広げる正確なボリューム（通常は40ミリリットル）と吸引200μlの先端カットで20μlに水を加える。 60mm培養皿の表面にある2つの20μlのサンプルを配置し、（通常はモバイル、最高の解剖顕微鏡で50倍の倍率で見て）L3幼虫を数える。 concentratio蒸留水で最終ペレットを再懸濁1mlあたり2000 L3幼虫のN。 </li><li>ライフサイクルの生産のために、8週齢のF1（C57BL / 6xCBA）マウスは、400 H.で感染経口胃管栄養法により蒸留水200μl中polygyrus L3幼虫（首筋によって直立位置でマウスを拘束し、静かに胃に口や食道を通っ鈍い強制経口針を渡す）。攪拌各感染症（幼虫は水に迅速に解決する）と吸引1mlシリンジで200μlの前に十分。丸みを帯びた端部を有する専用の強制経口針を使用しています。 （6〜8週齢）若いマウスの実験的感染、または他の近交系（ 例えば 、C57BL / 6またはBALBC）の場合は、200 L3幼虫をマウスに感染させる。 </li></ol> 2.伝播とHのメンテナンスpolygyrus <ol><li>大型プラスチック浴槽の中央に炭を置き、冷たい水道水を最低30分間​​その上で実行できるようにする（未洗浄活性炭は、L3幼虫に対して毒性である）。水槽から水を排出し、T ON炭を置く吸収紙の層WO、それが完全に乾燥するまで室内空気にさらされたまま。 </li><li>卵が必要な場合は（必要に応じてハサミ）、最初の鉗子とコロンから糞をこすり。 L3幼虫の多数が必要な場合、ワイヤーグリッド上にマウスを置き、数日間の糞を収集する。 </li><li>濾紙に付着するのに十分なだけ、湿った一貫性を達成するために、1：1以上の割合で造粒炭と糞便を混ぜる。ペトリ皿にいくつかの湿らせたろ紙の中央に薄い層を塗抹し、12〜14日、暗所で（一部の湿ったペーパータオルと水の一品を追加）湿潤箱にこれを配置します。 </li><li>以降7日目からL3幼虫を外し、紙が廃棄される前に、少なくとも2の機会をそれらを集める。幼虫はろ紙のエッジの周りにリングを形成する。ペトリ皿から濾紙を持ち上げて、50mlのチューブに（ピペット、プレートあたりの滅菌水5mlを用いて）、プレートの左右され幼虫をすすぐ。 </li><li>リフトろ紙から、残りの幼虫を収穫を50mlチューブに蒸留水を用いてプレート上に残した。 10分間300×gで流出溶液を遠心します。蒸留水で幼虫を3回洗浄した後、必要になるまで蒸留水の最大50ミリリットルで、4℃で保存する。 注：幼虫が生存したままで少なくとも6ヶ月間感染性。 </li></ol>大人Hの3コレクションpolygyrusワーム<ol><li> 図1に示すように、事前に修正されたベールマン装置を準備します。 </li><li> 14日、感染後カルマウス。 </li><li> 70％エタノールで腹部を洗ってください。腹部の皮膚をカットし、前腹壁を明らかにするために引き戻す。腹膜腔を入力するように正中切開を行います。 </li><li> （遠位直腸への近位十二指腸から）全体の小腸および大腸を削除します。ドライペトリ皿に置きます。 </li><li>その全長に沿って腸をまっすぐに。消費税​​糞含有コロン。後で卵の準備のために別々の皿にこれを置く。 </li><li>物品税によるもの腔内ワームに十二指腸の比較的厚い壁と、多くの場合、赤の出現によって-identified成虫が含まれている小腸の近位20センチメートル。ハンクスソリューションを5 mlの（直径100mm）ペトリ皿に置き、37℃（ディッシュあたり2つの試料）に温めた。 </li><li>ハサミで縦方向にワームで満たされた近位腸の部分を開きます（ラウンドエンド型ハサミはこのために最善である）、およびワームを削除するには2枚のスライドガラスライニング腸の内側にダウンこすり。その後、きれいな腸壁を捨てる。 </li><li>小さ ​​なモスリン袋にヒントワームは、主食は閉じられ、ガラス漏斗（ 図1）のエッジの周りペーパークリップで固定します。 </li><li>ハンクス液で漏斗を記入し、それぞれの漏斗内にワームの約4ペトリ皿を追加します。 </li><li>優しく除去するために通過途中を攪拌する1〜2時間、37℃のインキュベーター内の場所装置、モスリンフィルタを閉塞することができる腸の準備から破片。モスリンバッグ外側の破片の流出を避けるために注意してください - これは、最終的なHES製剤の汚染の原因となります。成虫はゆっくりモスリン布を通って移動し、ガラス試験管の底に沈降している必要があります。慎重にシンク（この時点でワームを失わないように注意しながら）経由で接続ゴムホースから試験管を取り外してください。 </li><li>プラスチックピペットを用いて、50ミリリットルチューブにワームを転送し、 &#39;（ワームは、重力との和解stripetteでメディアを取り出し、ハンクスの40ミリリットル追加できるようにソリューション」ソリューションと5回繰り返す）ハンクスで6回洗う。 