Name: 次世代シーケンシングによりDNAメチル化解析をターゲット (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 学ぶビスルファイトアンプリコンシーケンス法によるDNAメチル化定量解析。次世代シーケンシングを用いて標的ゲノム領域のシトシンメチル化を正確に定量化し、エピジェネティック制御機構の理解を深める。

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著者は、マウスの網膜と小脳のサンプルを提供してくれたColleen Van Kirkと、フィギュアの生成のためにPeter Gregoryに感謝します。また、著者らは、MiSeqへのアクセスを提供してくださったAllison Gillaspy博士とLaboratory for Molecular Biology and Cytometry Researchコアに感謝します。この研究は、NIHの助成金DA029405、EY021716、AG026607、およびDonald W. Reynolds Foundationの支援を受けました。

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

BSASサンプルとターゲットの数の両方数の高スループット能力を有する焦点、正確なDNAメチル化の定量を可能にする。さらに、トランスポ媒介tagmentationを使用して、このライブラリー生成は、より少ないインプットDNAを必要とし、より迅速で、伝統的なせん断およびその後のアダプターライゲーション技術より少ないステップが含まれています。既存の方法に比べてこれらの改善は、任意の目的の標的の正確な基本レベルのDNAメチル化解析を可能にする。また、BSASは全ゲノムバイサルファイト22またはキャプチャ23アプローチを用いて同定されている関心領域（差別的メチル化領域（DMRに）、CpGアイランド、調節領域）の確認のための新しい方法を提供する。直交確認のアプローチや、より定量的に正確な方法を使用すると、エピゲノム研究の分析的厳密さを向上させます。 BSASで達成高い読み取り深度再狭い信頼区間で正確な定量を可能にする正確な定量16にまで一貫した。さらに、単一の実験で多数のサンプルを分析する能力は、統計的検出力を増加させる全ゲノム法の確認のためのサンプルサイズを増加させることができる。現在の多くのエピジェネティック研究の弱さ。重要なことは、BSASはエピジェネティックな研究のための検証可能な仮説の生成を可能にする塩基特異的CpGメチル化の定量を、提供します。特定の応答エレメントでのそのような増加したメチル化のような仮説は、特定の転写因子の結合の減少をもたらすであろう。対のmRNA発現データと結合BSASは、組織または細胞集団の単一片内のエピジェネティックな調節およびmRNA発現の両方を得るための方法を提供する。規制と表現の対の測定値も、調査結果の科学的な厳格さとインパクトを高める。 BSASプロトコル内の重要なステップは、/プライマー設計、アンプリコンの最適化、およびライブラリ生成、QC。プライマーは、適切に設計され、異なる効率8で増幅されていない場合、PCRバイアスが導入される。そのような酵素的に生成された100％および0％のシトシンのメチル化の標準としてメチル化規格の使用は、もしあれば、メチル化定量バイアスの、程度を決定するために使用され、メチル化16を定量化する際に、適切な方法論的な制御であることができる。単一の高品質なアンプリコンを生成するためのPCR反応を最適化する場合も同様に、注意が払われるべきである。何リコンプロトコルで詳述示唆ガイドラインを使用して存在しない場合、最適化ステップが増加PCRサイクル数またはbsDNA入力量を含む。プライマー·ダイマーを含む複数のPCR産物は、存在する場合、最適化ステップは、bsDNA投入量を減少させるPCRプライマーのモル入力濃度を減少させ、アニール温度を増加させる、またはPCRのサイクル数を減少させることが含まれる。これらの最適化の手順のいずれかまたは組み合わせは、単一のHIGを生成するために、十分な結果が得られ時間品質のアンプリコン。また、プライマーを再設計することは、単一のアンプリコンを生じないプライマーセットのための良いアプローチです。再設計が適切なまたは不可能であるこれらの領域については、シトシンのチミンのフォワードプライマーおよびアデニンの中のCpG部位でのグアニンのリバースプライマー中のCpG部位での両方を含む縮重プライマーセットが動作する可能性があります。しかし、これらのプライマーセットは、PCRバイアスは、このプロトコルの範囲外のプロセスを生じていないことを確認するためにさらなる最適化を必要としています。品質ライブラリは、成功のために極めて重要である。 QC対策がシークエンシングの前にライブラリの大きさ、質と量を決定するために行われていることを確認します。配列決定反応は、低品質のライブラリーの入力に失敗しがちである。メチル化の定量におけるバイアスがメチル化頻度が前方の両方に存在し、シークエンシング読み取り逆にすることによって軽減することができる。さらに、CpG部位に合わせて拠点の品質スコアが高いCOのために≥Q30であるべき定量でnfidence。他のものは、上記の測定基準を確保し、重亜硫酸変換したDNA 19のtagmentation反応におけるバイアスなしに、以前にはほとんど示されているが、低バイアスメチル化定量を確認することができます。 BSASは現在、しかし、この方法の将来の拡張は、亜硫酸水素塩変換24の前にカリウム過ルテニウムを導入するなどの5-MCと5-HMCを区別する実験工程を追加してのCpG 5-HMCの対の測定値を可能にし、CpG部位でのメチル化を測定します。これは、DNAメチル化の遺伝子発現調節の役割を決定するために、対のメチル化を可能にすることにより、5-mCと5-HMC、および発現データの両方をBSASユーティリティの影響を増加させる。 PCRアンプリコンのトランスポ媒介ライブラリ調製物は増幅された領域の端部で低下し、配列決定深度をもたらすない。したがって、高い関心領域は、アンプリコンの中央に存在するように設計されるべきである。どうやってBSASが生成するので、今までに、シークエンシング&gt;は千X、増幅された領域の端部付近の測定は高いまま5-MCの定量的な精度の深さを読み取る。

