Name: ヌクレオカプシドアニーリング媒介電気泳動（NAME）アッセイは、HIV-1ヌクレオカプシド阻害剤の迅速な同定を可能にする (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 学ぶ HIV-1ヌクレオカプシド阻害剤の迅速同定法。NAMEアッセイを用いて、ゲル電気泳動でシャペロン活性を阻害する化合物を効率的にスクリーニングする技術を習得できます。

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この作業は、Ministero degli Affari Esteri (MAE, DRPG, Unità per la cooperazione scientifica e tecnologica, Grant: PGR Italy-USA) と MIUR, Progetti di Ricerca di Interesse Nazionale (Grant: 2010W2KM5L_006) の支援を受けました。

<ol><li>Druillennec, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mimic+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+impairs+reverse+transcription+and+displays+antiviral+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A mimic of HIV-1 nucleocapsid protein impairs reverse transcription and displays antiviral activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4886-4891 (1999).</li>
<li>Darlix, J. L., Garrido, J. L., Morellet, N., Mely, Y., de Rocquigny, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties%2C+functions%2C+and+drug+targeting+of+the+multifunctional+nucleocapsid+protein+of+the+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Properties, functions, and drug targeting of the multifunctional nucleocapsid protein of the human immunodeficiency virus.</a> Adv Pharmacol. 55, 299-346 (2007).</li>
<li>Thomas, J. A., Gorelick, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleocapsid+protein+function+in+early+infection+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Nucleocapsid protein function in early infection processes.</a> Virus Res. 134, 39-63 (2008).</li>
<li>Mirambeau, G., Lyonnais, S., Gorelick, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features%2C+processing+states%2C+and+heterologous+protein+interactions+in+the+modulation+of+the+retroviral+nucleocapsid+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Features, processing states, and heterologous protein interactions in the modulation of the retroviral nucleocapsid protein function.</a> RNA Biol. 7, 724-734 (2010).</li>
<li>Zeng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+nucleation%2C+reverse+annealing%2C+and+chaperone+function+along+the+reaction+path+of+HIV-1+single-strand+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Probing nucleation, reverse annealing, and chaperone function along the reaction path of HIV-1 single-strand transfer.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 12651-12656 (2007).</li>
<li>Basu, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand+transfer+events+during+HIV-1+reverse+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Strand transfer events during HIV-1 reverse transcription.</a> Virus Res. 134, 19-38 (2008).</li>