注：このワーム文化はこれ以降から無菌に保つ必要があります。 <ol><li>層流フードに移動し、100 U / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシン、 インビトロ培養の準備ができて補充した無菌ハンクス液で別の6回洗浄する。 </li></ol></li><li>カウントその開口部を拡大する黄色の先端カットに取り20μlの二つのサンプルを取ることによって回収成虫。接種した幼虫の量の約50％を期待しています。 </li></ol>培地調製、成虫を洗浄：4. HESのための文化を設定する<ol><li> RPMI約10mlの3.11から虫を浸すワームが完全に覆われるようにする角度でチューブ止まり、20分間、10％のゲンタマイシンを補充した。 </li><li>層流フードでこれを実行します（5 U / mlペニシリンおよび5μg/ mlのストレプトマイシンを補充）ハンクス液で再び6回洗浄する。 </li><li> H.を準備polygrus媒体 。 </li><li> 100倍Peniclllin - ストレプトマイシン（最終濃度5 U / mlペニシリン、5mlの、（RPMI1640 0.2％グルコースを含有するもので、最終濃度1.2％）45％グルコース11.1ミリリットル追加、RPMI1640の500mlに、層流フード内で無菌性を維持する5μg/ mlのストレプトマイシン）、L-グルタミン（最終濃度2mM）を5mlの、及びゲンタマイシン（最終濃度1％）を5ml。 FCSを追加しないでください。 </li><li>通気T25フラスコにアリコートワーム、約。 15ミリリットルH. 1,000ワームpolygyrusフラスコ当たり媒体、及び37℃のインキュベーター（5％CO 2）3週間で直立場所。 </li></ol> HESの5。準備<ol><li> （ - 別々に処理または廃棄することができる起因するLPS混入と宿主タンパク質の高レベル）培養24時間後の最初のコレクションはさておき設定、もはや週2回以上の間隔で培養物からHES含有培養培地を収集します。個別の各コレクションを維持し、明確に日付とバッチ番号で標識した。 H.等量のと交換してください各機会にpolygyrusメディア 。 </li><li> 5分間400×gで遠心HES含有培地。その後、50ミリリットルチューブに0.2ミクロン低タンパク質結合フィルターを通して滅菌ろ過する。 -20℃の冷凍庫に保管しては明らかにHES cのワームの収穫の日付と日付で標識したollection。 </li><li>培養物からHESコレクションの21日後に、ワームを捨てる。 </li><li> （通常、凍結ストックから、そして最初の24時間のコレクションを含まない）と窒素圧力下で限外濾過装置で3000 MWCOフィルター上で濃縮するHES上清のプール500〜1,000ミリリットル。 注：フィルタの実行を乾燥させるないように注意してください。 <ol><li>フィルタ装置を設定するには、最初に撹拌しながら3×20分間蒸留水で1リットルのビーカーにダウン3 kDaの膜光沢のある側を洗う。フィルター膜光沢のある面を上にして、製造業者の指示に従って限外ろ過装置を組み立てます。 4℃でのキャビネットに置き、そしてプールHESを濃縮するために開始する前に通って蒸留水50mlを渡す。 </li><li>必要に応じてボリュームが2〜5ミリリットルに濃縮されるまで、（1日100〜140ミリリットル）濾過装置にHESの各チューブを追加します。 </li></ol></li><li> HES含有培地から汚染物質を除去するために、pyrで50mlのを追加その後、濾過装置にフィブリノーゲンを含まないPBSとし、約2mlまで濃縮する。二回（合計でPBSの150ミリリットル）、この手順を繰り返します。フィルタは、層流フード内（0.2μmフィルターで）滅菌し、分光光度計を用いてタンパク質濃度を測定し、15mlチューブにHESを移す（E 280 = 10）またはBradfordアッセイによって。 </li><li>アリコート、バッチ番号と日付ラベル、および-80℃で凍結する。 </li><li>使用前にHESの各バッチに、製造業者のプロトコールに従って、発色性LALアッセイを行う。 LPSレベルは1μgタンパク質あたり1 U LPSよりも大きい場合には、in vivoでの実験のためにまたはインビトロ培養において 、このバッチを使用しないことを検討してください。 </li><li>同様に、別々に24時間後に収集したHESを処理します。それは、機能の実験には適していないが、それはモノクローナル抗体の親和性精製によって単離することができるよう、個々の分子の有用な供給源であり、LPSおよびいくつかの宿主タンパク質を含有します。 </li></ol&gt;

