Name: マクロファージコレステロール枯渇との食作用への影響クリプトコックス·ネオフォルマンス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: 学ぶマクロファージのコレステロール枯渇法とCryptococcus neoformansへの食作用への影響。メチルベータシクロデキストリンを用いたin vitroプロトコルで、真菌感染症のメカニズム解明に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、NIHの助成金MDPにAI56168、AI71142、AI87541及びAI100631によってサポートされていました。マウリツィオ·デルポエタは、感染症にバロウズウェルカム調査官である。

MβCDとJ774A.1細胞の1コレステロール枯渇<ol><li>無菌の生物学的安全キャビネット内で、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）200μl中、96ウェル細胞培養プレートにウェルあたり10 5 J774A.1マクロファージ様細胞を播種ペニシリン/ストレプトマイシン（P / S）。 37℃でインキュベートし、5％CO 2 O / N。 </li><li>細胞単層から培地を除去し、ろ過またはオートクレーブ処理された1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回細胞を洗浄。 </li><li>コントロールとして、所望の濃度（10 mM以下PBS中30 mM）のまたは1x PBSでMβCD溶液200μlを加え、振とうしながら37℃で30分間インキュベートする。手順の直後に市販のキットを用いて定量分析をRTで上清と予備を削除します。 </li><li> 1X PBSまたは無血清DMEMで細胞を2〜3回洗浄しpipettiによる感染または溶解細胞を続行薄層クロマトグラフィーまたはキットを用いた分析のために、脱イオンH 2 Oで2〜3回ngの。 注：以下はコレステロール枯渇市販のコレステロール定量キットを使用することができる。詳細については、資料のセクションを参照してください。書かれたように、メーカーの指示に従ってください。 </li></ol>薄層クロマトグラフィー（TLC）により、コレステロール含有量の2観測<ol><li>石油エーテルの溶液で1回、アセトンで二回TLC槽を洗浄：ジエチルエーテル：酢酸（65：30：1容量）。 （体積で1：65：30）溶液及び/ NがOを残す酢酸：ジエチルエーテル：石油エーテルでタンクを飽和させる。 注：有機溶媒が常に蒸気の吸入を防ぐために、ヒュームフードの下で使用されるべきである。手袋と白衣を常に着用する。酢酸は強酸であると注意して使用する必要があります。 </li><li>無菌のバイオセーフティキャビネットでは、6ウェルCE上ウェル当たり10 6 J774A.1マクロファージ様細胞を播種10％FBSおよび1％P / Sを補充したDMEM暖かいの5mlの容量でllの培養プレート。 37℃、5％CO 2、O ​​/ Nでインキュベートする。 </li><li> 、1.4より大きな井戸サイズを考慮するために適用可能な200μlのための1ミリリットルを代入する - 手順1.2に従うことによってコレステロールのマクロファージを枯渇。 </li><li> 、各ウェルにトリプシン-EDTAの500μl加え、37℃で3分間インキュベートし、静かにセルスクレーパーで細胞をこすり。 </li><li>微量遠心管に移し、10％FBSおよび1％P / Sを補充したDMEM暖かいの追加の500μlを添加する。 </li><li> 300×gで5分間細胞をスピンし、上清を除去します。 </li><li>細胞ペレットに10％FBSおよび1％P / Sを補足した暖かいDMEMの追加の500μLを加え、ピペッティングにより慎重に懸濁します。 </li><li>細胞の10μlのを削除し、血球計数器上で細胞を数える。各試料からの細胞濃度を正規化し、ガラス管に等しい数の細胞を加える。 注：このステップでは、1月より濃縮された最終的な脂質抽出物を得るために、同一の処置群からの細胞を結合するために選択する。 </li><li> RTで5分間300×gで遠心細胞および培地を除去します。 </li><li>メタノールと渦の2ミリリットルを追加します。その後、クロロホルムと渦の1ミリリットルを追加します。単相で確認して溶液を作製した位相状態を確認してください。 注意：チューブを4℃CO / Nで保存することができる。 </li><li> RTで10分間1700×gで遠心分離し、上清を新しいチューブに移す</li><li>のdH 2 Oの1ミリリットルが続くクロロホルムの追加の1ミリリットルを追加します。 30秒間ボルテックス二回。 RTで5分間1700×gで遠心分離する。 </li><li>敏感なバランスにガラス管を秤量し、既知の重量のガラス管に下相を転送するために、ガラスパスツールピペットを使用する。 </li><li>乾燥（約2時間）まで、遠心エバポレーターで脂質をドライダウン。乾燥した脂質とチューブを秤量し、乾燥脂質重量を計算する。 注：ドライ脂質はTLCを実行する準備ができるまで-20℃に保存することができます。 </li><li> （ - 50μlの通常20）及びシリカTLCプレート上で希釈した脂質の負荷20μlの脂質の濃度を正常化するのに十分なクロロホルム中で乾燥した脂質を希釈する。標準としてクロロホルム20μlの希釈されたコレステロールの負荷20μgの。 </li><li>飽和TLCタンクに乾燥したTLCプレートを追加し、プレートエッジの前に1センチメートルまで移行する溶剤が可能。タンクからTLCプレートを取り外し、それは約5分を乾燥させます。 </li><li>移行を確認するために、ヨウ素蒸気タンク内に配置することによって、脂質​​を可視化する。取り外し、スポットが約10のためにフェードすることができます - フードの下で15分。 注：ヨウ素は、吸入の危険性がある。ヒュームフードの下には、必ず使用してください。 </li><li>脱イオンH 2 Oの60ミリリットル、硫酸の4ミリリットル、および塩化マンガンの630 mgのメタノール60mlを組み合わせることにより、中性脂質染色のためのソリューションを準備します。 </li><li>注意深く、ゆっくりとトレイの中性脂質染色溶液にTLCプレートを浸し、シリカリットルを脱却することなく除去するAyerの。 NOTE：中性脂質染色溶液を数回再使用することができるので、それは、トレイから取り出すことができ、後で使用するためにボトルに戻した。 </li><li>すべての気泡が消失するまでプレートを室温でボンネットの下に乾燥することができます。所望の色に160℃、char型に設定したヒートブロック上にTLCプレートを熱し。 