Name: ゼブラフィッシュ胚における機械的血管損傷 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ胚の機械的血管損傷法。尾静脈穿刺により止血と炎症反応をリアルタイム顕微鏡で観察し、創傷治癒プロセスを可視化する。Danio rerioを用いたこのモデルは、血管生物学研究に有用である。

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著者は、有益な議論をしてくれたStephen Wilson博士とLisa Wilsbacher博士に感謝します。この研究は、NIH HL054737によって部分的に支援されました。

注：ゼブラフィッシュを使用した手順は、UCSFの施設内動物管理使用委員会によって承認された。 ツールの調製<ol><li>ピンホルダーに特徴点のピンを挿入し、ピンをクランプ。 </li><li>先端の細い鉗子を使用して、慎重にわずかにフックを作成するために、ピンの先端を曲げる。 </li><li>負傷中の胚の操作および安定化のために、ラジオペンチを使用して、インスリン注射器に取り付けられた28ゲージ1/2インチの針の端を曲げ。 </li></ol>傷害のためのゼブラフィッシュ胚の作製<ol><li>ゼブラフィッシュの繁殖ペアを設定し、以前に22示すように、卵の水（60ug / mLの水族館塩）で卵を集める。 </li><li>胚はメラニン化を防ぐために、約8時間後に受精（HPF）であるとき、卵の水に0.003％、N-フェニルチオ尿素（PTU）を追加します。 </li><li>先端の細い鉗子を用いた実験に先立ってDechorionate 2日後の受精（DPF）の胚。 <br/&gt;注：循環開始後胚はいつでも怪我をすることができます。ここに示されたデータは、胚のdpf 2のためであるが、技術は成功し5のdpfまでの胚で適用されている。 </li><li> 0.02％緩衝化3-アミノ安息香酸（トリカイン）前の操作に約10分を有する胚を麻酔。 </li></ol>胚の3。機械的血管損傷<ol><li>転送ピペットを用いて、解剖実体顕微鏡でうつ病のスライドに麻酔をかけた胚を転送します。 </li><li>利き手で胚を操作するために注射針の短い平らな面を使用して、腹面が針から離れて向けてその側に胚を配置する。 </li><li>先端で特徴点のピンの位置を決め泌尿生殖器の開口部に魚の後部の腹面に対して直接指摘した。湾曲した先端が尾静脈（ 図1 &lt;に直接周皮を貫通することができるようにわずかな角度で特徴点のピンを配置します/強い&gt;）。 </li><li>胚を操作するために注射針を使用して、少し静脈にピンをフックするピンに胚をタップして特徴点ピンと尾静脈を貫通。 </li><li>注射針を使用して、容器内の小さな涙を作成するために離れて特徴点ピンから胚を引き出します。 注：成功した損傷は静脈から即時の出血になります。 </li></ol>止血4.分析<ol><li>目に見えて、この手順のために血液細胞の循環を持つ唯一の胚を選択してください。 </li><li>とすぐに特徴点ピンが容器から引っ張られるようにタイマーを開始する準備をします。 </li><li>とすぐに血液損失を傷から可視化することができるようにタイマーを起動します。傷口からの血液損失がなくなると、タイマーを停止し、出血時間として総時間を記録する。凝固が抑制される場合には、もはや目に見えて循環する血液細胞が存在しないときまでの時間を記録する。 </li></ol>創傷治癒の5.分析<ol><li>転送POS顕微鏡用ガラスボトムイメージング皿上にT-傷害動物。 </li><li>卵の水の大部分を削除します。 </li><li>アガロース42〜45ºCに加熱し、卵の水に溶解し、0.02％トリカインで補充0.3から1.2パーセントの低融点で胚をカバーする。 </li><li>ピンセットを用いて、その両側に位置胚。 </li><li>アガロースが冷却した後、卵の水中の0.02％トリカインで料理を埋める。 </li><li>明視野、落射蛍光、または共焦点顕微鏡を用いて画像を取得する。 </li><li>ピンセットを用いてアガロースから胚を取り出し、卵の水に戻って転送する。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

ゼブラフィッシュは、レーザー傷害13-15、レーザー誘発血栓16、および上皮創傷10を含む創傷の異なるタイプのモデルとして成功裡に使用されている。我々は、実行が簡単であり、リアルタイムの顕微鏡検査に非常に適しているin vivoモデルで制御怪我を生産機械的損傷の方法を報告している。迅速かつ測定可能な止血応答映像やタイムラプス顕微鏡を用いてモニターすることができる再現可能な創傷修復プログラムで損傷をもたらす。 そのシンプルかつ血管微視的に定義され、アクセス可能な部位で再現性のある損傷を許容する解剖学、最も血管および造血細胞型の存在をステレオタイプは、傷害に対する応答を研究するためのゼブラフィッシュ胚を特に有用にする。しかし、ゼブラフィッシュの胚は、ほとんどのAPこのシステムを作り、開発5,6の最初の数週間の間に機能的なリンパ球を持っていない炎症および修復における自然免疫の寄与を研究するためpropriate。現在、トランスジェニックゼブラフィッシュの多種多様な血小板、フィブリノゲ...