<li>Guo, J., Henderson, L. E., Bess, J., Kane, B., Levin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+nucleocapsid+protein+promotes+efficient+strand+transfer+and+specific+viral+DNA+synthesis+by+inhibiting+TAR-dependent+self-priming+from+minus-strand+strong-stop+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 nucleocapsid protein promotes efficient strand transfer and specific viral DNA synthesis by inhibiting TAR-dependent self-priming from minus-strand strong-stop DNA.</a> J Virol. 71, 5178-5188 (1997).</li>
<li>Godet, J., Mely, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+studies+of+the+nucleic+acid+chaperone+properties+of+the+HIV-1+nucleocapsid+protein%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Biophysical studies of the nucleic acid chaperone properties of the HIV-1 nucleocapsid protein.</a> RNA Biol. 7, 687-699 (2010).</li>
<li>Darlix, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+nature+and+specific+functions+of+the+HIV-1+nucleocapsid+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flexible nature and specific functions of the HIV-1 nucleocapsid protein.</a> J Mol Biol. 410, 565-581 (2011).</li>
<li>Lapadat-Tapolsky, M., Pernelle, C., Borie, C., Darlix, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+nucleic+acid+annealing+activities+of+nucleocapsid+protein+from+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of the nucleic acid annealing activities of nucleocapsid protein from HIV-1.</a> Nucleic Acids Res. 23, 2434-2441 (1995).</li>
<li>Vo, M. -N., Barany, G., Rouzina, I., Musier-Forsyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+studies+of+mini-TAR+RNA%2FDNA+annealing+in+the+absence+and+presence+of+HIV-1+nucleocapsid+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic studies of mini-TAR RNA/DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein.</a> J Mol Biol. 363, 244-261 (2006).</li>
<li>Beltz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determinants+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+for+cTAR+DNA+binding+and+destabilization%2C+and+correlation+with+inhibition+of+self-primed+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural determinants of HIV-1 nucleocapsid protein for cTAR DNA binding and destabilization, and correlation with inhibition of self-primed DNA synthesis.</a> J Mol Biol. 348, 1113-1126 (2005).</li>
<li>Mori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleocapsid+Protein%3A+a+Desirable+Target+for+Future+Therapies+against+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nucleocapsid Protein: a Desirable Target for Future Therapies against HIV-1.</a> Curr Top Microbiol Immunol. , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Sosic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design%2C+synthesis+and+biological+evaluation+of+TAR+and+cTAR+binders+as+HIV-1+nucleocapsid+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22MedChemComm%22%5BJournal%5D)">Design, synthesis and biological evaluation of TAR and cTAR binders as HIV-1 nucleocapsid inhibitors.</a> MedChemComm. 4, 1388-1393 (2013).</li>