それは自然にシトシンメチル化1の形態のDNAの変更を発生するの最初の報告以来、半世紀以上となっている。シトシンのメチル化は、ベースリング上の5 番目の炭素にメチル基（5-mCと）は、最も頻繁に、哺乳動物ゲノム中のCpGジヌクレオチドモチーフで生じる有する修飾シトシンヌクレオチド塩基である。不在は、転写活性2に関連している遺伝子のプロモーター中の5-mCとの機能的な存在は、一般に、転写抑制と関連している。 驚異的な進歩が開発3、エピジェネティックなプロファイル4、癌の病因5,6、および他の研究領域の数のtransgeneration伝搬におけるDNAメチル化の役割についての我々の理解がなされている。新しい方法論は、DNAメチル化7をプロファイリングするために開発されているようにこれらの進歩の多くは、過去数年間で来ている。出現でと次世代シーケンシング（NGS）技術の普及は現在、全ゲノムまたはゲノム8の大きな領域全体にDNAメチル化をプロファイリングするための方法がいくつかあります。これらのアプローチは、DNAメチル化パターン及びDNAメチル化の差異を定量発見研究の可能性を開く。これらの仮説生成のアプローチに加えて、標的/仮説テストのDNAメチル化の定量法のための重要な必要性がある。 パイロシーケンシング、メチル化特異的PCR、および重亜硫酸変換したDNAの直接のサンガー配列決定は、対象地域を分析するための最も使用される方法であった（ すなわち 、単一遺伝子のプロモーター領域またはCpGアイランド）9-12。メチル化シトシンのはそのまま13,14ままこれらの方法の全ては、亜硫酸水素塩変換、非メチル化シトシンのウラシルのに変換され、化学的脱アミノ化反応に依存している。 bisulfite-のPCR増幅差動メチル化塩基の違いとして読み出すことを可能チミン15とウラシルの交換で変換されたDNAをもたらす。非常に有用であるが、これらの方法には限界が低い定量的精度、短い読み取り長、および低いサンプルスループットを含む。これらの制限に対処するために我々は（BSAS）16重亜硫酸リコンシーケンシングと呼ばれるている方法を開発した。この方法の目的は、高い定量性を有する多数のサンプル中の目的の標的ゲノム領域を分析することができることである。 BSASは、既存の方法（重亜硫酸塩変換および領域特異的PCR増幅）の要素を使用して、単純な次世代ライブラリー構築とそれらを組み合わせた（トランスポ媒介）17及びベンチNGS 18（ 図1）。このアプローチは、目的の任意の領域におけるシトシンのメチル化を調べるためのより定量的な、高スループット方法を提供する。ここでは、提示詳細方法とトラブルシューティングと品質はBSASプロセスをチェックするためのアプローチを説明します。