著者には利益相反はありません。

H.のライフサイクル確実に一貫性のある方法でpolygyrusが進行する。 0日目に自然な摂取またはL3幼虫の強制経口投与に続いて、嚢胞は幼虫の脱皮に進み、5日目までに十二指腸漿膜下に形成し始め、その後10日目から腸管内腔に成虫として浮上し、卵は糞便で見ることができます14日目および肉芽プロトコルは、上述の（および図6にまとめた）Hの高スループット生産を可能にする21日目から十二指腸の漿膜表面上に表示され今後の実験的およびライフサイクル·感染症のための実行可能なL3幼虫の信頼性回復に加えてpolygyrus排泄·分泌産物（HES）、。 H. polygyrus感染は、OVAまたはのDer p 1を（ハウスダストダニアレルゲン）14依存性喘息のモデルにおいて保護的であることが示されている。さらに、気道炎症の抑制は、CD4 + CD25 +で転送することができ</suのp&gt;調節性T細胞は、14またはCD19 + CD23 ハイ調節性B細胞からの24 H.、非感作polygyrusは、マウスを感染した。自己免疫のモデルでは、H。 polygyrus感染 、多発性硬化症9の実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）モデルにおける抑制性であることが示されており、および抑制は、感染したマウス24からのCD4 + T細胞またはCD19 + B細胞のいずれかを転送することができる。 Heligmosomoides polygyrus排泄·分泌産物（HES）宿主免疫応答を調節し、（ 図7で概説）多数の機構によってTh2に仲介される炎症を抑制、を含む：刺激25への樹状細胞応答性のa）の阻害、CD4のb）の誘導+のFoxp3 +制御性T細胞18。およびc）IL-33の産生20の遮断を。投与された場合HESは保護的であることが示されているTの感作またはチャレンジ喘息19のOVA-ミョウバンモデルでも初期のIL-33の放出の抑制を通じて、ルナリアエキスアレルゲン20を鼻腔内投与した場合。 HESのLPS汚染の回避は、多くの場合、将来の免疫学的実験の成功のために重要です。ここで説明したプロトコルでは、これを達成するための重要なステップは、（2.10を参照）、培養の最初の24時間別にESソリューションを設定するために、最終的なHESの準備に入らないベールマン装置のモスリンバッグ内に含まれるその破片を確実にするためである（5.1を参照）。 ここ数年、HESは徹底的に370以上の異なるタンパク質とプロテオミクスレベルで特徴づけられている26,27を同定した。また、第4段階の幼虫からのESはプロテオーム解析28が施されている。進行中の作業は、3強力に免疫原性であることが知られているHESの主要グリカン成分を特徴付ける含み、マイクロRN分泌そのは50〜100 nmの小胞またはエキソソーム（降圧ら 、公表のために提出された）でカプセル化されたよう。この高度に免疫調節寄生虫から、とHESの分子成分を特定する大規模なプロテオミクスデータを持つESの収集のための再現可能なプロトコルの設立により、ステージは今の識別およびH.から個々の分子の治療的テストのために設定されている宿主免疫系のキー効果を媒介することができますpolygyrus。