<li>Tabarrini, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+Anti-HIV+Transcription+Inhibitor+Quinolones%3A+Identification+of+Potent+N1-Vinyl+Derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Chemmedchem%22%5BJournal%5D)">Studies of Anti-HIV Transcription Inhibitor Quinolones: Identification of Potent N1-Vinyl Derivatives.</a> Chemmedchem. 5, 1880-1892 (2010).</li>
<li>Hagan, N., Fabris, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+mass+spectrometric+determination+of+the+stoichiometry+and+binding+affinity+of+the+complexes+between+nucleocapsid+protein+and+RNA+stem-loop+hairpins+of+the+HIV-1+Psi-recognition+element%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Direct mass spectrometric determination of the stoichiometry and binding affinity of the complexes between nucleocapsid protein and RNA stem-loop hairpins of the HIV-1 Psi-recognition element.</a> Biochemistry. 42, 10736-10745 (2003).</li>
<li>Ivanyi-Nagy, R., Davidovic, L., Khandjian, E. W., Darlix, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disordered+RNA+chaperone+proteins%3A+from+functions+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Disordered RNA chaperone proteins: from functions to disease.</a> Cell Mol Life Sciences: CMLS. 62, 1409-1417 (2005).</li>
<li>Zagotto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+G-quadruplex+vs+double-stranded+DNA+recognition+in+regioisomeric+lysyl-peptidyl-anthraquinone+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Tuning G-quadruplex vs double-stranded DNA recognition in regioisomeric lysyl-peptidyl-anthraquinone conjugates.</a> Bioconjug Chem. 22, 2126-2135 (2011).</li>
<li>Carlson, C. B., Vuyisich, M., Gooch, B. D., Beal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferred+RNA+binding+sites+for+a+threading+intercalator+revealed+by+in+vitro+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Preferred RNA binding sites for a threading intercalator revealed by in vitro evolution.</a> Chem Biol. 10, 663-672 (2003).</li>
<li>Gooch, B. D., Beal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+duplex+RNA+by+helix-threading+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Recognition of duplex RNA by helix-threading peptides.</a> J Am Chem Soc. 126, 10603-10610 (2004).</li>
<li>Kanevsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determinants+of+TAR+RNA-DNA+annealing+in+the+absence+and+presence+of+HIV-1+nucleocapsid+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Structural determinants of TAR RNA-DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein.</a> Nucleic Acids Res. 39, 8148-8162 (2011).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

