液体および固形腫瘍由来の癌細胞のプロテオームの定量的質量分析プロファイリング

この手順の全体的な目標は、液体および固体腫瘍のタンパク質発現プロファイルを解明することです。これは、まず患者由来の血液または組織サンプルからがん細胞を濃縮することによって達成されます。第2ステップでは、がん細胞からタンパク質を単離し、腫瘍特異的なスサック定量標準と混合します。

最終ステップでは、タンパク質混合物が消化されます。最終的に、質量分析法を使用して、液体および固体腫瘍からのタンパク質発現プロファイルを示します。この方法は、薬剤標的や治療耐性のメカニズムをどのように特定できるかなど、腫瘍学および病理学分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。

この方法はバイオマーカーの発見に関する洞察を提供しますが、多様ながん、固体がん、液体がんの研究など、他のシステムにも適用できます。手順を実演するのは、Dr.Hannibal Berger Institute for Pathology と私の研究室のDr.Christophe Lantz フローサイトメトリーによる蛍光選別用の液体腫瘍細胞を準備するために、PBSに懸濁したヒト単核細胞サンプルの1ミリリットルとネガティブコントロール用の2%FBSを引用することから始めます。次に、白血病細胞集団を単離し、氷上でのコンペンセーションコントロールのために、適切な抗体と細胞をインキュベートします。

30分後、PBSと2%FCSで細胞を2回洗浄します。次に、細胞生存率染色剤を適切なチューブに加え、回路図に従って細胞を選別します。IMDMと10%FCSでサンプルを採取し、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションによって固形腫瘍を収集します。

まず、ミクロトームを使用して、ホルミン固定パラフィン包埋サンプルから厚さ5〜10マイクロメートルの切片を切断します。次に、切片をフィルムで覆われたメンブレンスライドにマウントし、1時間後にサンプルを摂氏37度で乾燥させます。キシレン無水エタノール、70%エタノールおよび水中で1分間連続インキュベーションすることにより、切片を脱parizeし、再水和します。

次に、切片をヘマチンで20秒間染色します。それらを水道水ですすぎ、レーザーキャプチャマイクロダイセクションシステムで目的の細胞を採取して、選別された液体腫瘍細胞からタンパク質を抽出します。サンプルを3回スピンダウンし、2回目の遠心分離では500マイクロリットルの冷たいPBSで細胞を洗浄します。

次に、細胞を6細胞に対して10回あたり40マイクロリットルの溶解緩衝液でインキュベートします。15分後、ライセートを遠心分離し、上清を含む透明なライセートを新しい反応チューブに移して、微小解剖した固形腫瘍細胞からタンパク質を抽出します。組織サンプルを60マイクロリットルの組織溶解バッファーと摂氏72度でインキュベー

15分後、短時間の遠心分離で液体を回収し、上清を新しい反応チューブに移します。次に、ライセートを氷上で3分間超音波処理し、続いて、摂氏99度の20%ESALナトリウムを持つ15マイクロリットルで、600RPMの攪拌を備えた加熱ブロックでインキュベーションします。1時間後、ライセートをスピンダウンし、Sナチンを新しいチューブに移します。

次に、クリアされた細胞およびスーパーSLAC標準のタンパク質濃度を決定し、次に同量の腫瘍細胞片をスーパーSLAC標準と混合し、続いてリチウムを混合します。デザル硫酸バッファーをサンプル量の25%で、還元剤をサンプル量の10%で行います。次に、得られた溶液を加熱ブロック内で摂氏72度で10分間加熱します。

プレートリーダーで固形腫瘍ライセートのタンパク質濃度を測定するには、標準的なウシ血清アルブミン希釈液シリーズ、ライセート、および適切なスーパーSLACスタンダードを、市販のタンパク質アッセイおよび96ウェルプレートと混合します。1分間振とうした後、サンプルを適切な時間インキュベートし、メーカーが指示した吸光度を測定します。次に、澄澄ましたライセートとスーパーSLAC標準試料を等量、200マイクロリットルの尿素とフィルターユニットで混合し、サンプルを30分間遠心分離します。

液体クロマトグラフィーおよび質量分析により腫瘍細胞溶解物を解析する。まず、目的のペプチドを30マイクロリットルのローディングバッファーで超音波処理槽中で5分間分離します。次に、タンパク質をスピンダウンし、透明な上清を質量分析オートサンプラーバイアルに移します。

次に、分析ごとに5マイクロリットルのサンプルをナノLC、ms MSシステムオート、サンプラーに注入し、逆フェーズC 18 precoマウントおよびベントカラムセットアップでペプチドをオンラインで濃縮および脱塩します。最後に、セルフペースナノススプレーカラムの逆相C 18マイクロカラムでペプチドを分離します。毎分300ナノリットルで、5〜35%アセチルニトリル対0.1%ギ酸水溶液の90分間のグラジエントを使用して、ナノスプレーイオン源を使用してペプチドを転写し、分析します。

トップ15のデータ依存型取得法を使用して、ペプチドの分析にさまざまなタイプの質量分析計を使用することができます。患者から採取した液体および固形腫瘍のプロテオミクスプロファイリングは、新しい診断および予測バイオマーカーの発見に有望なアプローチです。例えば、この第1の図は、液体腫瘍サンプルからCD one 17染色、白血病細胞を単離するための例示的なゲーティング戦略を示している。

一方、ここでは、先ほど示したように、厚さ5〜10マイクロメートルの切片をフィルムで覆ったメンブレンスライドに取り付けています。示されているように、関心領域を手動で選択し、レーザーキャプチャマイクロダイセクションによって切除すると、液体および固体腫瘍サンプルのタンパク質発現プロファイルの教師なしクラスター分析を質量分析によって実行でき、異なる腫瘍エンティティをそれらの異なるタンパク質発現プロファイルに従って明確に分離することができます。これらのデータは、最終的には臨床的に関連性のあるバイオマーカーの確立に貢献する可能性があります。

リン酸化やUIC換気などの翻訳後修飾のための濃縮戦略の実施も、その開発後に調節不全のキナーゼパターンをどのように特定できるかなどの追加の質問に答えるためにも実行できます。この技術は、病理学および腫瘍学の分野の研究者が、さまざまながんエンティティの特定のバイオマーカーとシグナル伝達経路を探索するための道を切り開きます。このビデオを見れば、質量分析によってタンパク質の発現パターンとシグナル伝達状態を分析するために、がんからタンパク質を亜集団として単離する方法を十分に理解できるはずです。