Heligmosomoidesのpolygyrusは密接に高度に普及している人間の線虫寄生虫1に関連している天然のネズミ胃腸蠕虫である。そのようなNippostrongylusパラゴムノキ、H.など、他の線虫モデルとは対照的にpolygyrusは一貫して、それが宿主の免疫応答2を抑制するために採用して、複数の強力な免疫調節機構の直接の結果として、マウスにおける慢性感染を確立します。 H.のpolygyrusは、直接ライフサイクルがあります：彼らは腸管腔に戻る前に十二指腸及び被嚢の漿膜層に移動、そこで感染性L3幼虫は、FeCo系経口送信（または実験室の設定で強制経口投与）によって摂取される約8日最初の感染後に成虫。交尾と卵の生産は、10日目によって発生し、それがDAから排泄-の分泌産物の文化や収集のための大人のワームを収穫することが可能であるY 14年以降3。H. polygyrusまた、感染感受性マウス4-6の存在増加乳酸菌、及びHのレベルの増加と、共生微生物相と相互作用し、乳酸菌6匹のマウスの暴露後のpolygyrus感染。 H.と活動性感染polygyrusは、自己免疫7-10の多くの動物モデルにおいて免疫病理から保護することが示されており、11,12及びアレルギー13-16大腸炎。その結果、生体内17,18に病理をダウン調節するこの寄生虫（「HES」）から排泄分泌分子の潜在的に大きな関心が集まっている。確かに、保護効果は今18,20が特定されている経路を介してHES製品19を用いたマウスの治療後に見られている。ここでは、その分泌された製品の信頼性のあるHeligmosomoidesのpolygyrusの生産と回復のためのプロトコルを記述それはさらに、機能的、生化学的および免疫学的研究の範囲のために利用することができる。

<table><tbody><tr><td>アミコン濃縮器</td><td>ミリポア</td><td>5112</td><td>モデル 8050 50 ml http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM _NF-5122</td></tr><tr><td>ハンクス緩衝塩溶液</td><td>Sigma</td><td>H9394</td><td>500 ml http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&region=GB</td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td>100 ml http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>200 MM 100ml https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081</td></tr><tr><td>活性炭</td><td>Merck</td><td>1.09624.0500</td><td>18-35 mesh http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624</td></tr><tr><td>グルコース溶液</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td>100 ml 45% solution http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&region=GB</td></tr><tr><td>Falcon チューブ</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>50 ml http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon</td></tr><tr><td>T25 フラスコ</td><td>Sigma</td><td>CLS430639&nbsp;</td><td>25cmベントフラスコ http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&region=GB</td></tr><tr><td>発色性LALアッセイ</td><td>ロンザ</td><td>50-647U</td><td>QCL-1000 assay http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>Gibco</td><td>15710-049</td><td>100 ml http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072</td></tr><tr><td>ロズウェルパーク記念研究所 (RPMI) 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>500 ml、L-グルタミンなし http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093</td></tr></tbody></table>

の栽培<em&gt; heligmosomoides polygyrus：</em&gt;免疫調節虫寄生虫とその分泌製品

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides（また以前Nematospiroidesのdubiusとして知られており、H. bakeriなどの一部によって参照）polygyrusマウスにおける慢性感染を確立するために、複数の免疫調節メカニズムを採用し、密接に普及している人間の蠕虫感染症に似ている胃腸蠕虫である。H. polygyrusは蠕虫由来の免疫調節の分野で広く研究されており、強力アレルギーおよび自己免疫の実験モデル（活動性感染および単離された分泌産物の両方）を抑制することが見出されている。このホワイトペーパーで説明されたプロトコルは、Hの管理を概説彼らの排泄·分泌産物（HES）の一貫性のL3幼虫の生産、大人の寄生虫の回復、および収集のためpolygyrusライフサイクル 。