NAMEは急速​​にHIV-1、新規な抗HIV薬の探索において興味深い標的のヌクレオキャプシドタンパク質のシャペロン活性の阻害を評価することができるアッセイである。 NCは、高速かつ、その安定した折りたたみそうで注意深いアニーリングに続いて、高温で熱変性を必要とする室温の核酸でアニーリングする。アッセイは、いずれの完全長NCまたは切り捨て（12から55）NCで行うことができます。どちらの場合も2核酸（RNAおよびその相補DNAコピー）が急速にアニールされる。これは、切断NCペプチドと文献の観察と一致している：アニーリングが弱いNC結合部位でその相補心尖ループの相互作用に続くCTARのステムの効率的な溶融によって開始される、TAR心尖ループの相補的配列と、延長アニーリングしたハイブリッドには、いくつかの不安定な中間体を通って終わる。21 NCは非常に安定であるのprotEINといくつかの問題が実行NAMEが発生する可能性がありながら。これが達成されていない場合に、ゲルが正しい位置での核酸バンドを示さない。しかしバッファ反応を停止するために使用されるゲルのロードで作りたてのSDSを追加することが非常に重要である。実際には、正確にゲル電気泳動によってTAR / CTARのヘテロを視覚化するように、NCは、核酸結合タンパク質であるタンパク質を変性させ、核酸との緊密な複合体からそれを解放するためにLoading Bufferをゲル中に存在しなければならない。これはまた、ゲル、実行時 ​​にシフトしたバンドの形成すなわち実験の可能性のトラブルシューティング、である。この効果は、完全長のNCは、 図2のように、採用されたときに特に顕著であり、核酸に強い凝集効果を有する、高度に塩基性のN末端 ​​尾部の存在にリンクされている。 ターミナル基本尾の存在がショーとして、抑えることがアニーリング反応をより困難にするnは化合物1、代表スレッディングインターカレーターを用いて、図3に、TARおよびCTARのステムループ構造を安定に特に効率的なインターカレーター、すなわち 。実際には、核酸との相互作用のこのタイプは、バルジおよびループが塩基対に嵩高い置換基を容易に糸通しを可能にする、二重らせんの連続性を中断するときに有利である。これらの核酸結合剤によってTARとCTARの安定化は、以前に二つのオリゴヌクレオチドの融解温度の上昇を測定することにより分析した。14また、融解温度の上昇は、HIV-1 NCによって触媒アニーリングの阻害と相関するヘテロ二重TAR / CTARの減少形成につながるとスレッディングインターカレーターは、TAR要素としてRNAの動的な構造のためのバインダーの興味深いクラスであることを示している。14 作用機序は、これらのコンポのために呼び出さ図4に示すようにundsはさらに、別の代替フォーマットでNAMEアッセイを行うことによって確認することができる：薬物二つ折り畳まオリゴとともにインキュベートされたときにインターカレーターの場合、アニールヘテロの阻害が増強される。このようなNC蛋白質の直接の結合剤としての作用の異なる機構に作用する化合物は、以下の異なるプレインキュベーションモードによって影響を受ける。 NAMEアッセイは、したがって、NC阻害剤の同定のための化合物のライブラリーをスクリーニングするために使用することができる二つの方法で行われ、NCを対象に抗HIV薬を探している間にも正のヒットの作用の推定メカニズムを評価する。明らかに、識別されたNC阻害剤の特定の作用機構に主張単独でこれらの技術を使用することは十分ではなく、他の適当な生化学的ア ​​ッセイは、作業仮説を維持するために必要とされる。14 最後に、NAMEは非常に使用していることを強調しなければならない組換えまたは合成のいずれかに精製酵素、試験した化合物によるNCの「 インビトロ 」阻害に関する貴重な情報を与える。これはアッセイの「強さと弱さ」です：NAMEはよく迅速に構築し、解析する構造活性相関を、最終的に合成し、薬剤設計をリダイレクトすることが可能、仮想スクリーニングおよび創薬プログラムの予備的段階における分子モデリングアプローチを補完することができます。しかし、HIVにおける薬剤開発プロジェクトで使用される他の生化学的アッセイとして、NAMEは、ウイルス感染細胞における推定阻害剤の効果についての情報を与えることはありません。

ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）のヌクレオカプシドタンパク質NCp7（NC）がしっかりと逆転写中に補因子としてウイルス複製に重要な役割を果たして、成熟した感染性ウイルスゲノムRNAと関連している小さな塩基性タンパク質であるゲノムの認識、および包装1-3 NCは、安定な核酸構造の不安定化と相補的な配列のアニーリングを触媒核酸シャペロンとして作用する。デュプレックス不安定化活性は、そのジンクフィンガー構造（12-55ペプチド）にマッピングされているが、その核酸凝集活性が11アミノ酸で主にN末端 ​​ドメインが存在する。4、正に帯電したタンパク質は、アニーリング反応の静電障壁を低下させ二つの別々の相補的配列が一緒になる速度を増加させる。 安定した立体配座に折り畳まれた核酸はfacilitatするNCのシャペロン活動を必要とする電子彼らのアニーリングを5これはNCは鎖転移イベントにおいて重要である逆転写、特に重要である：。マイナス鎖転送において、 マイナス鎖停止 DNAは、単にレトロ転写、R領域に相補的な配列に転送され、アニールされなければならない熱力学がRNAゲノムの3 &#39;末端にテンプレート6は 、この反応によりR領域中のトランス活性化応答領域 （TAR）RNAの安定した構造の存在のためにNCの不存在下で広範に発生していない、そのは、そのDNAコピー（CTAR DNA）。特徴的なステム-ループ構造を持つ7 CTARとTARが、実際には、高度に構造化された領域に関連付けられている必要があります。 NC蛋白質は、これらのヘアピンを変性し、相補的な核酸鎖間の分子間のアニーリングの速度を増加させることにより、マイナス鎖の転送を促進する。 TARとCTARのNCアニーリングのメカニズムを徹底的に調査し、デされましたいくつかの研究論文でTARアニールアッセイとしてスクライビングと提案方式が優れたレビューに描かれている。8-11要約、NCは、そのようなTAR-RNAなどの安定したRNAの二次構造を不安定にその相補的配列の二次構造を不安定化、CTAR-DNA 、およびTAR / CTARヘテロ形成につながるRNA / DNAのアニーリング反応を促進する。10,11により、HIV複製中鎖転移工程が有利で ​​ある。12 NCをNCに向かって小分子によって誘導される潜在的な干渉が損なわNC活性の結果として、ウイルスゲノムの逆転写の低下をもたらすので、新たな抗ウイルス剤の開発のための魅力的な標的である。2,13このアプローチは可能性最終的に成功した抗HIV薬の開発につながる。 NCのスクリーニングの過程で、我々は、よく知られた特性に頼るアッセイを開発し14阻害剤効率的に相補的なオリゴヌクレオチドを不安定化アニールするヌクレオカプシド。10,11の私たちは、Nが nnealing- Mは、Eの lectrophoresis（NAME）アッセイをediated ucleocapsidそれと呼ばれる。 