ゼブラフィッシュは、血管の発達、血管新生、造血の発達と病理学1-3など、血管生物学のさまざまなトピックを研究するために広く使用されてきました。胚は、受精後1日(dpf)1,4,5までに、白血球や自然免疫系の他の構成要素と同様に機能循環を発達させます。損傷に対する炎症性および白血球の反応の保存により、ゼブラフィッシュの胚は、結核性感染症、腸炎、組織再生6-9などの多様な炎症過程の情報モデルとなっています。ゼブラフィッシュの胚は、特に上皮創傷と好中球反応の文脈で、損傷関連の炎症を研究するために使用されてきました10,11。胚の損傷は、損傷部位の細胞からの高度に保存された細胞応答と、損傷に応答してその分解能を調節するために動員された自然免疫細胞11,12をもたらします。他の損傷モデルでは、集束レーザーパルスを使用して、ニューロン、筋肉細胞、心筋細胞などの特定の細胞タイプに損傷を空間的に局在化しています13-15。
ゼブラフィッシュの胚は、薬理学的および遺伝的操作の条件下での止血および血栓症を研究するためのモデルとして使用されてきました。これは、機械的およびレーザーによる血栓形成の両方を使用して行われます16-19。凝固カスケードの成分はよく保存されているようであり、トランスジェニックは凝固部位での血小板およびフィブリン沈着の詳細な研究を可能にしました17,20,21。この論文で紹介する手順は、血管の破損、血栓の形成と解決、および血管の修復につながる機械的な血管損傷を研究するためのシステムを提供することにより、これらの方法を補完します。

<table><tbody><tr><td>微細ピン</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>26002-10</td><td>先端直径0.0125 mm、ロッド直径0.1 mm</td></tr><tr><td>ピンホルダー</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>26016-12</td><td></td></tr>デュ<tr><td>モン#5ファインチップ鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>ガラス窪みスライド</td><td>水生生態系</td><td>M30</td><td></td></tr><tr><td>低融解アガロース</td><td>ロンザ&nbsp;</td><td>50081</td><td>42 & ordm;C</td></tr><tr><td>N-フェニルチオ尿素 (PTU)</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>3-アミノ安息香酸 (トリカイン)</td> <td>シグマ アルドリッチ</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>ヒルディン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>H7016</td><td></td></tr><tr><td>ガラス底イメージングディッシュ</td><td>マットテック</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>SZH10</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>アクシオオブザーバー</td><td></td></tr><tr><td>水族館塩</td><td>インスタントオーシャン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>インスリンシリンジ28.5G針</td><td>ベクトンディキンソン&nbsp;</td><td></td><td></td>329461</tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュ胚における機械的血管損傷

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)の胚は、さまざまな発生過程や病気の過程を研究するための強力なモデルであることが証明されています。 外部発生と光学的透明性により、これらの胚は特に顕微鏡観察に適しており、特定の細胞タイプを蛍光タンパク質で標識する多数のトランスジェニック株が利用可能であり、ゼブラフィッシュの胚は、in vivoでの損傷や修復中の血管、造血、およびその他の細胞タイプの相互作用を視覚化するための理想的なシステムとなっています. ゼブラフィッシュのフォワード遺伝学とリバース遺伝学は十分に発達しており、薬理学的操作が可能です。これらの特徴のいくつかを利用して、止血や血管修復などの血管損傷に対する反応を研究するマイクロマニピュレーション技術を使用した機械的血管損傷モデルについて説明します。ビデオ顕微鏡とタイムラプス顕微鏡の組み合わせを使用して、この血管損傷の方法が止血および創傷修復中に測定可能で再現性のある反応をもたらすことを実証します。この方法は、全動物モデルで血管の損傷と修復を詳細に研究するためのシステムを提供します。

機械的な血管損傷が2 dpfの胚（ - C図2A）で行った。 （ 図2D）出血の停止までの時間によって測定されるように、迅速かつ信頼性の高い凝固応答の傷害をもたらす。凝固応答の差異を測定することができたか否かを判断するために、抗凝固ヒルジンはのために（直前に（水に溶解μlのヒルジンあた​​り1単位の5~10オランダ）を創傷にキュビエのダクトへの注入によって胚に投与したキュビエのダクト内に注射のデモンストレーション、前回のJoveの記事23）24を参照してください。損傷前にヒルジンの投与は、車両制御（ 図2D）対出血時間の増加大幅にもたらした。 と赤血球（gata1a：DsRedの：血管損傷及び凝固の証拠は、直ちに損傷後の内皮のためのトランスジェニック系統（EGFP kdrl）を使用して見ることができます</EM&gt;）25,26マーカー。画像を順次エピ蛍光を用いて、12時間の期間のために5分ごとに取得...