<table><tbody><tr><td>アジレント 2100 バイオアンライザー</td><td>アジレント</td><td>G29393AA</td><td></td></tr><tr><td>アジレント RNA 6000 ナノキット</td><td>アジレント</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>アジレント 高感度 DNAキット</td><td>アジレント</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>台風 9200</td><td>アマシャム/GE ヘルスケア ライフサイエンス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アジャンコート アンプレ XP - PCR精製</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A63880</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>Bio Rad</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>twin.tech PCR プレート 96&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td>951020362</td><td>セミスカート</td></tr><tr><td>ヒートシールフィルム</td><td>エッペンドルフ</td><td>0030127838</td><td></td></tr><tr><td>ヒートシールホイル</td><td>エッペンドルフ</td><td>0030127854</td><td></td></tr><tr><td>ヒートシーラー</td><td>エッペンドルフ</td><td>5390000.024</td><td></td></tr><tr><td>0.1-10 &#956;lヒント</td><td>エッペンドルフ</td><td>0030073.002</td><td></td></tr><tr><td>2-200 &#956;lヒント</td><td>エッペンドルフ</td><td>0030073.045</td><td></td></tr><tr><td>50-1,000 &#956;l ヒント</td><td>Eppendorf</td><td>0030073.100</td><td></td></tr><tr><td>MixMate&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td>5353000.014</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml微量遠心チューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>0030121.023</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機5424</td><td>エッペンドルフ</td><td>5424000.010</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml微量遠心チューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>022363352</td><td></td></tr><tr><td><a href="http://www.illumina.com/products/nextera_xt_dna_library_prep_kit.html">Nextera XT DNAサンプル調製キット</a></td><td>イルミナ</td><td>FC-131-1024</td><td>24 rxn</td></tr><tr><td><a href="http://www.illumina.com/products/nextera_xt_dna_library_prep_kit.html">Nextera XT インデックスキット</a></td><td>イルミナ</td><td>FC-131-1001</td><td>24 インデックス</td></tr><tr><td><a href="http://www.illumina.com/systems/miseq.html">MiSeq デスクトップシーケンサー</a></td><td>イルミナ</td><td></td><td></td></tr><tr><td><a href="http://www.illumina.com/products/miseq_reagent_kit_v2.html">MiSeq Reagent Kit v2</a></td><td>Illumina</td><td>MS-102-2002</td><td>300 cycles</td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4824</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit</td><td>Life Technologies</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit</td><td>Life Technologies</td><td>R11490</td><td></td></tr><tr><td>ProFlex 96 ウェル PCR システム</td><td>Life Technologies</td><td>4484075</td><td></td></tr><tr><td>Novex 6% TBE DNA gel</td><td>Life Technologies</td><td>EC6261BOX</td><td>10-well</td></tr><tr><td>Novex TBE Running Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>LC6675</td><td>5x (1 L)</td></tr><tr><td>Novex Hi-Density TBE Sample Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>LC6678</td><td>5x (10 ml)</td></tr><tr><td>1 Kb Plus DNA</td><td>Ladder Life Technologies</td><td>10787-018</td><td></td></tr><tr><td>Xcell SureLock Mini-Cell</td><td>Life Technologies</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10 mg/ml Ethidium Bromide</td><td>Life Technologies</td><td>15585-011</td><td></td></tr><tr><td>7900HT 高速リアルタイム PCR システム</td><td>Life Technologies</td><td>4329001</td><td>384-well block</td></tr><tr><td>DynaMag-96 Side Skirted</td><td>Life Technologies</td><td>12027</td><td></td></tr><tr><td>SpectroMax M2 マルチモードマイクロプレートリーダー</td><td>Molecular Devices/VWR</td><td>89429-532</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td></td></tr><tr><td>ステンレススチールビーズ</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td>5 mm</td></tr><tr><td>CLC Genomics Workbench</td><td>Qiagen</td><td></td><td>メチル化パイプライン用ソフトウェア</td></tr><tr><td>QIAQuick PCR 精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>50 rxn</td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>Retsch/Qiagen</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td></td><td>Σ W4502</td><td></td></tr><tr><td>TRIS 塩酸塩</td><td>Σ</td><td>PHG0002-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20 Σ</td><td></td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>384 ウェル フルスカートプレート、標準</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1384</td><td></td></tr><tr><td>絶対qPCRシール</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1170</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNAメチル化-ライトニングキット</td><td>Zymo Research</td><td>D5030</td><td>50 rxn</td></tr><tr><td>ZymoTaq DNAポリメラーゼ</td><td>Zymo Research</td><td>E2001</td><td>50 rxn</td></tr></tbody></table>