NAMEアッセイは、ハイブリッドTAR / CTARヘテロを生成するその相補的DNA配列（CTAR）とTAR-RNA配列の先端部に対応するオリゴヌクレオチドの我々の場合、相補的核酸の安定的に構造化されたコピー間のアニーリングを仲介するNCを使用して。 NCの存在下でTAR / CTARアニーリング反応の分析は、ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）によって調べることができる。 このプロトコルは、反応および実験の可能性のトラブルシューティングの結果を分析する方法を、急速に安定したヘアピン構造に折り畳ま室温オリゴヌクレオチドでアニールするようにNAMEアッセイを実行する方法を示しています。核酸の放射性標識は、要求された、とdetectiされていませんオリゴヌクレオチドバンドの上に、従来の染色法により行うことができる。組換え全長タンパク質またはNCの切断合成バージョンのどちらを採用してアッセイは、NC、RNAおよびDNAの強い結合と相関することが示される活性を阻害するスレッドインターカレーターの同定を可能にする。14

<table><tbody><tr><td>cTAR、29-mer DNAオリゴ。脱塩。HPLC精製済み。</td><td>Metabion International AG</td><td></td><td>在庫&nbsp;ソリューションを-20 &degで保存します。C&nbsp;</td></tr><tr><td>TAR、29-mer RNAオリゴ。脱塩。HPLC精製済み&nbsp;&nbsp;</td><td>Metabion International AG</td><td></td><td>は、在庫アリコートを-80°Cで保管します。C&nbsp;</td></tr><tr><td>(12-55)NCペプチド</td><td>EspiKem srl</td><td></td><td>ストック溶液を-20°Cで保存します。C</td></tr><tr><td>1.5 mlチューブ</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120 086</td><td>使用前のオートクレーブ</td></tr><tr><td>0.5 mlチューブ</td><td>Eppendorf</td><td>0030 121 023</td><td>使用前のオートクレーブ</td></tr><tr><td>バイオスフィアフィルターチップ0.1-10 & マイクロ;l</td><td>Sarstedt</td><td>701,130,210</td><td></td></tr><tr><td>バイオスフィアフィルターチップ2-20&マイクロ;l</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,213</td><td></td></tr><tr><td>生物圏フィルターのヒント200&nbsp;&マイクロ;l</td><td>ザルシュテット</td><td>70,760,213</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ フィルター 0.22&nbsp;&マイクロ;m</td><td>Biosigma srl</td><td>51,798</td><td></td></tr>エ<tr><td>タノール</td><td>カルロエルバ</td><td>414631</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71725-50G</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシ</td>ド<td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-1L</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71376-1KG</td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0252-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134-500G</td><td></td></tr><tr><td>過塩素酸マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>222283-100G</td><td>は1&nbsp;-20&nbsp; の M ソリューション&deg;C</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49770-1L</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノール</td><td>ブルーGEヘルスケアライフサイエンス</td><td>17-1329-01</td><td></td></tr><tr><td>N、N、N&prime;、N&prime;-テトラメチルエチレンジアミン</td><td>Σ-Aldrich</td><td>T9281-100ML</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム</td><td>ΣΣ-Aldrich</td><td>A7460-500G</td><td>使用前に10%の溶液を新たに準備</td></tr>します<tr><td>アクリルアミド-ビスすぐに使用できる溶液40%(19:1)</td><td>メルクミリポア</td><td>1006401000</td><td>ポリアクリルアミドは非常に神経毒性があります:ゲルキャスティング中に手袋を着用</td></tr>してくださいトリ<tr><td>ス超高純度</td><td>Applichem</td><td>A1086、1000</td><td></td></tr><tr><td>DEPC 処理水</td><td>Ambion</td><td>AM9922</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機 5415R</td><td>Eppendorf</td><td>22,621,408</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 分光計</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV-VIS 分光計 Lambda 20</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protean II xi Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-1803</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>SybrGreen II RNA Gel Staining</td><td>Lonza</td><td>50523</td><td>TBE 1xで1/10,000希釈します。4°Cで暗所に保管してください。&deg;Cを2週間。</td></tr><tr><td>Geliance 600 イメージングシステム</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ヌクレオカプシドアニーリング媒介電気泳動（name）アッセイは、hiv-1ヌクレオカプシド阻害剤の迅速な同定を可能にする