この記事は、ゼブラフィッシュの胚に機械的な血管損傷を作成する方法について説明しています。この損傷モデルは、リアルタイム顕微鏡検査に最適な生物の止血、損傷関連炎症、および創傷治癒を研究するためのプラットフォームを提供します。

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

本手順の総合的な目的は、ゼブラフィッシュ胚に機械的な血管損傷を作成することです。これは、極細ピンを用いてゼブラフィッシュ胚の脈管（coddle vein）を穿刺することで達成されます。次に、傷口から血液が能動的に流れている時間を測定することにより、止血能を評価します。次に、血管修復などの創傷治癒の様相を可視化するために、タイムラプス顕微鏡観察を行います。その結果、ゼブラフィッシュ胚における機械的な血管損傷を用いることで、止血時間や血流再開までの時間など、止血および創傷修復の側面を再現性高く測定できることが示されました。マウスやその他の標準的な損傷モデルに対する本手法の主な利点は、ゼブラフィッシュ胚では、炎症、止血、および修復をリアルタイム顕微鏡観察によって容易に可視化できる点にあります。まず、微細ピンをピンホルダーに挿入し、精密ピンセットでピンを固定します。ピンの先端を慎重に曲げて小さなフックを作り、損傷を与える際に胚を操作し、安定させられるようにします。また、インスリン注射器に取り付けた28ゲージ、1/2インチの針の先端を、ラジオペンチで曲げます。次に、既報の手法に従ってブリーディングペアを組み、卵水中で卵を回収してゼブラフィッシュ胚を準備します。受精後8〜24時間（HPF）で、受精後2日（DPF）における色素沈着を防ぐため、卵水にPTUを添加します。受精後2日（DPF）に、微細ピンセットを用いて胚の脈絡膜（卵膜）を除去し、最終濃度0.02%のBuffered tricaを用いて胚を麻酔させ、胚の血管を機械的に損傷させます。転送ピペットを使用して、麻酔した胚をディプレッションスライドの上に置きます。解剖顕微鏡の下で、利き手にシリンジ針の短く平らな面を持って、胚を側臥位にし、腹側が針と反対側を向くように配置します。次に、微細ピンの先端を、泌尿生殖孔の後方の魚の腹側に直接向けて配置します。湾曲した先端が周皮を貫通し、直接コドル脈（coddle vein）に刺さるように、わずかに角度をつけて保持します。次に、シリンジ針を用いて胚を操作します。微細ピンを使用してコドル脈を貫通させます。シリンジ針で胚をピンに軽く叩き込むようにして、ピンの先を脈にわずかに引っ掛けます。胚を微小ピンから引き離し、血管に小さな裂傷を作ります。処置が成功すると、静脈から直ちに出血します。この手順では、血球の循環が目視で確認できる胚のみを選択してください。ミヌシアピンを挿入したまま血管から抜き、傷口から出血が確認でき次第、タイマーを開始します。傷口からの出血が止まった時点でタイマーを停止し、その合計時間を出血時間として記録します。凝固が抑制されている場合は、視認できる循環細胞がなくなった時点の時間を記録してください。損傷後の動物を顕微鏡観察用のガラスボトムイメージングディッシュに移し、卵水の大部分を除去します。その後、0.02% tricaを添加し42～45°Cに加熱した0.3～1.2% 低融点アガロースで胚を覆います。ピンセットを用いて、胚を横向きに配置します。aroが冷却された後、ディッシュに0.02% tricaを含む卵水を満たします。イメージング後、明視野エピ蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を用いて画像を撮影します。ピンセットを使用して、胚を卵水に戻します。このビデオでは、2D PF胚に対して行われた機械的な血管損傷を示しています。活動性の出血が見られ、その後に出血の停止が続きます。止血までの時間で測定されるこの損傷は、迅速かつ信頼性の高い凝固反応を引き起こし、凝固反応に差があるかどうかを測定できるようにします。抗凝固剤のodinを、損傷直前にQVAの管に注入することで胚に投与しました。ここで示されているように、この薬剤は対照群（ビークル）と比較して出血時間を有意に延長させました。このビデオでは、血管内皮マーカーおよび赤血球マーカーのトランスジェニック系統を用いることで、損傷直後の血管損傷と凝固の証拠を確認することができます。創傷修復のさまざまな段階を示す画像を、12時間にわたって5分ごとに取得しました。このビデオを視聴することで、ゼブラフィッシュ胚に機械的損傷を誘発する方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

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ゼブラフィッシュ胚における機械的血管損傷

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