グラスサポート平面脂質二重層上のナチュラルキラー細胞免疫シナプスの超解像イメージング

この手順の全体的な目標は、支持された脂質二重層上のナチュラルキラー細胞またはNK細胞の免疫学的シナプスの超解像画像を成功裏にキャプチャする方法を実証することです。これは、NK細胞活性化受容体CD16インチャンバースライドに対する抗体を含むガラス支持平面脂質二重膜を構築することによって達成されます。次に、以前に単離されたNK細胞を平面抗体包埋脂質二重層に添加し、続いて細胞をfアクチンとパーフォリンで染色します。

最後のステップは、ステッド顕微鏡を使用して得られたNK細胞シナプスのイメージングであり、最終的には支持脂質二重膜上のNKシナプスのイメージングです。STEADを使用すると、NK細胞のシナプスがより詳細に示され、低Fアクチン密度の領域上に位置するアクチン細胞骨格およびペラン陽性リティック顆粒の超構造を視覚化できます。したがって、この技術の主なものは、ガラス支持プレーン脂質バリアが、このプレーン脂質バリア上のタンパク質であるタックセルのプラス膜を模倣できることです。

それらは横方向に動くことができ、それは免疫シナプスの非常に論理的に関連する形成をよりよく再現することができる。このメッセージは、免疫学の分野における主要なクリスチャンに答えるのに役立ち、研究者は、商業的および顕微鏡的なアプローチを使用して達成できない、制御された方法で詳細にシナプス形成を視覚化することができます。ポスドクフェローの絵画と大学院生の助成金が、ガラス支持平面脂質二重膜を組み立てる手順を実演します。

まず、この溶液にビーカーで30%の過酸化水素と硫酸を1対3の割合で混合して、100ミリリットルのピラニア溶液を準備します。カバースリップが洗浄されている間、2つの長方形の番号1.5カバースリップを20〜30分間置きます。以前に調製した400マイクロモルDOPC脂質のチューブ1本と、以前に調製した80マイクロモルビオチンPE脂質のチューブ1本を回収します。

アルゴンで新しいマイクロ遠心分離管をデオキシ酸素化した後、氷上でアルゴンタンクに輸送します。DOPCとビオチンPEを1対1の比率で合計します。具体的な容量は実験のニーズによって異なりますが、少なくとも2マイクロリットルである必要があります。

各デオキシは、はしごを冷蔵庫に戻す前に、混合物チューブと個々の試薬チューブに酸素を供給します。清掃が終了したら、カバースリップを蒸留水で十分にすすいでください。カバーを滑り込ませて数分間風乾させ、その後、リポソーム混合物の1.5マイクロリットルを引き出し、チャンバースライドのレーンチャンバーの1つに1滴でアリコートします。

レーンごとに 2 つのドロップを使用するのが一般的ですが、必須ではありません。次に、迅速かつ効率的に、乾いたカバースリップを液滴の上に置き、カバースリップが配置されると液滴が合流しないように、液滴が十分に間隔を空けていることを確認します。さらに、液滴がチャンバーの壁の端に触れることなく、円形で明確に保

各レーンの間と周囲をしっかりと押し下げて、カバー間の防水シールを確保します。マーカーペンを使用して、液滴の位置をスライドさせてマークします。次に、100マイクロリットルの5%ケーシングの水性をチャンバーに通して、二重層をブロックします。

フローチャンバーに気泡がないことを確認してください。次に、100マイクロリットルのストレプトアジンを1ミリリットルあたり333ナノグラムの濃度で各レーンに注入します。室温で10〜15分間インキュベートした後、1%ヒト血清アルブミンを含む3ミリリットルの緩衝生理食塩水を各レーンに流して洗浄します。

過剰なトリチンを除去するために、100マイクロリットルのビオチン化蛍光標識抗CD16を、暗所で20〜30分間インキュベートした後、テキストプロトコルに記載されているように予め決定されたタンパク質濃度で加えます。各レーンに1%ヒト血清アルブミンを含む3ミリリットルの緩衝生理食塩水を流して再度洗浄します。次に、100マイクロリットルのDビオチンを濃度25ナノモルでチャンバー内に流し、過剰なSTRタビンを結合させ、STRタビンが細胞に非特異的に結合する可能性を排除します。