H.による感染に対する感受性polygyrusマウス株（ 表1）の遺伝的背景によって大幅に制御される。 C57BL / 6およびCBAマウスは、21,22非常に敏感である。寄生虫のライフサイクルの維持には、これら2つの株の間F1ハイブリッドは、いずれかの親株と比較して、病的状態（過度の腸上皮損傷）なしにはるかに高いワーム負担に耐える能力のために選択されている。 200 L3幼虫の投与量は、一般的にホモ接合近交系（ 例えば 、C57BL / 6の実験のために使用されている間400 L3幼虫の経口胃管栄養法は、F1マウス（ 図2に示されている成体ワームの負担を生じる）でライフサイクルを維持するために使用されまたはBALBC）。しかし、この投与量は、腸内細菌叢の変化などの動物施設、間で異なることが環境的コファクターに応じて減少する必要があるかもしれません。 HESのバッチは、再現可能なEFFIを証明した機能アッセイおよびタンパク質組成でcacy。培養の各連続週間からの上清は、4週間の合計まで、分析したとき、さらに、タンパク質のプロファイルは非常に類似していることが見出された（ 図3）。HES濃度をBradfordアッセイ（5.5を参照） を 、合計することによって測定した場合タンパク質は、通常、約1 mg / mlで（ 図4）。 HESを濃縮する別の方法は、サンプルは、緩衝塩および低分子量成分を除去し、スイングアウトローター遠心機で最大4,000 gで回転させた遠心濃縮器（例えばビバスピン3-kDaカットオフ膜）である。遠心濃縮は、小さな処理量（1〜10 ml）のに最適であり、約30倍の最大濃縮係数に制限されています。 HESを収集する際、汚染の回避が重要です。ホスト分子の混入を避けるために、HES-続きを捨てるマウスの腸からの成虫の収穫後の最初の24時間の培養培地をaining。また、色素産生LALアッセイ（5.7を参照）HESの各バッチにおけるLPS汚染のレベルを定量化する。 LPSの1 Uは、〜100 pgのLPSに相当し、これ以下のレベルは23無視できると考えている。私たちの手では、HESのほとんどのバッチがこの限界より大きく、0.23 U /μgのものHES中のLPSの平均濃度（ 図5）である。病理学のin vivoモデルにおいてLPSの効果は、（例えば、喘息応答の抑制）がLPS 23の少なくとも10 ngのを必要とする。したがって、100 PG LPS /μgのHESとバッチから5μgのHESのインビボ投与 500のPG LPS、よく下のLPSが問題となる有効濃度が含まれます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig1highres.jpg" /> 図1：ベールマン装置 ·ベア大人のHの収集のためのマン装置のセットアップpolygyrus（セクション2で説明したように）。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig2highres.jpg" /> 図2：14日間400 L3幼虫平均ワームの感染後の平均ワーム負担は 14日400 L3幼虫を感染させた後負担。示したデータポイントは、C57BL / 6xCBAマウスの感染の19の別々のラウンドからのものである。 ±SEMを示す意味。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig3highres.jpg" /> 図3：文化の連続した週に集めHESタンパク質の文化のSDS-PAGEプロファイルにおける連続数週間から数HESのタンパク質プロファイル 。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig4highres.jpg" /> 図4： </s·チョン&gt; 500ミリリットルのES-含む培養上清の約500ミリリットルに由来し、11の異なるバッチからHESタンパク質のメディア収量からHESの最終数量 。 ±SEMを示す意味。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig5highres.jpg" /> 図5：リムルスameobocyteアッセイにより測定されたHESの41バッチでLPS混入のHESレベルのLPS汚染 。中央値LPS HES mg当たり濃度= 86、U。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig6highres.jpg" /> 図6：Hのアニメーション概略 HESの単離の幼虫と成虫の回収を通じてL3幼虫の経口胃管栄養からキーライフサイクル段階のpolygyrusライフサイクルの概要、。 図7：アニメーションHESの回路図とその機能 HES内に含まれる水溶性メディエーターとエキソソームの主要免疫調節効果。