次世代シーケンシングによりdnaメチル化解析をターゲット

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

遺伝子発現の制御におけるエピジェネティックなプロセスの役割は、何年も前から知られています。シトシン残基でのDNAメチル化は、遺伝子発現の長期持続性と動的調節因子の両方であることが実証されているため、エピジェネティックな研究にとって特に興味深いものです。健康と疾患のエピジェネティックな変化を調べる取り組みは、ハイスループットで定量的に正確な方法の欠如によって妨げられてきました。次世代シーケンシング(NGS)技術の出現と普及により、これらのツールは、既存のゲノムおよびトランスクリプトーム方法論に加えて、現在エピゲノミクスにも適用されています。特定の遺伝子プロモーターやCpGアイランドなどの関心領域が特定され、大量のサンプルを高い定量精度で調べる必要があるシトシンメチル化のエピジェネティックな研究のために、バイサルファイトアンプリコンシーケンシング(BSAS)と呼ばれる方法を開発しました。この方法は、バイサルファイト変換と関心領域の標的増幅、トランスポソーム媒介ライブラリ構築、およびベンチトップNGSを組み合わせたものです。BSASは、基本的な分子生物学のスキルを持つほとんどの研究グループが一度に実行できる、最大96サンプルの最大10 kbの標的領域を迅速かつ効率的に分析する方法を提供します。この結果から、塩基特異性を持つシトシンメチル化の絶対定量が得られます。BSASは、あらゆるDNA源のあらゆるゲノム領域に適用することができます。この方法は、目的領域の仮説検定研究や、全ゲノムバイサルファイトシーケンシング、低発現バイサルファイトシーケンシング、メチル化DNA免疫沈降シーケンシングなどのゲノムワイドなメチル化解析で同定された領域の確認に役立ちます。