注：このようなビジョンワークスLSとしてデンシプログラムは、脂質サンプルを比較するために炭化したバンドを定量することができる。 </li></ol> C.とマクロファージの3感染ネオフォルマンス （H99） <ol><li>無菌の生物学的安全キャビネット内で、DMEM200μl中、96ウェル細胞培養プレートにウェルあたり10 5種マクロファージ様細胞を、10％FBSおよび1％P / Sを補充した。 37℃、5％CO 2、5％CO 2、O ​​/ Nでインキュベートする。 注：感染は、ガラスで行うことができますが簡単に画像化のための共焦点料理を底。すべての量は同じまま。 </li><li> C.の文化を育てるネオフォルマンス （H99）打たプレートから得られた1コロニーをYNBの10ミリリットルを接種し、振盪しながら30℃でO / Nそれをインキュベートすることによって。 </li><li> C.を洗うとカウントネオフォルマンス （H99）細胞。 <ol><li>遠心機C. 4℃で10分間、1700×gでネオホルマンス O / N培養物。 </li><li>メディアを取り外し、廃棄します。 1×PBSの5ミリリットルで細胞を洗浄。 4℃で10分間1700×gで遠心し。 </li><li> PBSを除去し、フィルター1×5mlのPBSで洗浄する。 4℃で10分間1700×gで遠心し。このステップをさらに2回繰り返します。 </li><li> PBSを除去し、1×PBS 5mlに懸濁します。 </li><li>洗浄した文化の500希釈：1を取得するためにPBSで段階希釈を行います。 <ol><li> 1:10希釈を得るために、1×PBSの900μlに元のサンプルを100μlを追加。 </li><li> 1：100希釈を得るために、1×PBS900μlの1:10希釈した試料を100μlを追加。 </li><li> 500 diluti：1を得るために、1×PBSの800μlに100希釈した試料：1の200μlのを追加します。上の</li></ol></li><li> 110μlのテイク：500希釈し、細胞数を計算するために血球計数器を頼りにしています。 </li></ol></li><li>マクロファージを活性化し、Cをオプソニン化するための作業溶液を準備ネオフォルマンス。 <ol><li> 990μlに10μlのを追加することによって、ストック溶液からのLPSおよびIFNγ100X希釈する。 NOTE：LPS及びIFNγは貪食取り込みを増強するために使用されているが、食作用のために必要とされない。マクロファージの殺菌活性に関心がある場合は、感染前に振とうしながら37℃で活性化O / Nを行う。 </li><li>サンプルあたり希釈されたLPSの7.5μL、希釈されたIFNγの1.25μL、GXM抗体の1.25μLとCのボリュームを組み合わせる1.25×10 5個の細胞を与えネオフォルマンス文化 。 10％FBSおよび1％P / Sを補充したDMEMを有するサンプルの数を乗じた250μlの最大容積をもたらす。 </li><li>振とうしながら37℃で20分間この溶液をボルテックスし、インキュベートする。 注意：コレステロール枯渇は、（1.2ステップ - 1.4）オプソニン化工程と同時に行うことができる。オプソニン化細胞が最適にステップ3.4.3のインキュベーション後にはもう20分以上使用されるべきであるように、事前のワーキング溶液を組み合わせることにマクロファージを扱うようにしてくださいませ。 </li></ol></li><li>マクロファージに感染する<ol><li>ウォッシュマクロファージ回無血清DMEMとし、オプソニン化C.200μlのを追加ネオフォルマンスを各ウェルに作業溶液。 </li><li> 37℃で2時間インキュベートする。 </li></ol></li><li>修正し、ステイン細胞<ol><li>メディアを取り出し、DMEMで細胞を2回洗浄する。 </li><li>空気は、10分間、細胞単層を乾燥させ、細胞を固定し、氷冷メタノールの200μlを添加する。 </li><li> RTで15分間インキュベートし、残りのメタノールを除去。 </li><li> 10倍ギムザ200μlを加え、室温で5分間インキュベートする。 </li><li>オフキャップを脱イオン水とドライO / Nで3回 - 2を洗ってください。 注：イメージングは​​次の日に行わまたは週のfollowiまで可能NG染色。 </li></ol></li><li>視覚化し、カウント<ol><li>顕微鏡を使用して、データポイントあたり300個の細胞をカウントし（同じ治療回数ウェル当たり150の2がある場合）、感染したマクロファージおよび貪食さクリプトコッカス細胞の数の数に注意。 注：でも、データポイントの利用ごとに条件あたり2プレートをサンプリング確保するために、プレート当たり3の非重複領域を選択して、面積当たり50細胞を数える。 </li><li> C.の平均数によって、感染マクロファージの割合を乗じることによって食作用指数を計算マクロファージあたりのネオフォルマンス 。 1×PBSの割合がコントロールを扱うように値を発現することにより貪食インデックスを正規化する。いくつかの試験は、食作用指数の傾向を決定するために、平均値および平均値の標準偏差を計算した後。有意性を決定するためにスチューデントt検定を使用する。 </li><li> 1,000倍または400倍の倍率での細胞の顕微鏡写真を取る。 </li></ol></li></ol> 4.トリパンブルーアッセイ<ol><li>無菌の生物学的安全キャビネット内で、10％ウシ胎児血清を補充したダルベッコ最小必須培地（DMEM）5mlを、1％ペニシリン/ストレプトマイシンの容量で6ウェル細胞培養プレートにウェルあたり10 6個のマクロファージ様細胞を播種。 37℃、5％CO 2、O ​​/ Nでインキュベートする。 </li><li>より大きな井戸サイズを考慮するために適用可能な200μlのための2ミリリットルを代入する1.4 - 手順1.2に従うことによってコレステロールのマクロファージを枯渇。 注：1×PBSで処理したコントロールだけでなく、以前の任意の治療に削られるコントロールを含めるようにしてください。 </li><li>各ウェルに1×PBS500μlのを加え、穏やかにセルスクレーパーで細胞をこすり。微量遠心チューブに移し、軽くピペッティングして細胞を一時停止。 </li><li> 4％のトリパンブルーの1μlの細胞や汚れの10μlのを削除します。 </li><li>血球計数器で細胞をカウントし、以下の式を使用して実行可能性を計算する：％の生存率= [1 - （ブルー細胞/全細胞）]未処理だったコントロールへ×100ノーマライズ値。いくつかの試験では、生存率の傾向を決定するために、平均値と標準偏差を計算した後。有意性を決定するためにスチューデントt検定を使用する。 </li></ol>

