次世代シーケンシングによりDNAメチル化解析をターゲット

この手順の全体的な目標は、目的の組織または細胞から分離されたゲノムDNAから、目的の領域におけるCPGメチル化を定量化することです。これは、まず亜硫酸塩特異的PCRプライマーを設計し、重亜硫酸塩変換ゲノムDNAから関心領域を増幅することで達成されます。第2ステップでは、亜硫酸バイサルファイト変換された関心領域が増幅され、アンプリコンコンスから次世代シーケンシングまたはNGSライブラリが生成されます。

次に、ライブラリのシーケンシングを行い、解析用のFASTQファイルを生成します。最終ステップでは、シーケンシングリードをバイサルファイト変換された参照ターゲット配列にアラインメントし、最終的に亜硫酸アンプリコンシーケンシングによって5mcパーセントを計算するか、BS a sを実行して、任意のモデル生物の任意の関心領域におけるCPGメチル化を正確かつ正確に定量することができます。この手法がサンガーシーケンシングなどの既存の方法と比較した場合の主な利点は、BS A Sが迅速かつ正確なCPGメチル化定量を迅速にハイスループットに提供し、多数のサンプルの複数の領域をアッセイする機会を提供することです。

ターゲットを同定し、プライマーを設計した後、単一のアンプリコンのターゲット増幅最適化のための反応を組み立て、次にPCRプレートをヒートシールフィルムでシールし、ページ電気泳動によりアンプリコンを可視化します。次に、適切なウェルに30マイクロリットルのPCR反応またはラダーをロードし、ゲルを200ボルトで約45分間泳動します。最初の色素がゲルの端に達したら、反応を停止し、新たに調製したAUMブロマイドのミリリットルあたり5マイクログラムでゲル全体を覆います。

5分後、UVトランスルミネーターを介して482ナノメートルの励起波長でゲルをイメージングします。ラダーを使用してPCR AMPLICONSのサイズを決定し、反応の特異性を決定します。予想されるアンプリコンサイズ以外の複数のバンドを探して、検出されたライブラリピークの平均サイズとモル濃度の推定を決定します。

次に、製造元の指示に従って、高感度DNAアッセイを備えたキャピラリー電気泳動DNAサイジングチップ上でライブラリを実行します。QPCRによりライブラリを定量化します。生成されたライブラリおよび標準試料のアダプター配列に対して設計されたプライマーを、既知の濃度でリアルタイム装置で使用し、メーカーの指示に従って絶対定量設定を使用します。

次に、ライブラリーのサイズとQPCRからのモル定量を使用して、ライブラリーのモル濃度を計算します。シーケンシング後、圧縮された高速 Q ファイルを適切なシーケンシング解析パイプラインにインポートし、インポートを選択してから、リードの生成に使用したシーケンシング方法を選択して、リード トリミング アプリケーションの Q スコアを保持します。適切な圧縮された高速 Q 読み取りファイルをインポートし、[一般オプション] で [品質スコアを破棄] の選択を解除します。

インポートした読み取りの場所を選択し、[完了] をクリックします。次に、[NGS core tools] で [trim sequences] を選択します。トリミングする読み取りを強調表示し、Q 30 以上のスコアを含む読み取りのみを保持します。

次に、品質スコアを使用してトリムを選択し、制限を 0.001 に設定します。さらに、1つ以下のあいまいなヌクレオチドを含むリードのみを選択します。「あいまいなヌクレオチドのトリミング」を選択し、あいまいさの最大数を 1 に設定します。

次に、トリミングされたリードを保存する場所を選択し、[完了]をクリックして、トリミングされた解像度を亜硫酸塩変換遺伝子参照によるin silicoにマッピングします。[NGS コア ツール] で [読み取りマップ] を選択します。参照するには、マップするトリムされたリードを選択し、[次へ] をクリックします。

次に、「参照マスキング」で、変換された参照シーケンスを選択し、「マスキングなし」を選択します。[次へ] をクリックし、不一致、挿入、および削除に 3 のスコアを割り当てます。参照に対する読み取り長マップの最小割合にスコア 1 を割り当て、マップ間の ID の最小割合にスコア 0.9 を割り当て、非特定の一致処理での読み取りと参照、選択、無視、および出力オプションの [次へ] をクリックします。

次に、 [スタンドアロン読み取りマッピングの作成] を選択します。次に、[結果の処理] で [保存] をクリックします。読み取りマッピングを保存する場所を選択し、[完了] をクリックして、マップされた読み取りでバリアント呼び出しを実行します。

[Re-sequencing analysis] で、低周波バリアント検出を選択し、解析するリードマッピングを選択します。[次へ] をクリックし、[低周波数バリアント パラメーター] に「0.01%」と入力して [次へ] をクリックします。一般的なフィルターでは、最小カバレッジを 1000 に設定して、シーケンスが 1000 x 以上の深さにあることを確認します。

最後に、次へをクリックし、出力オプションの下で注釈付きテーブルを作成し、バリアントテーブルファイルを保存する場所を選択し、終了をクリックして、バリアントテーブルファイルから関心のある領域の注釈付きCPGサイトでのバリアント周波数を使用して、CGコンテキストの参照シトシンでのシトシンメチル化の頻度を計算します 亜硫酸塩アンプリコンシーケンシングによって、変換された参照配列に適切に整列した読み取りは、図示のものに似ています図の中に。CPGジヌクレオチドは明確に同定でき、メチル化状態はCPG部位の塩基コールを観察することで推定できます。マッピングされたリードでは、0%メチル化により、CPG部位にマッピングされたチミンを含むマッピングリードが生成されます。

100%メチル化コントロールにより、CPG部位にマッピングされたシトシンを含むマッピングリードが得られます。この実験では、マウス、小脳、網膜からRNAとDNAを共に単離しました。次に、網膜組織で選択的に発現するオプシン発現を、予想どおりQPCRを使用して測定しました。

オプシンRNAは、バイサルファイト増幅シーケンシングによりオプシンプロモーター領域のCPGメチル化レベルを定量した後、網膜でのみ検出されました。しかし、プロモーター領域全体の累積メチル化レベルは、網膜で15%未満であるのに対し、小脳では80%を超えていました。B SASメチル化定量は、部位特異的なメチル化定量の恩恵を受けるため、任意のゲノム領域にわたるCPG特異的な基準でのメチル化レベルを比較できます。

実際、この実験では、オプシンプロモーター全体のCPGメチル化レベルは、網膜サンプルと比較して小脳サンプルで有意に高いことがわかりました。このビデオを見れば、組織または細胞から単離されたゲノムDNAから標的対象領域におけるCPGメチル化を定量する方法を十分に理解できるはずです。