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

安定した三次元折りたたみで折り畳まRNAまたはDNAは、抗腫瘍または抗ウイルス薬の開発において興味深い標的である。 HIV-1の場合には、ウイルスの活動の調節に関与するウイルスタンパク質は、いくつかの核酸を認識する。ヌクレオカプシド蛋白NCp7（NC）は、ウイルス複製の間にいくつかのプロセスを調節する重要なタンパク質である。 NCは、実際にはRNAおよびDNA、それらのアニーリングを容易にする二次構造を不安定化するシャペロンである。 NCの不活性化は、新しいアプローチおよび抗HIV療法のための興味深い標的である。 Nは nnealing- MがEの lectrophoresis ediated ucleocapsid（NAME）アッセイにより、そのようなTARのヘアピン構造およびHIVのCTAR要素として熱力学的に安定な三次元コンホメーションに折り畳まれたRNAおよびDNAの融解およびアニーリングを阻害することができる分子を同定するために開発されたHIV-1のヌクレオキャプシドタンパク質。新しいアッセイは、再いずれかを採用以前の標識を必要とせずcombinantまたは合成タンパク質、およびオリゴヌクレオチド。結果の分析は、従来の核酸の染色に続いて、標準的なポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）によって達成される。この作品で報告されたプロトコルは、核酸シャペロンの両方有能な、全長タンパク質または基本的なN末端ドメインを欠くその切断型と名前がアッセイを実行する方法について説明し、どのようにすることによって、NCのシャペロン活性の阻害を評価するためにインターカレースレッディング。また、NAMEは、識別NC阻害剤の作用の推定機構に関する指標を得るために、2つの異なるモードで便利に行うことができる。

図1は、ヌクレオカプシドアニーリング媒介電気泳動（NAME）アッセイの代表的な結果を示し、iは 、全長の組換えタンパク質、ii）のタンパク質を含まない、 すなわち CTAR + TARを混合し、RTで1時間までインキュベートすること、 および iiiで）行う）（12-55）NC、N末端 ​​ドメインの11アミノ酸を欠く合成ペプチドを用いて行っ同じアッセイ。予め折り畳まれたTARとCTARを混合し、アニールしたヘテロTAR / CTARの形成はタンパク質の非存在下で、全長組換えNC（ 図1の左側のレーン）の存在下でモニターした（ 図1の中央のレーン）、および短縮型（12-55）NCペプチド（ 図1の右側のレーン）の存在下で行われる。コントロールは、次のとおりです。彼らの遅いannealin続いCTARにTARの安定に折り畳まれた構造体の熱変性して得られた、CTAR、折り畳まれたTAR、およびアニールしたハイブリッド（TAR / CTAR）を折り畳んグラム。14 拡張されたヘテロ二重らせんに二つの安定核酸配列を変性させるNCの能力は明らかである：フルレングスNCタンパク質は、TAR / CTARハイブリッドの形成にすぐにつながる：0 &#39;NCへの追加の間を通過する最小限の時間を示しサンプルと反応を停止ゲルローディング緩衝液の添加;完全な形成がすでに15分間のインキュベーション時間の後に達成される。アニールヘテロ強度の増加は、折り畳まれたCTARとTARオリゴヌクレオチドの強度の減少に匹敵する。ヘテロ二本鎖形成は切断型の存在下でも達成され、合成ペプチドの生物学的活性を確認する、（12-55）NC、すなわち 。蛋白質またはペプチドの非存在下でヘテロ形成が観察されず、TARとCTARオリゴヌクレオチドは、ヘテロ（ 図1）に、室温でアニールしない。ですべての実験、不安定な中間体の速い形成時間をかけて減少する（ 図1の「中間複合体」）は、一貫して正確な核酸は折りたたみまでCTARとTARのヘアピンを通して鎖交換の提案されたメカニズムで、観察される。17 実験の可能性のトラブルシューティングは、ゲルローディング緩衝液中のSDSの欠如である。 GLBにおけるSDSの非存在下での反応の結果を図2に示し、GLB + SDSによる結果と比較される。予め折り畳まれたTARとCTARを混合し、組換え完全長NC蛋白質と37°Cで3時間の室温で3時間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを2つに分割した。SDSなしの半分ゲルローディングバッファー（GLB）の他の半分にGLBは、SDS（GLB SDS）であったが、添加した。サンプルをゲル上にロードし、そしてゲルによって実行後に​​核酸バンドの位置を可視化した色素染色。これが予想され、タンパク質と核酸との間の強い結合を示します。NCは存在していたが、サンプルはGLBをロードしたときは、全ての核酸バンドがシフトアップされた。 GLB SDSとの結果がゲルの一番右に示されている：SDSの追加は、コントロールと比較を可能に、タンパク質を変性し、タンパク質と安定な複合体から核酸を放出する。 NAMEアッセイは動的核酸構造を安定化し、NCのシャペロン活性を阻害するためにインターカレー転位する能力を評価するために使用される。14スレッディングインターカレーターは、例えば、アントラキノン環系の反対側の部位に位置する大きな側鎖によって置換された平面状の芳香族分子である図3Aに示されている。18これらのインターカレーターは、核酸の二重らせんを縫うすることができ、最終的に二重の溝に、それらの側鎖の位置をらせん。19,20 図3Bは、化合物1の存在下でNAMEアッセイの結果を示し、既知のスレッディングインターカレーター、完全長のNCまたは切断ペプチドの存在下で18。