<ol><li>Sarantis, H., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subversion+of+phagocytosis+for+pathogen+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Subversion of phagocytosis for pathogen survival.</a> Cell Host & Microbe. 12 (4), 419-431 (2012).</li>
<li>Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+Of+Membrane+Structures+During+Phagocytosis+And+Chemotaxis+Of+Macrophages%3A+Role+And+Regulation+Of+The+Actin+Cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Generation Of Membrane Structures During Phagocytosis And Chemotaxis Of Macrophages: Role And Regulation Of The Actin Cytoskeleton.</a> Immunological Reviews. 256 (1), 222-239 (1111).</li>
<li>Liu, T., Perlin, D. S., Xue, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanisms+Of+Cryptococcal+Meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanisms Of Cryptococcal Meningitis.</a> Virulence. 3, 173(2012).</li>
<li>Abadi, J., Pirofski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Antibodies+Reactive+With+The+Cryptococcal+Capsular+Polysaccharide+Glucuronoxylomannan+Are+Present+In+Sera+From+Children+With+And+Without+Human+Immunodeficiency+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A Antibodies Reactive With The Cryptococcal Capsular Polysaccharide Glucuronoxylomannan Are Present In Sera From Children With And Without Human Immunodeficiency Virus Infection.</a> The Journal Of Infectious Diseases. 180 (3), 915-919 (1999).</li>
<li>Kechichian, T. B., Shea, J., Del Poeta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+Of+Alveolar+Macrophages+Decreases+The+Dissemination+Of+A+Glucosylceramide-Deficient+Mutant+Of+Cryptococcus+Neoformans+In+Immunodeficient+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+And+Immunity%22%5BJournal%5D)">Depletion Of Alveolar Macrophages Decreases The Dissemination Of A Glucosylceramide-Deficient Mutant Of Cryptococcus Neoformans In Immunodeficient Mice.</a> Infection And Immunity. 75 (10), 4792-4798 (2007).</li>
<li>Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococci+At+The+Brain+Gate%3A+Break+And+Enter+Or+Use+A+Trojan+Horse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Cryptococci At The Brain Gate: Break And Enter Or Use A Trojan Horse.</a> The Journal Of Clinical Investigation. 120 (5), 1389-1692 (1172).</li>
<li>Chrétien, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+Of+Cerebral+Cryptococcus+Neoformans+Infection+After+Fungemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis Of Cerebral Cryptococcus Neoformans Infection After Fungemia.</a> The Journal Of Infectious Diseases. 186 (4), 522-530 (2002).</li>
<li>Luberto, C., Martinez-Mariño, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+Of+App1+As+A+Regulator+Of+Phagocytosis+And+Virulence+Of+Cryptococcus+Neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Identification Of App1 As A Regulator Of Phagocytosis And Virulence Of Cryptococcus Neoformans.</a> The Journal Of Clinical Investigation. 112 (7), 1080-1094 (1172).</li>
<li>Mcquiston, T. J., Williamson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+Roles+Of+Alveolar+Macrophages+In+The+Host+Response+To+Cryptococcus+Neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Infection+And+Chemotherapy%3A+Official+Journal+Of+The+Japan+Society+Of+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Paradoxical Roles Of Alveolar Macrophages In The Host Response To Cryptococcus Neoformans.</a> Journal Of Infection And Chemotherapy: Official Journal Of The Japan Society Of Chemotherapy. 18 (1), 1-9 (2012).</li>
<li>García-Rodas, R., Zaragoza, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+Me+If+You+Can%3A+Phagocytosis+And+Killing+Avoidance+By+Cryptococcus+Neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+And+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Catch Me If You Can: Phagocytosis And Killing Avoidance By Cryptococcus Neoformans.</a> FEMS Immunology And Medical Microbiology. 64 (2), 147-161 (2012).</li>
<li>Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Intracellular+Life+Of+Cryptococcus+Neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Of+Pathology.+9%22%5BJournal%5D)">The Intracellular Life Of Cryptococcus Neoformans.</a> Annual Review Of Pathology. 9. 219, 10-1146 (2014).</li>
<li>Rao, M., Peachman, K. K., Alving, C. R., Rothwell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+Of+Cellular+Cholesterol+Interferes+With+Intracellular+Trafficking+Of+Liposome-Encapsulated+Ovalbumin%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+And+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Depletion Of Cellular Cholesterol Interferes With Intracellular Trafficking Of Liposome-Encapsulated Ovalbumin.</a> Immunology And Cell Biology. 81, Doi. 415-423 (2003).</li>