BSASは正しく図5のようになり、変換参照配列に整列読み出す。CpGジヌクレオチドを明確に識別することができ、メチル化状態は、マッピングされた読み取りにおけるCpG部位でのベースコールを観察することによって推定することができる。例えば、メチル化コントロールと、0％メチル化は、すべてのTの（ 図5A）を含むCpG部位にマッピングされた読み取りをもたらす。 100％のメチル化コントロールがマップされて読み込まれるすべてのCの（ 図5B）を含むCpG部位に読み込むことになります。 CpG部位のシトシン周波数（C / C + T）の定量は、元の試料中のメチル化頻度をもたらす。全ゲノムメチル化コントロールた（n = 3 /メチル化率）から生成された代表的な標準曲線は、それぞれ、メチル化率（ 図6）で定量におけるメチル化の定量の直線性並びに精度を示している。合計で、この方法の一例として、RNAおよびDNA共イソた<html>マウスの小脳および網膜（n = 4 /群）からlated。選択的に、網膜組織において発現ロドプシン発現は、定量PCRを用いて測定した。発現は、唯一の網膜（ 図7A）で検出された。 BSASを使用して、CpGメチル化のレベルはロドプシンプロモーター領域で定量した。プロモーター領域を横切る累積メチル化レベルは、網膜の&lt;15％に（p &lt;0.001、パラメトリックt検定）（ 図7B）と比較して小脳に&gt; 80％であった。部位特異的メチル化の定量からBSASメチル化定量の利点、及びメチル化レベルは、任意のゲノム領域を横切るCpG特異的に基づいて比較することができる。網膜サンプルた（p &lt;0.001、各々のCpG部位におけるパラメトリックt検定）（ 図7C）と比較した場合、ロドプシンプロモーター渡ってCpGメチル化のレベルは、小脳の試料において有意に高かった。 1highres.jpg &quot;/&gt; 図1：BSAS方法の概略は、この方法では、ゲノムDNAを重亜硫酸塩がウラシルに非メチル化シトシンを修飾するために変換される。その後、PCRの間にこれらのウラシルはチミンに変更されます。 PCR増幅は、関心領域に向けられた、高度にだけこれらの配列について富化される。得られたPCRアンプリコンは、単純なtagmentationプロセスを通じてデュアルインデックス化ライブラリに作られています。その後、ライブラリは、ベンチトップ次世代シーケンサー上で配列され、配列決定は、シトシンのは、塩基特異的方法で決定されたのシリコ変換参照配列とパーセントメチル化にマッピングされて読み込みます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig2highres.jpg" /> 図2：関心領域のシリコ亜硫酸水素塩変換では 、任意のゲノム基準からの関心の任意の領域は、セレクことができますシリコ亜硫酸水素変換におけるためのテッド。非CpGシトシンがチミンの参照配列中に置換されます。のCpGシトシンは重亜硫酸塩変換された参照内のシトシンのまま。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig3highres.jpg" /> 図3：プライマー配置亜硫酸塩PCRプライマーは、 インシリコ亜硫酸変換参照配列におけるに対して設計されている。プライマーは、それらがCGジヌクレオチドを​​重複しないように設計またはCGジヌクレオチドに隣接するように設計されるべきである。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig4highres.jpg" /> 図4：高および低品質のPCRアンプリコンとシーケンシングライブラリーの例代表電気泳動図トレースとゲルショー（A）単一の高とトランスポ媒介ライブラリ生成のための理想的なアンプリコン。濃縮製品。このアンプリコンから生成された（B）ライブラリ（C）低品質のPCRアンプリコンのサイズ、濃度が低くてもよい。高濃度、さらにはサイズ分布を示し、複数の製品および/ ​​またはプライマー二量体を含む。これらの低品質のアンプリコンは、（D）につながる低濃度と低サイズ分布を有するライブラリー生成に失敗しました。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig5highres.jpg" /> 図5：メチル化コントロールからシーケンシング出力の例。 インシリコ （A）は、CpG部位を有する基準シングが赤で強調表示に変換。マップされた0％のメチル化制御はCpG部位でのチミン（貪欲ハイライト）マッピングを示す選択された領域に読み込みます。（B）100％のメチル化制御マッピングされたがCpG部位のシトシンの（青のハイライト）のマッピングを示して読み込みます。 図6：メチル化コントロールの範囲にわたるメチル化定量 0％から100％までのメチル化比率た（n = 3 /比）で混合した全ゲノムメチル化コントロールはBSASを用いて定量した。定量化に対する期待の定量をプロットすると、メチル化制御定量の直線性を示している。すべてのコントロールを越え、高い精度がメチル化定量にあった。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig7highres.jpg" /> 図7：組織サンプルからの対のDNAメチル化および遺伝子発現分析の例。 （A）マウス小脳および網膜組織からロドプシン相対的mRNA発現。（B）小脳および網膜DNA（***はp &lt;0.001、パラメトリックt検定）との間にBSASにより定量化ロドプシン平均プロモーターのメチル化。 &lt;マウスの小脳および網膜DNA中の転写開始部位[TSS]）に対してロドプシンプロモーター（6へ-244、全体で強い&gt; C）のCpG部位特異的メチル化レベル。