両方の場合において、NCによってTAR / CTARハイブリッドの形成は、一方、同時に、フリーTARとCTARの量が増加するとインターカレーターの濃度を増加させることによって低減される。 N末端尾部（12-55NC）を欠くタンパク質の切断型は、その活性の阻害に対してより敏感である。この差は、これまでに試験された全ての化合物を用いて検証した。 NAMEアッセイは、折り畳まれたオリゴヌクレオチド（NC-プレインキュベーションモード）を添加したNCとプレインキュベートする試験化合物による、9893核酸基質との15分間の試験化合物をプレインキュベートすることによってのいずれか2つの方法で行うことができる、NCおよび15分間のさらなるインキュベーション（オリゴ広報し、続いてeincubationモード）。全体的なインキュベーション時間は、二つの異なるモードで同じであるが、NCの添加前に折り畳まれたオリゴヌクレオチドを​​用いたプレインキュベーションは、折り畳まれた核酸へのインターカレーターのスレッドのためのより多くの時間を可能にする。これは彼らのダイナミックな構造の強い安定化とNCシャペロン活動をより容易に抑制に結果。 図4に示すように、2つのモードでNAMEアッセイの解析は、したがって、NC阻害剤の作用機序の違いを増強する：化合物1は、オリゴプレインキュベーションモードでNAMEによって分析したとき（ 図4、左のレーン）はるかに低い阻害はNC-プレインキュベーションモードで観察されるのに対し、それは、NC媒介アニーリングの強力な阻害を示す（ 図4、右のレーン）。このアッセイで、これらの条件に関連化合物のセットをスクリーニングしながら、阻害濃度の測定のために各experiていることに注意してくださいメントは、 図14（特にIC 50値の周り）狭い間隔の濃度を用いて、少なくとも三連で実施されなければならない<img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig1highres.jpg" /> 図1：フルレングスNC付きと切り捨て（12から55）NCつ折りTARとCTAR、それぞれ1μM とNAMEアッセイは 、組換えNCまたはでインキュベートした（12から55）NC（オリゴ/ NC = 1 / 8）0分、15分、30分および1時間。タンパク質（0分、15分、30分、1時間）の非存在下でインキュベートしたTARとCTARを陰性対照として使用した。折り畳まれたTAR、折り畳まれたCTARハイブリッドTARは/ CTARはインビトロアニーリング対照として使用した、続いて熱変性した後に得られる。反応はその後GLB SDSを使用して停止した。サンプルは、1×TBE中で12％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。電気泳動後のゲル上の核酸は、染色し、イルミ上で検出された。 <html><img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig2highres.jpg" /> 図2：ゲルローディングバッファー中のSDSの影響（GLB）TNMG 1X ​​に予め折り畳んだNC TARとCTAR によるTAR / CTARアニールを 、 分析するときに 、3のために全長組換えNC（オリゴ/ NC = 1/8）と共にインキュベートした。室温または37℃で時間。 GLBまたはGLB SDSその後、NCとインキュベートした試料に添加した。コントロール：TAR、CTARアニールハイブリッドTAR / CTAR（各1μM）。電気泳動は1×TBE中で12％ポリアクリルアミドゲルを用いて行った。電気泳動後のゲル上の核酸は、染色し、イルミ上で検出された。 。この図は、図S4から変更されている：。Sosic、A. らの設計、合成およびHIV-1ヌクレオカプシド阻害剤としてTARとCTARバインダーの生物学的評価MedChemComm 4、1388年から1393年、DOI：10.1039 / c3md00212h（2013） 。 &quot;&gt; <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig3highres.jpg" /> 図3：NAMEアッセイによって評価インターカレー1スレッディングのスレッディングインターカレーター1.（B）の（A）化学構造の影響。折り畳まれたTARとCTAR、それぞれ1μMは、完全長のNCまたは（12-55）NC、それぞれ8μMを有する化合物1の示された濃度の存在下でインキュベートした。 CTARと拡張ヘテロTAR折り畳まつ折りTARは、/ CTARを対照として使用した。反応はその後GLB SDSを使用して停止した。サンプルは、1×TBE中で12％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。電気泳動後のゲル上の核酸は、染色し、イルミ上で検出された。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig4highres.jpg" /> 図4：NC-プレインキュベーションモードに対するオリゴプレインキュベーション：NAME検定への影響 オリゴプレインキュベーションMOD。E：、TARを折り畳まれ、各1μMをCTARを折り畳まれた完全長のNC（8μM）の存在下で15分間スレッディングインターカレーター1の示された濃度でプレインキュベートした後、さらに15分間たNC-プレインキュベーション 。 モード ：スレッドインターカレー1の示された濃度は、それぞれ1μM、15分間、完全長NC（8μM）と共にプレインキュベートし、次いで、さらに15分間、折り畳まれたTARの存在下でCTAR折り畳まれた。 CTARと拡張ヘテロTAR折り畳まつ折りTARは、/ CTARを対照として使用した。すべての反応は、最終的にGLB SDSを使用して停止した。サンプルは、1×TBE中で12％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。電気泳動後のゲル上の核酸は、染色し、イルミ上で検出された。

このプロトコルは、HIV-1ヌクレオカプシドタンパク質のシャペロン活性をin vitroで阻害できる分子の迅速な同定を可能にするアッセイであるNAMEを説明しています。

ヌクレオカプシドアニーリング媒介電気泳動（NAME）アッセイは、HIV-1ヌクレオカプシド阻害剤の迅速な同定を可能にする

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