<li>Sein, K. K., Aikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Prime+Role+Of+Plasma+Membrane+Cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22In+The+Pathogenesis+Of+Immune+Evasion+And+Clinical+Manifestations+Of+Falciparum+Malaria.+Medical+Hypotheses%22%5BJournal%5D)">The Prime Role Of Plasma Membrane Cholesterol.</a> In The Pathogenesis Of Immune Evasion And Clinical Manifestations Of Falciparum Malaria. Medical Hypotheses. 51 (2), 10-1016 (1998).</li>
<li>Pucadyil, T. J., Tewary, P., Madhubala, R., Chattopadhyay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+Is+Required+For+Leishmania+Donovani+Infection%3A+Implications+In+Leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+And+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Cholesterol Is Required For Leishmania Donovani Infection: Implications In Leishmaniasis.</a> Molecular And Biochemical Parasitology. 133, 145-152 (2004).</li>
<li>Tagliari, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Microdomain+Components+Of+Histoplasma+Capsulatum+Yeast+Forms%2C+And+Their+Role+In%5BTitle%5D)+AND+%22Alveolar+Macrophage+Infectivity.+Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane Microdomain Components Of Histoplasma Capsulatum Yeast Forms, And Their Role In.</a> Alveolar Macrophage Infectivity. Biochimica Et Biophysica Acta. 1818 (3), 458-466 (2012).</li>
<li>Crane, J. M., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+Of+Cholesterol+In+The+Formation+And+Nature+Of+Lipid+Rafts+In+Planar+And+Spherical+Model+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Role Of Cholesterol In The Formation And Nature Of Lipid Rafts In Planar And Spherical Model Membranes.</a> Biophysical Journal. 86 (5), 2965-2979 (2004).</li>
<li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+Of+Lipid+Rafts+In+Biological+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Of+Cell+And+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Functions Of Lipid Rafts In Biological Membranes.</a> Annual Review Of Cell And Developmental Biology. 14, 111-136 (1998).</li>
<li>Simons, K., Toomre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Rafts+And+Signal+Transduction+Nature+Reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lipid Rafts And Signal Transduction Nature Reviews.</a> Molecular Cell Biology. 1 (1), 31-39 (2000).</li>
<li>Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+Of+Cholesterol+Depletion+By+Cyclodextrin+On+The+Sphingolipid+Microdomains+Of+The+Plasma+Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Effects Of Cholesterol Depletion By Cyclodextrin On The Sphingolipid Microdomains Of The Plasma Membrane.</a> The Biochemical Journal. 335 (Pt 2), 433-440 (1998).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+Method+Of+Total+Lipid+Extraction+And+Purification%29%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+Of+Biochemistry+And+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Rapid Method Of Total Lipid Extraction And Purification).</a> Canadian Journal Of Biochemistry And Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).</li>
<li>Mukherjee, S., Lee, S., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+To+Cryptococcus+Neoformans+Glucuronoxylomannan+Enhance+Antifungal+Activity+Of+Murine+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Antibodies To Cryptococcus Neoformans Glucuronoxylomannan Enhance Antifungal Activity Of Murine Macrophages.</a> Infect. Immun. 63 (2), 573-579 (1995).</li>
<li>Deshaw, M., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+To+The+Cryptococcus+Neoformans+Capsular+Glucuronoxylomannan+Are+Ubiquitous%5BTitle%5D)+AND+%22In+Serum+From+HIV%2B+And+HIV-+Individuals.+Clinical+And+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antibodies To The Cryptococcus Neoformans Capsular Glucuronoxylomannan Are Ubiquitous.</a> In Serum From HIV+ And HIV- Individuals. Clinical And Experimental Immunology. 99 (3), 425-432 (1995).</li>
<li>Tripathi, K., Mor, V., Bairwa, N. K., Del Poeta, M., Mohanty, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyurea+Treatment+Inhibits+Proliferation+Of+Cryptococcus+Neoformans+In+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+In+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Hydroxyurea Treatment Inhibits Proliferation Of Cryptococcus Neoformans In Mice.</a> Frontiers In Microbiology. 3, 187(2012).</li>
<li>Chaka, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+Of+Phagocytosis+And+Killing+Of+Cryptococcus+Neoformans+By+Human+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells+By+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis Of Phagocytosis And Killing Of Cryptococcus Neoformans By Human Peripheral Blood Mononuclear Cells By Flow Cytometry.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2 (6), 753-759 (1995).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