次に、ヒトNK細胞をカウントし、1%ヒト血清アルブミンを含む食塩水を山積みに緩衝した生理食塩水に500,000ミリリットルあたりの濃度で再懸濁します。Dビオチンをチャンバーから洗い流し、レーンごとに1%ヒト血清アルブミンを含む緩衝生理食塩水をさらに3ミリリットル入れます。細胞を所望の濃度に再懸濁したら、各レーンに100マイクロリットルを加えます。

チャンバーを摂氏37度の5%二酸化炭素インキュベーターに30〜60分間置きます。このインキュベーション期間の後、細胞を4%パラフォームアルデヒドで室温で10〜20分間固定します。3ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水を各レーンに流して洗浄し、パラホルムアルデヒドを除去します。

次に、400マイクロリットルのブロッキングバッファーを加えてから、室温で30分間インキュベートします。次に、希釈した蛍光標識Phinおよび蛍光標識抗ペランモノクローナル抗体を2マイクロリットル加えてfアクチンおよびパーフォリンを染色し、室温で1時間インキュベートしてから、3ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水をチャンバーに流して洗浄します。チャンバーはイメージングを開始する準備ができています。

ステッド顕微鏡の必要なすべてのハードウェアモジュールの電源を入れます。画像解析ソフトウェアを起動し、レゾナントスキャンモジュールとステッドモジュールの両方を有効にします。これらの選択を行った後、ソフトウェアが起動するまで約 3 分から 5 分待ちます。

画面上部の[設定]タブをクリックし、[レーザー設定]を選択します。次に、白色光と代わりに592ナノメートルレーザーをオンにします。100 x 対物レンズを選択し、励起レーザービームを 592 ナノメートルの空乏レーザーに合わせます。

レーザー構成モジュールを選択し、592 デプレッション レーザーをオフにし、660 ナノメートル デプレッション レーザーをオンにします。スライドをステージのレンズの上に置きます。境界が定められた二重層領域に結合した細胞を、白色光ランプと接眼レンズを使用して焦点を合わせます。

次に、設定タブのすぐ右側にある取得タブに戻ります。[白色光への切り替え]タブをクリックし、そのモジュールをオンにして、励起レーザーラインを適切な波長にドラッグします。目的の検出器を選択し、検出範囲を設定したら、左側の取得ツールバーのシーケンシャルボタンをクリックして、左側のツールバーの下部にシーケンシャルスキャンダイアログを表示します。

これにより、ユーザーは複数のシーケンスを追加し、それぞれに異なる色の異なる励起ビームを付けることができます。フレーム間をクリックし、追加の各色の励起周波数検出器と検出範囲を設定します。すべての設定が最適化されたら、開始を押して取得プロセスを開始します。

ガラス支持平面脂質二重膜上のNK細胞シナプスのトリプルカラーステッド画像は、赤色で示された抗CD16抗体が脂質二重膜上に蓄積してFアクチン形成を誘発し、青色で示されたパーフォリンの分極と浸透が焦点パネルのFアクチンメッシュを介して示されていることを示しています。この組み合わせたアプローチを使用すると、NK細胞上のCD16のクラスターを直接反映するガラス支持脂質二重層内の蛍光標識抗CD16のマイクロクラスターをきれいに観察できます。従来の共焦点像と比較して、CD 16中央クラスターのリング構造は、周囲の蛍光が枯渇しているため、代位像でより容易に識別できます。

さらに、アクチン細胞骨格の超微細構造は、大幅に改善された分解能で見られます。これまでの観察結果と同様に、ペリン陽性の溶解性顆粒は、Fアクチン密度の低い領域上に位置していることが観察されます。代わりに、共焦点画像ではほとんど失われる重要な詳細を習得すると、この手法は、それを通過しながら適切に行えば、約4時間実行できます。

酸素をアルゴンンで繰り返し置換することでサンプルを脱酸素状態に保つこと、およびチャンバーを組み立てるときは、カバースリップをサンプルにすばやく置き、ケーシング溶液に浸すことで、サンプルを脱酸素状態に保つことを覚えておくことが重要です。