次世代シーケンシングによりDNAメチル化解析をターゲット

この手順の全体的な目的は、目的の組織または細胞から単離したゲノムDNAにおいて、標的となる関心領域のCpGメチル化量を定量することです。これは、まずビスルフィート変換済みゲノムDNAから関心領域を増幅させるためのビスルフィート特異的PCRプライマーを設計することで達成されます。第2段階では、ビスルフィート変換された関心領域を増幅し、そのアンプリコンから次世代シーケンシング（NGS）ライブラリを構築します。

次に、ライブラリのシーケンシングを行い、解析用のFASTQファイルを生成します。最終ステップでは、シーケンシングリードを重亜硫酸塩変換済みの参照ターゲット配列にアライメントし、最終的に5-mc%を算出します。重亜硫酸塩アンプリコンシーケンシング（BSAS）を用いることで、あらゆるモデル生物の任意の関心領域におけるCpGメチル化を、精密かつ正確に定量することが可能です。サンガーシーケンシングなどの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、BSASが高精度で正確なCpGメチル化定量を超高速かつハイスループットに提供し、多数のサンプルにおける複数の領域をアッセイすることを可能にする点にあります。

ターゲットを特定しプライマーを設計した後、単一アンプリコンのターゲット増幅最適化のための反応液を調製し、PCRプレートをヒートシールフィルムで密封して、アガロースゲル電気泳動によりアンプリコンを可視化します。次に、適切なウェルに30 µLのPCR反応液またはラダーをロードし、200 Vで約45分間ゲルを泳動させます。最初の色素がゲルの末端に到達したら、反応を停止させ、調整直後の5 µg/mLのエチジウムブロマイド（EtBr）でゲル全体を染色します。

5分後、励起波長482 nanometersのUVトランスイルミネーターを用いてゲルの画像を撮影します。ラダーを用いてPCR産物のサイズを測定し、反応の特異性を判定します。期待される産物サイズ以外の複数のバンドを確認し、検出されたライブラリーピークの平均サイズを決定し、モル濃度を推定します。

次に、製造元の指示に従い、高感度DNAアッセイを用いてキャピラリー電気泳動DNAサイジングチップでライブラリを走行させます。QPCRによるライブラリの定量には、作成したライブラリのアダプター配列に対して設計されたプライマーと既知濃度の標準品を用い、製造元の指示に従って絶対定量設定にしたリアルタイムPCR装置を使用します。

次に、ライブラリのサイズとQPCRによるモル定量値を用いて、ライブラリのモル濃度を算出します。シーケンシング後、圧縮されたfast Qファイルを適切なシーケンシング解析パイプラインにインポートし、「import」を選択した後、リードトリミングアプリケーションでQスコアを保持するために、リード生成に使用したシーケンシング方法を選択します。適切な圧縮fast Qリードファイルをインポートし、「general options」で「discard quality scores」の選択を解除します。

インポートしたリードの保存場所を選択し、「finish」をクリックします。次に、「NGS core tools」の下にある「trim sequences」を選択します。トリミングするリードをハイライトし、Q 30以上のスコアを持つリードのみを保持します。

次に、「quality scores」を用いてトリミングを選択し、しきい値を0.001に設定します。さらに、曖昧なヌクレオチドが1つ以下含まれるリードのみを選択するため、「trim ambiguous nucleotides」を選択し、曖昧なヌクレオチドの最大数を1に設定します。

次に、トリミング済みリードの保存場所を選択し、「finish」をクリックして、トリミング済みリードをin silico亜硫酸塩変換遺伝子リファレンスにマッピングします。「NGS core tools」の下で、「map reads」を選択します。「reference」には、マッピングするトリミング済みリードを選択し、「next」をクリックします。

次に、「reference masking（リファレンス・マスキング）」で、変換済みのリファレンス配列を選択し、「no masking（マスキングなし）」を選択します。「Next」をクリックし、ミスマッチ、挿入、および欠損に3のスコアを割り当てます。「minimum fraction of read length map to the reference（リファレンスにマップされるリード長の最小割合）」に1のスコアを割り当て、「nonspecific match handling（非特異的マッチング処理）」におけるマップ、リード、およびリファレンス間の「minimum fraction of identity（最小一致割合）」に0.9のスコアを割り当て、「ignore（無視）」を選択し、「Next」をクリックして出力オプションへ進みます。

次に、「Create standalone read mappings」を選択します。その後、「result handling」の下にある「save」をクリックします。リードマッピングの保存先を選択し、「finish」をクリックして、マッピング済みリードのバリアントコールを実行します。

再シーケンス解析において、「low frequency variant detection」を選択し、解析対象のリードマッピングを選択します。「next」をクリックし、「low frequency variant parameter」に0.01%と入力して「next」をクリックします。「general filters」において、シーケンスの深さが1000 x以上であることを確実にするため、minimum coverageを1000に設定します。

最後に、「next」をクリックし、出力オプション（output options）で「create annotated table」を選択して、バリアントテーブルファイルの保存場所を指定し、「finish」をクリックします。バリアントテーブルファイルから、関心領域内のアノテーション済みCpG部位におけるバリアント頻度を用いて、CGコンテキストにあるリファレンスシトシンのシトシンメチル化頻度を算出します。変換後のリファレンス配列に適切にアライメントされた亜硫酸塩アンプリコンシーケンシングリードは、図に示されているものと同様になります。CpGジヌクレオチドを明確に識別でき、CpG部位のベースコールを観察することでメチル化状態を推定できます。マッピングされたリードにおいて、メチル化率が0%である場合、CpG部位にチミンがマッピングされたリードが得られます。

100%メチル化コントロールでは、CpGサイトにマップされたシトシンを含むマップ済みリードが得られます。本実験では、マウスの小脳および網膜からRNAとDNAを共分離しました。その後、予想通り、網膜組織で選択的に発現するオプシンの発現量をqPCRを用いて測定しました。

重亜硫酸塩増幅シーケンシング（bisulfite amplification sequencing）を用いてOpsinプロモーター領域のCpGメチル化レベルを定量化した結果、opsin RNAは網膜でのみ検出されました。しかし、プロモーター領域全体の累積メチル化レベルは、網膜では15%未満であったのに対し、小脳では80%を超えていました。BSASによるメチル化定量では、部位特異的なメチル化定量が可能なため、任意のゲノム領域におけるCpGごとのメチル化レベルを比較することができます。

実際、本実験において、オプシンプロモーター領域のCpGメチル化レベルは、網膜サンプルと比較して小脳サンプルで有意に高いことが分かりました。このビデオを視聴することで、組織または細胞から単離したゲノムDNAの、標的となる関心領域におけるCpGメチル化の定量方法について十分に理解できるはずです。