哺乳動物細胞をプレーティングし、C.オプソニン化するとき、このプロトコルでの作業では、正確な細胞数を得ることが重要であるネオフォルマンス細胞 。これは試行間の変動を最小限に抑え、正確な1を確実に：研究を通してエフェクター比に1ターゲットを。これは、手順の間にRTで休んでオプソニン化酵母細胞または処理されたマクロファージ細胞を防ぐために、コレステロール枯渇および感染のタイミングを調整することも重要である。感染を開始する前に、長い待機期間は、抗体オプソニンの損失または枯渇コレステロールの補充につながる可能性があります。実験精度で行われた場合の結論は、食作用におけるコレステロールの役割について識別するためのデータ分析を可能にする。 技術の限界は、コレステロール枯渇は、細胞のようなマクロファージの食作用指数を低下させることによって、特定のメカニズムに関していかなる結論を防ぎ、そしてそれはefのかどうかは不明であるfectが原因コレステロールや、二次メカニズムに直接です。この静脈に沿ってさらに作業は、そのようなFcγ受容体などの食作用において機能することが...

食作用は、細胞外のエンティティは、宿主細胞によって内在化されるプロセスである。これは、病原体に対して防御する免疫系の武器庫で重要な武器ですが、プロセスは、多くの場合、内在化および体1全体に拡散を可能にするために、病原体によって打倒することもできる。食作用は、宿主細胞の細胞骨格の再編成を経由して添付ファイルや飲み込みにつながるいくつかのシグナル伝達事象によって媒介される。 「プロフェッショナル」食細胞が病原体を巻き込むとファゴソーム2を形成し、添付ファイルや葉状仮足の形成のために知らせるために侵入病原体の表面にオプソニンを認識して結合することができる。いわゆる「プロ」食細胞の中では、マクロファージである。マクロファージは、ほとんどの、探し出しおよび疾患を引き起こす物質を排除し、損傷組織を修復し、炎症を媒介含む保護機能を遂行高度に特殊化した細胞である食作用1,2のプロセスを介してこれらの。 クリプトコックス·ネオフォルマンスクリプトコッカスとして知られている重大な疾患を引き起こす病原性酵母の種である。 クリプトコッカス胞子はホストによって吸入され、通常は無症候性である肺感染症につながるされている。これは、露光が極めて一般的であると考えられている。ブロンクス·レバノン病院センターの小児伝染病から61子どものサンプルクリニックは、非感染し、感染大人3すべての調査対象者は、クリプトコッカス多糖類glucuronoxylomannanと他の研究に対する抗体を持っていたが、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）の両方で有病率を示していることがわかった4。肺胞マクロファージは、肺感染への応答の最初の行であり、ほとんどの場合、成功して病原体をオフにします。しかし、免疫無防備状態の個体（ 例えば、HIVおよびAIDS患者）において酵母は、マクロファージ内で生存することがある。これらの中で例は、マクロファージが病原体の複製のためのニッチとしての役割を果たすことができると、疾患を5致命的になり、中枢神経系（CNS）への普及を容易にすることができる- 8。 11 -それは、マクロファージはあっても「トロイの木馬」モデル3,9を経由して、血液脳関門を通過するために酵母を支援し、髄膜に直接酵母を配信することができると考えられている。したがって、食作用のプ​​ロセス、特にクリプトコッカス感染において、それに影響を与える要因を理解することが重要である。 15 -他の病原体システムでの以前の研究は、食作用12でプレーする重要な役割を持つとコレステロールによって形成されたコレステロールと脂質ラフトを指す。コレステロールは、哺乳動物細胞中で最も豊富な脂質種であり、25を含む-哺乳動物の細胞膜16の50％。これは、BIOPの調節に役割を果たすことが見出されている彼らの剛性17を変更することにより、膜のhysical性質。コレステロールおよびスフィンゴ脂質は一緒に脂質ラフトとして知られている膜内の脂質マイクロドメインを形成する。 18 -脂質ラフトは、カベオラの形成、ならびに16シグナリングの特定の種類の単離されたドメインを提供することに関与することが見出されている。サイズが小さいために、それは、生体内で脂質ラフトを研究することは困難である。脂質ラフトの役割を研究するための1つの有用な方法は、それらの成分を変化させることである。メチルβシクロデキストリン（MβCD）は、哺乳動物の膜からコレステロールを枯渇させることが見出されており、一般的に脂質ラフト18の役割を研究するために使用される化合物である。 このプロトコルでは、宿主細胞膜からのコレステロール枯渇およびCを貪食する宿主細胞の能力に枯渇の影響を定量化する方法を提示in vitroでのネオフォルマンス 。この手順は、細胞培養物を利用するtechniq感染のモデルとしての細胞株（J774A.1）のような不死化マクロファージ上のUE。コレステロール枯渇は、ステロールのサイズに固有の疎水性コアを有し、かつコレステロールは、膜19の外に描画するためのシンクとして作用することができるMβCDに曝露することによって達成された。コレステロール枯渇は、市販のキットを用いて定性的に薄層クロマトグラフィー（TLC）20に続く改変ブライ-ダイアー脂質抽出を用いて定量した。 。23 -食作用は、マクロファージを活性化するためのインターフェロンγとリポ多糖のカクテルと混合したオプソニン化酵母の文化を持つ細胞株を感染させることにより測定したクリプトコッカスは glucuronoxylomannan（GXM）抗体21を使用してオプソニン化した。染色および顕微鏡実験は、食作用の程度を評価する細胞の視覚化および食作用指数の計算を可能にした。総合すると、このプロトコルD生理学的過程で脂質組成の変化を統合基本的な方法はescribes。