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 遺伝子型（及びバックグラウンド株） </td><td> 一次感染の表現型 </td><td>リファレンス</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>近交系</td><td></td><td></td></tr><tr><td> / J、CBA、C3H </td><td>高感受性</td><td> 22,29 </td></tr><tr><td> C57BL / 6およびC57BL / 10 </td><td>影響を受けやすい</td><td> 22,30 </td></tr><tr><td>のBALB / c、DBA / 2、129 / J </td><td>中間の</td><td> 22,31 </td></tr><tr><td> NIH、SJL、SWR </TD&gt; <td>低感受性</td><td> 22,32 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> サイトカインまたはサイトカイン受容体のためのトランスジェニック </td><td></td></tr><tr><td> IL-1β - / - </td><td>影響を受けやすく</td><td> 33 </td></tr><tr><td rowspan="2"> IL-1R - / - </td><td rowspan="2">影響を受けにくい（a）の全く感受性の変化ないが、増加した肉芽腫（B） </td><td> （a）は、33 </td></tr><tr><td> （b）は34 </td></tr><tr><td> IL-2Rβジェニック（C57BL / 6） </td><td>耐性</td><td> 35 </td></tr><tr><td> IL-4 - / - </td><td>高い繁殖力</td><td> 36 </td></tr><tr><td> IL-4R - / - （C57BL / 6またはBALB / c）の</td><td>高感受性</td><td> 22 </td></tr><tr><td> IL-6 - / - （BALB / cまたはC57BL / 6） </td><td>高度に抵抗</td><td> 37 </td></tr><tr><td> IL-9トランスジェニック（FVB） </td><td>耐性</td><td> 38 </td></tr><tr><td> IL-21R - / - （C57BL / 6） </td><td>欠損のTh2、肉芽腫gormationの減少</td><td> 39,40 </td></tr><tr><td> IL-25 - / - （BALB / c）の</td><td>影響を受けやすく</td><td> 33 </td></tr><tr><td> IL-33R（T1 / ST2） - / - （BALB / c）の</td><td>感受性の変化なし</td><td> 33 </td></tr><tr><td> TGFβRIIdn（C57BL / 6） </td><td>ハイのTh1、感受性増大</td><td> 41,42 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> T細胞マーカーのためのトランスジェニック </td><td></td></tr><tr><td> CD28 - / - （BALB / c）の</td><td>わずかに高い繁殖力</td><td> 43 </td></tr><tr><td> CD86（B7-2） - / - （BALB / c）の</td><td>高い繁殖力</td><td> 44 </td></tr><tr><td> OX40L - / - （BALB / c）の</td><td>高い繁殖力＆＃160; </td><td> 45 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 先天性免疫遺伝子座についてトランスジェニック </td><td></td></tr><tr><td> 1型インターフェロン受容体（IFNAR） - / - （C57BL / 6） </td><td>高い繁殖力、より多くの肉芽腫</td><td> 34 </td></tr><tr><td> MyD88非 - / - （C57BL / 6） </td><td>より耐性、より多くの肉芽腫</td><td> 34 </td></tr><tr><td> C-KitW /ウェストバージニア（WBB6） </td><td>影響を受けやすく</td><td> 46,47 </td></tr></tbody></table> 表1：H.による一次感染遺伝的に異なると遺伝子-攻撃対象マウス系統でpolygyrus。