本実験の全体的な目的は、HIV-1ヌクレオカプシドタンパク質のシャペロン活性を阻害できる分子を迅速に同定することである。in vitroにおいて、NCは小さく塩基性の高いタンパク質であり、その構造は柔軟な末端ドメインと、ウイルス核酸との相互作用に関与する高度に保存された2つのジンクフィンガーによって特徴づけられる。NCはtar RNAヘアピンおよびその相補的DNA配列であるCTArと相互作用し、それらの二次構造の融解を促進することで、tar-tarハイブリッドの形成を可能にする。本プロトコールは、TARおよびsitar配列の先端部分を混合し、ncと共にインキュベートすることで実施されます。ハイブリッドはスレッディングおよびサーキュレーターの相互作用によって形成され、オリゴヌクレオチドがnc触媒によるハイブリッド形成を阻害します。反応の結果は標準的なポリアクリルアミドゲル電気泳動によって解析され、TARおよびCAはハイブリッドと比較してゲル内で異なる移動度を示します。インターコレーターにおけるスレッディング濃度の増加は、遊離したtarおよびCT Aの出現と並行して、ハイブリッドの減少を引き起こします。ゲルシフト分析やtarニーリングなどの既存のプロトコルに対する本手法の主な利点は、放射性標識などの核酸の事前の処理を必要としないことです。この方法は、HIV-1やC阻害剤などの創薬分野における重要な疑問の解決に役立ちます。この手法を初めて用いる際、プロトコルの全体的な構成、特に各ストックの連続希釈、正確なインキュベーション時間、および反応を停止させるための正しい手順に苦労することがあります。本手順を開始するために、1 µMのTARオリゴヌクレオチドストック溶液10 µLと、1 X TNMGバッファーに溶解した1 µMのCT A 10 µLを準備します。チューブを約95 °Cで5分間加熱し、その後室温まで冷却して、TARとCT Aにステム・バルジ・ループ構造を再形成させます。コントロールとして1 µMのハイブリッドTAR-CT A溶液を調製するには、1 X TNMGバッファー中で10 µMのTAR 1 µLと10 µMのCT A 1 µLを混合します。チューブにDEPC処理水を追加し、全量を10 µLにします。次に、チューブを95 °Cで5分間加熱し、オリゴヌクレオチドを変性させます。その後、tarが相補的な配列であるCT Aにアニーリングして、二本鎖ハイブリッドであるtar CT Aを形成させるため、室温までゆっくりと冷却させます。すべての溶液が室温まで冷却されたら、短時間の遠心分離を行い、各溶液にSDS含有GLBを3 µL加えて、チューブ内で3回ピペッティングします。ローディングの手順まで、サンプルを氷上に置いておきます。この手順では、Milli-Q水を用いて、化合物1の500 µM、250 µM、50 µM、および5 µMの希釈液をそれぞれ10 µLずつ調製します。次に、TNMG 1Xバッファーを用いて、4 µMのtarを27.5 µL、および4 µMのCTAを27.5 µL調製します。構造を折り畳むため、2本のチューブを約95 °Cで5分間加熱し、これらの折り畳まれたオリゴヌクレオチド溶液を次以降のステップで2.5 µLずつ使用します。次に、NCタンパク質およびNC 12 to 55ペプチドの両方のストックソリューションを、水を用いて80 µMに希釈します。TARおよびCAR溶液が室温まで冷却されたら、両チューブを短時間遠心分離し、その後、オートクレーブ滅菌済みの空のチューブを20本用意し、ラボサンプル用ラックに10本ずつ2列に配置します。その後、1列目のすべてのチューブに、折り畳まれたtarを2.5 µLずつ加えます。続いて、すべてのチューブに折り畳まれたCT Aを2.5 µLずつ加えます。2列目には、tarおよびCT A rの希釈系列として、適切な化合物を2 µLずつ加えます。コントロールにおけるNCおよびNC 12 to 55ペプチドの分析用サンプルにおいて、化合物を水に置換します。サンプルを室温で15分間インキュベートします。15分後、CT A Rサンプルを対応するtarサンプルと混合します。NC分析用のサンプルには80 µMのNCを1 µL、NC 12 to 55ペプチド分析用のサンプルには80 µMのNC 12 to 55ペプチドを1 µL加えます。室温でさらに15分間インキュベートした後、各サンプルにSDS含有GLBを3 µL加えて反応を停止させます。各チューブ内の混合液をピペットで3回混ぜ、氷上に置きます。NCおよびNC 12 to 55ペプチド分析用のサンプルを用いてこの操作を繰り返し、ローディングステップまでサンプルを氷上で保持します。次に、ゲル装置の蓋を取り外します。各ウェルに各サンプルを13 µLずつロードします。電源を入れる前に、ゲル電気泳動装置の蓋を閉めます。染料がゲルの底から1.5 cm上まで移動するまで、200 Vの定電圧で2時間30分間泳動させます。その後、ゲルを適切な容器に移し、目的の核酸染色液を加え、攪拌しながら30～45分間静置します。ゲルをトランスイルミネーターイメージングシステムに設置し、蛍光シグナルによって核酸を検出します。このアッセイは、スレッディングインターカレーターがダイナミックな核酸構造を安定化させ、NCシャペロン活性を抑制する能力を評価するために用いられます。スレッディングインターカレーターは、ここに示すアントラキノンのように、環系の反対側に嵩高い側鎖を持つ単純な芳香族分子です。この図は、フルレングスのNCまたは切断ペプチドの存在下で、既知のスレッド型インターカレーターである化合物1を用いたEMSAの結果を示しています。どちらの場合においても、NCによるハイブリッドであるtar-CTの形成は、インターカレーターの濃度を高めることで減少します。同時に、遊離のtarおよびCT-ARの量が増加します。この手順を実施する際は、SDSを含むJAローディングバッファーを使用することを忘れないでください。これは、nameを最適に成功させるための重要なステップです。例えば、このステップを怠ると、ゲルシステム内で核酸バンドを区別することができなくなります。このビデオを視聴することで、室温で安定した構造に折り畳まれた任意の単鎖オリゴヌクレオチドに対してMSAを行う方法と、その反応結果を解析する方法について十分に理解できるはずです。また、組換えフルレングスのNCタンパク質または切断型の合成NCペプチドを用いて、NCを阻害する相互作用因子を特定する方法についても学びます。インターカルレーターおよびポリアクリルアミドの取り扱いは非常に危険であるため、本プロトコルを実施する際は、必ず白衣、手袋、保護メガネの着用などの予防措置を講じてください。

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