<table><tbody><tr><td>クラスIIタイプA2バイオセーフティキャビネット</td><td>Labconco</td><td>3460009</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1細胞株</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>冷凍入荷。ATCCの培養方法を参照してください。</td></tr><tr><td>ダルベッコS Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>4 &deg;Cで37°Cまで暖かい。HI</td></tr><tr><td>の胎児のウシの血清のパフォーマンス プラス</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td>を使用する前に<td>-20度で凍結して保つ;DMEM</td></tr>ペ<tr><td>ニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U / ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>DMEM</td></tr><tr><td>Isotemp細胞培養インキュベーター</td>の供給に使用 <td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Model # 3530</td></tr><tr><td>96ウェル培養皿</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>10x Phosphate Buffered Saline</td><td>Fisher Scientific BioReagents</td><td>BP3994</td><td>1倍に希釈し、使用前にろ過またはオートクレーブします。</td></tr><tr><td>メチル-β;-シクロデキストリン</td><td>シグマライフサイエンス</td><td>C4555-10G</td><td>1x PBSに溶解して、10 mMおよび30 mMの濃度の溶液を作製</td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>Labline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td><td>Life Technologies Molecular Probes</td><td>A12216</td><td>コレステロールアッセイ用のすべての試薬はキットに含まれています。製造元の指示に従ってください。</td></tr><tr><td>96ウェル ブラックアッセイプレート</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>FilterMax マイクロプレートリーダー</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>モデル F5</td></tr><tr><td>TLC チャンバー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z126195-1EA</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498-4L</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-2L-R</td><td></td></tr><tr><td>TLC ペーパー</td><td>Whatman</td><td>3030917</td><td>TLCタンクに必要なサイズに縮小</td></tr><tr>ヒューム<td>フード</td><td></td><td></td><td>AIHA/ANSI規格に準拠した任意のヒュームフード</td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>コーニング社 Costar</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>トリプシンEDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>セルスクレーパー</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td>モデル アレグラ x-30R</td></tr><tr><td>Votexミキサー</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>バランス</td><td>メトラー・トレド</td><td></td><td>モデル#MS104S meaures 0.1 mg</td></tr><tr><td>ガラスパスツールピペット</td><td>フィッシャーブランド</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>コレステロール</td><td>アバンティ 極性脂質</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac濃縮器</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Model # SPD2010</td></tr><tr><td>石油エーテル</td><td>Fisher Scientific</td><td>E139-1</td><td></td></tr><tr><td>ジエチルエーテル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>309966</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>TLC Silica Gel 60 with concentrating zone</td><td>Analytical Chromatograhy Millipore</td><td>1.11845.0001</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ素チップ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>376558-50G</td><td></td></tr><tr><td>硫酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>塩化マンガン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>UVP EC3 Imaging System</td><td>Ultra-Violet Products Ltd.</td><td></td><td>デンシトメトリー分析にVision Works LSソフトウェアを使用する</td></tr><tr><td>ガラス底共焦点皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10C</td><td>www.glassbottomdishes.com</td></tr><tr><td>Cryptococcus neoformans (H99)</td><td></td><td></td><td>デューク大学医療センターYNB</td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td>239210</td>から入手 <td>準備手順については、メーカーを参照してください。グルコース濃度は20 g / Lを使用してください。</td></tr><tr><td>リポ多糖</td><td>類Sigma</td><td>L4391-1MG</td>を<td>1x PBSに溶解して、1 mg / mlストックを作成します。-20°Cで保管してください。</td></tr><tr><td>インターフェロンガンマ</td><td>シグマ</td><td>I4777は</td><td>、0.1 mg / mlのストック溶液を作るために1x PBSに溶解</td></tr>します <tr>グル<td>クロノキシロマンナン抗体(抗GXM)</td><td></td><td></td><td>Arturo Casadevallの研究室からの贈り物 濃度は1.98 mg / ml</td></tr><tr><td>です Giemsa</td><td>MP Biomedicals</td><td>194591</td><td>0.8 gのギムサを25 mlのグリセロールに溶解し、60 °Cに加熱します。Cを1時間。溶液に25mlのメタノールを加え、室温で少なくとも1ヶ月間熟成させます。</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Observer.D1 顕微鏡 with AxioCam MRm for taking images</td></tr></tbody></table>