Heligmosomoidesのpolygyrusは密接に高度に普及している人間の蠕虫感染のそれに似ている強力な免疫調節機能を備えたマウスの線虫である。ここでは、Hの長期維持のためのプロトコルを記述しpolygyrusのライフサイクル。

の栽培<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus：</em&gt;免疫調節虫寄生虫とその分泌製品

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

この手順の全体的な目的は、宿主の免疫応答を抑制して寄生虫の生存を可能にする、長寿命のヘルスムス寄生虫から分泌される分子を回収し、分析することです。これはまず、マウスの腸管という天然の生息環境で寄生虫を育成させることで達成されます。次のステップは、安楽死させたマウスから成熟した寄生虫を分離することです。次に、蠕虫寄生虫を組織培養培地で3週間培養し、その間に大量の排泄・分泌（ES）分子を放出させます。最終ステップとして、培養上清から放出された分子を回収し、生物学的および生化学的試験用のESバッチとして濃縮します。最終的に、濃縮した上清をin vitroで特定の細胞型に直接投与して免疫細胞機能の変化を研究するか、あるいはマウスに投与してアレルギーやその他の疾患を抑制する能力を試験することができます。この手法を着想したのは、免疫抑制が生きた寄生虫の感染に関連しており、生きた寄生虫から免疫抑制分子が能動的かつ継続的に放出されていることに気づいたときでした。この手法は寄生虫感染に関する知見を提供できるだけでなく、ここで発見される免疫抑制分子は、アレルギー、自己免疫疾患、炎症性腸疾患など、欧米諸国の主要な疾患の治療に非常に有効であると考えられます。蠕虫寄生虫の回収と処理の手順は非常に特殊であり、無菌培養技術に細心の注意を払う必要があるため、この手法を視覚的に実演することは極めて重要です。H. polyusのライフサイクルを構築するため、8週齢のF1マウスにH. polyus幼虫を経口投与により感染させます。付属のプロトコルに従い、蒸留水を用いてH. polyus L3幼虫を2000個/mLの濃度で調製します。各感染前に、マウス1匹あたり400個のL3幼虫を200 µLで投与します。1 mLシリンジと先端が丸い専用のガバージュ針を用いて、幼虫懸濁液を5回反転させて均質化します。幼虫懸濁液200 µLを吸引します。経口ガバージュを行うには、マウスの項皮を掴んで直立状態で固定し、鈍端のガバージュ針を口と食道経由で胃の中へゆっくりと挿入します。これにより、マウスから成虫および寄生虫卵が回収されます。感染から14日後、感染から14日後。成人したh polyus虫を、ここで示した方法で準備した改良型bayamon装置を用いてマウスから回収します。この手順を開始するために、安楽死させた動物の腹部を70% ethanolで洗浄してください。腹部の皮膚を切開し、後方に引いて前腹壁を露出させます。正中切開を行い、腹腔内に入ります。近位十二指腸から遠位直腸まで、小腸および大腸全体を取り出します。乾燥したペトリ皿に置きます。糞便を含む結腸を切り出した後、腸管全体をまっすぐに伸ばし、後で卵を回収するために別の皿に移します。次に、成虫が含まれている小腸の近位20 cmを特定します。十二指腸の壁が比較的厚いことが特徴であり、管腔内の虫のために赤みを帯びていることが多い。小腸のこの部分を切り出し、5 mLのHank's solutionを入れたペトリ皿に入れる。丸型はさみを用いて37 °Cに加温する。虫で満たされた近位腸管部分を縦方向に切り開き、2枚のガラススライドを用いて腸管壁の内側を掻き出します。虫を回収するため、不要な腸管壁は廃棄してください。ハンクス液を用いて漏斗を構築します。小さなムスリンバッグの口をステープラーで留め、2枚のペトリ皿から虫をその中に入れます。2つのムスリンバッグをそれぞれガラス漏斗に取り付け、漏斗の縁をペーパークリップで固定します。この装置を37 degrees Celsiusのインキュベーターに1〜2時間置きます。インキュベーションの途中で、装置を静かに揺すり、モスリンフィルターを塞ぐ可能性のある腸管調製物の残渣を取り除きます。この際、残渣がモスリンバッグの外に漏れ出さないように注意してください。漏出した場合、最終的なHES調製時に汚染の原因となります。インキュベーション終了後、プラスチックピペットを使用して、シンクの上で回収用試験管を接続ゴムホースから慎重に切り離し、線虫を50 milliliterチューブに移して、重力で沈殿させます。ストリペットを用いて培地を除去します。40 millilitersのHank's solutionを加え、虫を沈殿させます。この操作を5回繰り返し、計6回の洗浄を行います。haze cultureのコンタミネーションを防ぐことが、本プロトコルの成功において極めて重要です。ここからの蠕虫培養は無菌状態で維持する必要があります。ラミナーフローフードに移動し、ピペットを用いて抗生物質を添加した滅菌ハンクス液で蠕虫培養物をさらに6回洗浄し、回収された成虫数を数えるために20 µLのサンプルを2つ採取します。感染14日目に、ピンセットで以前に切除した結腸から糞便を掻き出すことで、接種した幼虫の約50%の量で卵が回収されることが予想されます。