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS)は、標的ゲノムの関心領域におけるシトシンメチル化を定量化する方法です。この方法では、バイサルファイト変換と標的領域のPCR増幅を組み合わせて次世代シーケンシングを行い、塩基特異的レベルでのDNAメチル化の絶対定量を行います。

次世代シーケンシングによりDNAメチル化解析をターゲット

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

この手順の全体的な目的は、目的の組織または細胞から単離したゲノムDNAにおいて、標的となる関心領域のCpGメチル化量を定量することです。これは、まずビスルフィート変換済みゲノムDNAから関心領域を増幅させるためのビスルフィート特異的PCRプライマーを設計することで達成されます。第2段階では、ビスルフィート変換された関心領域を増幅し、そのアンプリコンから次世代シーケンシング（NGS）ライブラリを構築します。次に、ライブラリのシーケンシングを行い、解析用のFASTQファイルを生成します。最終ステップでは、シーケンシングリードを重亜硫酸塩変換済みの参照ターゲット配列にアライメントし、最終的に5-mc%を算出します。重亜硫酸塩アンプリコンシーケンシング（BSAS）を用いることで、あらゆるモデル生物の任意の関心領域におけるCpGメチル化を、精密かつ正確に定量することが可能です。サンガーシーケンシングなどの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、BSASが高精度で正確なCpGメチル化定量を超高速かつハイスループットに提供し、多数のサンプルにおける複数の領域をアッセイすることを可能にする点にあります。ターゲットを特定しプライマーを設計した後、単一アンプリコンのターゲット増幅最適化のための反応液を調製し、PCRプレートをヒートシールフィルムで密封して、アガロースゲル電気泳動によりアンプリコンを可視化します。次に、適切なウェルに30 µLのPCR反応液またはラダーをロードし、200 Vで約45分間ゲルを泳動させます。最初の色素がゲルの末端に到達したら、反応を停止させ、調整直後の5 µg/mLのエチジウムブロマイド（EtBr）でゲル全体を染色します。5分後、励起波長482 nanometersのUVトランスイルミネーターを用いてゲルの画像を撮影します。ラダーを用いてPCR産物のサイズを測定し、反応の特異性を判定します。期待される産物サイズ以外の複数のバンドを確認し、検出されたライブラリーピークの平均サイズを決定し、モル濃度を推定します。次に、製造元の指示に従い、高感度DNAアッセイを用いてキャピラリー電気泳動DNAサイジングチップでライブラリを走行させます。QPCRによるライブラリの定量には、作成したライブラリのアダプター配列に対して設計されたプライマーと既知濃度の標準品を用い、製造元の指示に従って絶対定量設定にしたリアルタイムPCR装置を使用します。次に、ライブラリのサイズとQPCRによるモル定量値を用いて、ライブラリのモル濃度を算出します。シーケンシング後、圧縮されたfast Qファイルを適切なシーケンシング解析パイプラインにインポートし、「import」を選択した後、リードトリミングアプリケーションでQスコアを保持するために、リード生成に使用したシーケンシング方法を選択します。適切な圧縮fast Qリードファイルをインポートし、「general options」で「discard quality scores」の選択を解除します。インポートしたリードの保存場所を選択し、「finish」をクリックします。次に、「NGS core tools」の下にある「trim sequences」を選択します。トリミングするリードをハイライトし、Q 30以上のスコアを持つリードのみを保持します。次に、「quality scores」を用いてトリミングを選択し、しきい値を0.001に設定します。さらに、曖昧なヌクレオチドが1つ以下含まれるリードのみを選択するため、「trim ambiguous nucleotides」を選択し、曖昧なヌクレオチドの最大数を1に設定します。次に、トリミング済みリードの保存場所を選択し、「finish」をクリックして、トリミング済みリードをin silico亜硫酸塩変換遺伝子リファレンスにマッピングします。「NGS core tools」の下で、「map reads」を選択します。