マクロファージコレステロール枯渇との食作用への影響<em&gt;クリプトコックス·ネオフォルマンス</em

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

クリプトコッカス属、クリプトコッカスの病原性真菌によって引き起こされる生命を脅かす感染症である。感染は、肺深部に複製することができる胞子の吸入時に起こる。マクロファージによるクリプトコッカスの食作用は、疾患が致死髄膜脳炎を引き起こす中枢神経系に拡散することができる方法の一つである。したがって、 クリプトコッカスおよびマクロファージとの間の関連の研究では、感染の進行を理解する上で重要である。本研究ではCでマクロファージ感染性を研究するためのステップバイステップのプロトコルについて説明in vitroでのネオフォルマンス 。このプロトコルを使用して、宿主 - 病原体相互作用のホストステロールの役割が検討されている。メチルの異なる濃度 - シクロデキストリン（MCD）は、マウス細網肉腫マクロファージ様細胞株J774A.1からコレステロールを枯渇させるために使用された。コレステロール枯渇を確認し、商業的にご利用でき、両方を用いて定量した電子コレステロール定量キット、薄層クロマトグラフィー。コレステロール枯渇細胞は、リポ多糖（LPS）およびインターフェロンγ（IFNγ）を使用して活性化し、1のエフェクター対標的比での抗体-オプソニンクリプトコックス·ネオフォルマンス 、野生型H99細胞を感染させた：1。感染細胞をC.とのインキュベーションの2時間後にモニターしたネオフォルマンスおよびそれらの食作用指数を算出した。コレステロール枯渇は、食作用指数の有意な減少をもたらした。提示されたプロトコルは、実験室環境での感染過程の開始を模倣し、感染性に対するホスト脂質組成の役割を研究するための便利な方法を提供する。

コレステロール枯渇 1×PBS対照と比較してアンプレックスレッドコレステロールアッセイキットで、製造業者の指示に従って、プロトコルのステップ1.3で予約された上清の分析は、MβCD処理された試料中のコレステロール濃度の上昇をもたらす。細胞型およびMβCD濃度使用コレステロール枯渇に応じて変化してもよい。 10mMのMβCDで処理J774は、約50％の枯渇が観察された。枯渇は、ステップ1.4で回収した上清および細胞溶解物（ 図1）から得られた値を用いて算出することができる。 TLCを用いて解析し、細胞溶解物は、MβCD（ 図2A）の濃度を増加させることで処理した細胞におけるコレステロールの染色の顕著な減少を示す。 TLCのデンシトメトリー分析は、定量的アッセイ（ 図2B）と同様の傾向を示している。ブライ·ダイアーの方法は、粗製EXTを与えます総脂質のRACT、それがコレステロールの標準を利用して適切なバンドを同定するために、脂質の適...

この記事では、マクロファージをCryptococcus neoformansに感染させるためのプロトコルについて説明します。また、マクロファージからのステロールの枯渇方法についても説明します。これらのプロトコルは、in vitroで真菌感染症を研究し、そのような感染症におけるステロールの役割を調べるためのガイドを提供します。

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

この手順の全体的な目的は、マクロファージによるCryptococcus neoformansの取り込みにおけるコレステロールの役割を解明することです。まず、メチル-β-シクロデキストリンを用いて、マウスマクロファージ細胞株からコレステロールを枯渇させます。次に、薄層クロマトグラフィーおよび市販のキットを用いて、コレステロールの枯渇を確認し、定量します。次に、Cryptococcus neoformans細胞を、グルクロン酸、キシロース、マンノース、またはCryptococcus莢膜のGXMA成分に特異的な抗体でオプソニン化します。最後に、コレステロール除去マクロファージに、オプソニン化したCryptococcus neoformansを感染させます。最終的に、蛍光顕微鏡および光学顕微鏡を用いて感染細胞を可視化し、食作用の程度を算出します。この手法の主な利点は、基本的な研究設備を用いて比較的短時間で実施でき、かつ定量的な結果を得られることです。この方法は、真菌の病原性に関する分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。例えば、真菌病原体の視点において、宿主の脂質グラフトはどのような役割を果たしているのでしょうか。マクロファージへの内部移行は、重大な疾患の発症における重要なステップであるため、本手法の意義は、真菌感染症の治療や対策へと広がります。これらの手法は真菌病原体の感染性に関する知見を提供できるだけでなく、絶対細胞内寄生病原体などの他の生物にも適用可能です。滅菌済みのバイオセーフティキャビネット内で、96ウェル培養プレートの1ウェルあたり10⁵個のJ774A.1マクロファージ様細胞を播種します。10% FBSおよび1%ペニシリン・ストレプトマイシン（PS）を添加した200 µLのDMEM中で、37 °C、5% CO2条件下にて一晩インキュベートし、翌日に使用します。細胞単層から培地を除去し、ろ過済みまたはオートクレーブ滅菌済みのPBSを用いて細胞を2回洗浄します。目的の濃度のメチル-β-シクロデキストリン（MβCD）溶液、またはコントロールとして1×PBSを200 µL加え、37 °Cで振盪しながら30分間インキュベートします。上清を除去し、市販のキットを用いた定量分析のために室温で保存します。PBSまたは無血清DMEMを用いたこの処置の直後に、コレステロール定量を行うか、あるいは感染工程に進む前に、細胞を2〜3回洗浄します。滅菌済みのバイオセーフティキャビネット内で、コレステロールを枯渇させたマクロファージに感染させるステップに移ります。1ウェルあたり10⁵個のマクロファージ様細胞を播種します。96ウェルプレートを用い、37 °C、5% CO2の条件下で一晩インキュベートします。ストリークプレートから1つのコロニーを分離し、10 mLのYNBに接種し

