マトリックス修飾により誘導される細胞接着及び脱接着におけるリアルタイムの変化を測定するために、細胞 - 基質インピーダンスと生細胞イメージングを使用して、

次の実験の全体的な目標は、細胞基質インピーダンスと生細胞イメージングを使用して、マトリックス修飾剤に曝露された内皮細胞における細胞マトリックス接着の急速な変化をリアルタイムで定量化することです。この実験では、病態生理学的に重要なマトリックス修飾剤として、ヘム酵素ミエロペルオキシダーゼを用いています。これは、最初に表面をフィブロネクチンでコーティングして接着マトリックス基板を提供することによって達成されます。

その後、MyoペルオキシダーゼまたはMPOがフィブロネクチンに結合します。次に、懸濁した内皮細胞を表面に座らせ、インキュベートして細胞の接着を最大化し、フィブロネクチンに広がります。次に、細胞を過酸化水素に曝露して、NPOを介したフィブロネクチン酸化を開始します。

その後、細胞マトリックスの接着の急速な変化は、細胞基質インピーダンスとライブセルイメージング分析を使用してリアルタイムで定量化されます。その結果、NPOを介したフィブロネクチン酸化によって引き起こされる内皮細胞マトリックス接着の急速な損失を、細胞基質インピーダンスと生細胞イメージングにより、高い時間分解能で、ラベルフリーでリアルタイムに定量できることが示されています。これらの技術の利点は、高い時間分解能で細胞マトリックスの接着の変化を連続的に定量化できることであり、これは、マトリックス修飾が細胞形態と接着依存的なシグナル伝達プロセスの下流の変化をどのように促進するかについて重要な新しい洞察を提供できることを意味します。

このプロトコルは、MPOを他のマトリックス修飾剤、例えばマトリックスからゲーティング、プロテアーゼに置き換えることによって、または上皮細胞などの内皮細胞以外の接着細胞型を使用することによって容易に適応させることができるという点で、より広範な意義を有する。まず、ウェルあたり80マイクロリットルのフィブロネクチンを添加して、細胞基質インピーダンス測定用の96ウェル金マイクロ電極アレイをコーティングするか、ガラス底の細胞培養皿に2ミリリットルのフィブロネクチンを添加して、生細胞イメージング分析を行います。アレイおよび/または培養皿を摂氏37度で2時間インキュベートします。

次に、表面をブロックするために、0.2%BSAを添加し、摂氏37度でさらに2時間インキュベートします。次に、精製したヒトのペルオキシダーゼをHBSSに添加し、30分間インキュベートします。次に、HBSSを使用して表面を2回洗浄し、結合していないMPOを取り除きます。

次に、250, 000細胞/ミリリットルの懸濁内皮細胞をテキストプロトコルに従って調製し、96ウェル細胞の基質インピーダンスマイクロ電極アレイに、ネイティブまたはMPOベアリングフィブロネクチンコーティング表面を有するマイクロ電極アレイを参照してください。35ミリメートルのガラス底細胞培養皿の場合、ミリリットルあたり500, 000個の細胞の2ミリリットルを追加します。播種直後、細胞は微小電極アレイプレートを摂氏37度、二酸化炭素5%の細胞基質インピーダンスインキュベーターポートに取り付けます。

また、ブランクの読み取り値を取得して、セルインデックスデータの継続的な取得を開始します。底面35mmのガラス製細胞培養皿を35°Cの5%二酸化炭素インキュベーターに移します。細胞の接着と拡散を最大限に高めるために、2時間インキュベートします。

インキュベーション後、細胞インデックスの読み取りを一時停止し、微小電極アレイプレートを一時的に取り外すか、インキュベーターからガラス底皿を取り外し、スナットを吸引し、加温HBSSを追加して、阻害剤、MPOのモジュレーター、触媒反応、または細胞シグナル伝達阻害剤の影響を調べます。それらをカルチャに追加します。この時点で、すぐにアレイプレートをインキュベーターポートに戻すか、ガラス底の皿をインキュベーターに戻し、細胞を30分間平衡化させます。

NPO触媒による次亜塩素酸依存性フィブロネクチン酸化および細胞インピーダンス研究のための脱接着を開始するには、インキュベーターから微小電極アレイプレートを取り外し、細胞指数測定を一時停止します。HBSSに過酸化水素を加え、ピペッティングを繰り返して穏やかに混合し、すぐに微小電極アレイにインキュベーターポートに戻して、35ミリメートルガラス底皿を使用したライブセルイメージング研究のための細胞指数の読み取りを再開します。インキュベーターから皿を取り出した後、63 x 水対物レンズを装備した倒立共焦点顕微鏡の摂氏 37 度の加熱ステージに取り付けます。

DIC光学系 ライブセルの動画を撮影するには、細胞にピントを合わせ、ここで参照するガイドラインに従ってDIC光学系を最適化してください。DICムービーを開始し、未処理の細胞のベースライン測定値を1分間記録した後、過酸化水素を加えてピペッティングを繰り返して穏やかに混合し、顕微鏡の焦点を合わせ直し、処理した細胞のDICムービーを必要な時間記録し続けます。セル基板のインピーダンスデータを解析するには、まずデータをスプレッドシートにエクスポートしてセル d 接着を行います。

研究では、NPOを介したフィブロネクチン酸化の開始直前に記録された値を、正規化された細胞指数と生細胞イメージングデータの解析時間のプロットとして提示する1つのデータに設定することにより、データを正規化します。Image Jなどの画像解析プログラムでMPOによるフィブロネクチン酸化開始の直前と直後に撮影されたDICライブセルイメージングムービーを、少なくとも2本の別々のDICムービーで公開し、複数の細胞をランダムに選択し、メンブレンエッジを手動でトレースし、封入されたピクセル数を定量化することで、連続したフレームで投影面積を測定します。最後に、正規化された細胞面積のプロットとしてデータを提示します 時間に対して、内皮細胞懸濁液をフィブロネクチンまたはフィブロネクチンを含む MPO に着座させると、細胞基質内の細胞インデックス値のプラトー化によって判断されるように、2 時間以内に細胞の接着と広がりが最大になります。

インピーダンス測定は、未変性またはNPOがフィブロネクチンを含有する上で最大の細胞接着が確立されると、NPO触媒次亜塩素酸によって媒介され、NPOのcos基質の添加によって開始される標的フィブロネクチン酸化を標的とする過酸化水素は、ここに示すように、細胞基質インピーダンスおよび生細胞イメージングによって測定された細胞マトリックス接触の表面積の急速な減少を引き起こし、 過酸化水素処理に応答してフィブロネクチンを含有するNPOに結合した内皮細胞に明らかな急速な細胞脱接着は、過酸化水素のみで処理された細胞には存在しません。BLEsスタチンによるミオシン2運動機能の阻害は、細胞基質インピーダンスによって測定された内皮細胞の接着速度を阻害し、MPO触媒細胞内マトリックス酸化に応答した細胞の接着および収縮がACTOミオシン引張力によって駆動されることをライブセルイメージングによって特定します。これらの方法は、細胞接着の非常に急速な変化を正確に測定できるため、接着の変化と、SARKリン酸化や焦点接着シグナル伝達などの接着依存性シグナル伝達プロセスの下流の変化との間の因果関係について重要な洞察を得ることができます。