「reference」には、マッピングするトリミング済みリードを選択し、「next」をクリックします。次に、「reference masking（リファレンス・マスキング）」で、変換済みのリファレンス配列を選択し、「no masking（マスキングなし）」を選択します。「Next」をクリックし、ミスマッチ、挿入、および欠損に3のスコアを割り当てます。「minimum fraction of read length map to the reference（リファレンスにマップされるリード長の最小割合）」に1のスコアを割り当て、「nonspecific match handling（非特異的マッチング処理）」におけるマップ、リード、およびリファレンス間の「minimum fraction of identity（最小一致割合）」に0.9のスコアを割り当て、「ignore（無視）」を選択し、「Next」をクリックして出力オプションへ進みます。次に、「Create standalone read mappings」を選択します。その後、「result handling」の下にある「save」をクリックします。リードマッピングの保存先を選択し、「finish」をクリックして、マッピング済みリードのバリアントコールを実行します。再シーケンス解析において、「low frequency variant detection」を選択し、解析対象のリードマッピングを選択します。「next」をクリックし、「low frequency variant parameter」に0.01%と入力して「next」をクリックします。「general filters」において、シーケンスの深さが1000 x以上であることを確実にするため、minimum coverageを1000に設定します。最後に、「next」をクリックし、出力オプション（output options）で「create annotated table」を選択して、バリアントテーブルファイルの保存場所を指定し、「finish」をクリックします。バリアントテーブルファイルから、関心領域内のアノテーション済みCpG部位におけるバリアント頻度を用いて、CGコンテキストにあるリファレンスシトシンのシトシンメチル化頻度を算出します。変換後のリファレンス配列に適切にアライメントされた亜硫酸塩アンプリコンシーケンシングリードは、図に示されているものと同様になります。CpGジヌクレオチドを明確に識別でき、CpG部位のベースコールを観察することでメチル化状態を推定できます。マッピングされたリードにおいて、メチル化率が0%である場合、CpG部位にチミンがマッピングされたリードが得られます。100%メチル化コントロールでは、CpGサイトにマップされたシトシンを含むマップ済みリードが得られます。本実験では、マウスの小脳および網膜からRNAとDNAを共分離しました。その後、予想通り、網膜組織で選択的に発現するオプシンの発現量をqPCRを用いて測定しました。重亜硫酸塩増幅シーケンシング（bisulfite amplification sequencing）を用いてOpsinプロモーター領域のCpGメチル化レベルを定量化した結果、opsin RNAは網膜でのみ検出されました。しかし、プロモーター領域全体の累積メチル化レベルは、網膜では15%未満であったのに対し、小脳では80%を超えていました。BSASによるメチル化定量では、部位特異的なメチル化定量が可能なため、任意のゲノム領域におけるCpGごとのメチル化レベルを比較することができます。実際、本実験において、オプシンプロモーター領域のCpGメチル化レベルは、網膜サンプルと比較して小脳サンプルで有意に高いことが分かりました。このビデオを視聴することで、組織または細胞から単離したゲノムDNAの、標的となる関心領域におけるCpGメチル化の定量方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Biology

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学ぶビスルファイトアンプリコンシーケンス法によるDNAメチル化定量解析。次世代シーケンシングを用いて標的ゲノム領域のシトシンメチル化を正確に定量化し、エピジェネティック制御機構の理解を深める。

次世代シーケンシングによりDNAメチル化解析をターゲット

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