macrophage-cholesterol-depletion-its-effect-on-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

マクロファージは、多くの組織の恒常性と病理学の中心的な役割を果たしています。ここで紹介するプロトコルは、マクロファージを枯渇させるための方法について説明します...

マウスのマクロファージの枯渇と再構成

このビデオでは、マクロファージにおける病原菌であるCryptococcus...

マクロファージにおけるCryptococcus neoformans感染を検出するための乳酸デヒドロゲナーゼ放出アッセイ

このビデオでは、pH感受性蛍光色素染色真菌細胞を使用して、アスピリンとイブプロフェンがマクロファージ食作用に対する最小阻害濃度での影響を評価する方法を紹介しています。これらの薬剤はシクロオキシゲナーゼ-2を阻害し、プロスタグランジン形成を減少させ、マクロファージ食作用を促進することが、pH感受性色素の蛍光測定で観察されます。...

マクロファージの食作用能力に対するアスピリンとイブプロフェンの効果

我々は、のライブセルビデオ顕微鏡のための方法を説明します...

真菌病原体の食作用の生細胞ビデオ顕微鏡

共焦点顕微鏡によって貪食されたアスペルギルス胞子の成長を制御するために単離したマウス肺胞マクロファージの能力を評価する方法。...

共焦点顕微鏡による絶縁型肺胞マクロファージの抗真菌活性を評価する

私たちは、マクロファージCを可視化する方法を説明しますネオフォルマンス （CN）デジタル光学顕微鏡を用いて非溶解性エキソサイトーシスの過程で特定の重点を置いて、リアルタイムで相互作用。この技術を用いて個別に感染したマクロファージは、この現象のさまざまな側面を確認するために研究することができる。...

の非溶解性エキソサイトーシスの可視化クリプトコッカス·ネオフォルマンスデジタル光学顕微鏡を使用したマクロファージから

ここでは、接着性マクロファージ細胞株による蛍光粒子の食作用を蛍光測定法を用いて定量化するプロトコールを紹介します。この方法により、粒子の内在化とそれに伴うアクチン重合のハイスループット定量が容易になります。...

マクロファージ食作用およびアクチン重合の評価のためのハイスループット蛍光技術

マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF)分化ヒト単球由来マクロファージの細胞培養のためのプロトコールが提示されます。このプロトコルは、単球の凍結保存とマクロファージへのバルク分化を組み合わせて利用します。その後、回収したマクロファージを、実験に必要な細胞密度の培養ウェルに播種することができます。...

マクロファージコロニー刺激因子分化したヒト単球由来マクロファージの文化

ヒト免疫不全ウイルス(HIV)1型に感染した、または感染していない生細胞の細胞中心に向かって移動するファゴソームの速度を測定する方法を、蛍光感染細胞を特定するためのスピニングディスク共焦点蛍光顕微鏡とファゴソームを検出するための明視野顕微鏡を用いて説明します。...

HIV-1に感染したライブ初代ヒトマクロファージで測定ファゴソームの移行と速度

脂質は細胞機能に重要な役割を果たしていることが知られています。ここでは、好中球細胞外トラップ形成の基礎となるメカニズムのより良い理解を得るために、HPTLC及びHPLCの両方を使用することにより、コレステロールレベルに重点を置いて、好中球の脂質組成を決定するための方法について説明します。...

脂質好中球の変化と好中球細胞外トラップのその後の形成を研究する方法

ここで提示されるプロトコルは、pH感受性蛍光分子に結合された非オプゾン化酵母(zymosan)粒子のマクロファージ(MΦ)食作用の間葉幹細胞(MSC)媒介性調節の動的画像を定量化し、生成するプロトコルです。...

間葉系幹細胞のマクロファージ食前細胞の調節;定量とイメージング

学ぶマクロファージのコレステロール枯渇法とCryptococcus neoformansへの食作用への影響。メチルベータシクロデキストリンを用いたin vitroプロトコルで、真菌感染症のメカニズム解明に貢献します。

マクロファージコレステロール枯渇との食作用への影響

さらに動画を探す