次に、糞便と粒状活性炭を少なくとも1:1の比率で混ぜ合わせます。紙に付着して塗り広げられる程度の濃度に調整してください。ペトリ皿に入れた湿らせたろ紙の中心に薄く塗り広げ、これを遮光性の加湿ボックスに入れ、12〜14日間暗所で保持します。7日目以降から、L3期の幼虫の回収を開始します。フィルターペーパーの縁に沿って円を描くように回収してください。フィルターペーパーをペトリ皿から取り出し、ピペットを用いて、皿に残っている幼虫を洗い流すために1枚あたり5 mLの滅菌水を加えてください。幼虫を50 mLチューブに移します。フィルターペーパーをシャーレに戻して暗所に置き、最大1か月間、週に1回の頻度で幼虫の回収を繰り返します。回収した幼虫は、プロトコルの本文に従って洗浄し、蒸留水中で4 °Cで保存します。この手順を開始するために、10%ジェンタマイシンを添加した約10 millilitersのハンクス溶液に線虫を20分間浸します。この際、20分後に線虫が完全に浸っている状態になるよう、チューブを傾けて置いてください。抗生物質を添加したハンクス溶液で線虫を6回洗浄し、線虫を通気孔付きT 25フラスコに移します。フラスコを37度 Celsiusのインキュベーター内に直立させて3週間置き、線虫からの排泄分泌産物（ESP）を調製します。HES含有培養液。培地は、最大で週2回の間隔で培養液から回収し、回収するたびに同量のh polyus Mediaで補充する。LPSおよび宿主タンパク質による汚染の可能性が高いため、回収したものはそれぞれ分けて保管し、日付とバッチ番号を明確に記載すること。培養開始から24時間後の最初の回収分は、別途処理するか、あるいは破棄してください。HES含有培地を400 ×gで5分間遠心分離します。次に、50 mLシリンジで培地を吸引し、0.2 µmの低タンパク結合フィルターを通して50 mLチューブに回収します。その後、回収したHES上清を、窒素圧下で分 tử量カットオフ3000の限外ろ過装置を用いて濃縮します。まずろ過装置を準備し、3 kDaメンブレンの光沢面を下にして、攪拌しながら1 Lビーカー内で蒸留水を用いて洗浄してください。製造元の指示に従って限外ろ過装置を組み立て、フィルター膜の光沢面を上に向けます。4°Cのキャビネット内に設置し、HESの濃縮を開始する前に50 mLの蒸留水を透過させます。フィルターが乾かないように十分に注意してください。アミノ酸やその他の組織培養培地成分を除去するため、液量が2〜5 mLに濃縮されるまで、必要に応じてHESを各チューブずつろ過装置に加えます。HES調製液から、50 mLのパイロジェンフリーPBSをろ過装置に加え、約2 mLまで濃縮します。この工程を2回繰り返します。合計150 mLのPBSを用いて、ESをシリンジに移し、0.2 µmフィルターでろ過滅菌します。タンパク質濃度を測定した後、分注チューブにバッチ番号と日付を記載し、-80 °Cで凍結保存します。F1マウスにおいてH. polygyrusのライフサイクルを維持するため、400 Lの3齢幼虫を経口投与します。得られた成虫の寄生数はここに示されています。HESの各バッチは、機能的アッセイおよびタンパク質組成において再現性のある有効性が証明されています。さらに、培養開始から毎週の培養上清を分析したところ、最大4週間にわたってタンパク質プロファイルが非常に類似していることが分かりました。BradfordアッセイでTS濃度を測定すると、全タンパク質量は通常、約1 mg/mLとなります。約500 mLの培養上清から得られた11の異なるバッチからのHESタンパク質の収量を表示しています。HESを回収する際は汚染の回避が極めて重要であり、41バッチのHESにおけるLPS汚染レベルをlimbus AAMI CYTEアッセイで測定しました。その結果、ほとんどのHESバッチが推奨される汚染閾値を大幅に下回っていることが確認されました。この手順を行う際は、培養セットアップにおいて厳密な無菌操作を維持することが重要です。この手法に習熟し、手順に従って適切に実施すれば、3〜4時間で完了させることができます。これらの寄生虫から放出される分子産物の全貌を完全に理解するために、プロテオミクス、タンパク質分画、ならびにグリカン、脂質、microRNAの解析などの他の手法を併用することが可能です。このビデオを視聴することで、poly limusの増殖方法について十分に理解することができるはずです。Moidはpolyusであり、培養した成虫からDS産物を回収し、免疫系への影響を試験します。この寄生虫はヒトに対しては無害ですが、バッチ間の再現性を確保するために、安全上の注意事項に従い、指定されたプロトコルを遵守することが重要です。

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Research

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学ぶHeligmosomoides polygyrusの培養法と分泌産物の回収技術。マウス腸管から成虫を分離し、組織培養で免疫抑制性ES分子を収集・濃縮する方法を解説。アレルギーや自己免疫疾患治療への応用可能性を探る。

の栽培

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