Name: グラスサポート平面脂質二重層上のナチュラルキラー細胞免疫シナプスの超解像イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 学ぶグラス支持平面脂質二重層とSTED顕微鏡を用いたナチュラルキラー細胞免疫シナプスの超解像イメージング手法。アクチン細胞骨格と穿孔素顆粒の詳細な可視化が可能になり、免疫応答の細胞レベル理解が進む。

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イメージングとデコンボリューション解析をしてくださったEmily MaceさんとMalini Mukherjeeさんに感謝します。劉研究室での研究は、国立アレルギー感染症研究所のベイラー・ユタ州エイズ研究センターのコアサポート助成金番号AI36211、分子医学研究のためのキャロライン・ウィース法律基金、テキサス小児病院小児パイロット研究基金、ベイラー医科大学とメソジスト研究所のリンパ腫胞子発達研究プログラムによって部分的に支援されました。

<ol><li>Dustin, M. L., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+immunological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic immunological synapses.</a> Immunol. Rev. 235 (1), 24-34 (2010).</li>
<li>Monks, C. R., Freiberg, B. A. K. upferH., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Hafeman, D. G., von Tscharner, V., McConnell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+antibody-dependent+interactions+between+macrophages+and+lipid+haptens+in+planar+lipid+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Specific antibody-dependent interactions between macrophages and lipid haptens in planar lipid monolayers.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 78 (7), 4552-4556 (1981).</li>
<li>Tscharner, V., McConnell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+properties+of+lipid+monolayers+on+alkylated+planar+glass+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Physical properties of lipid monolayers on alkylated planar glass surfaces.</a> Biophys J. 36 (2), 421-427 (1981).</li>
<li>Crites, T. J., Chen, L., Varma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TIRF+microscopy+technique+for+real-time%2C+simultaneous+imaging+of+the+TCR+and+its+associated+signaling+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A TIRF microscopy technique for real-time, simultaneous imaging of the TCR and its associated signaling proteins.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Prins, K. C., Vasiliver-Shamis, G., Cammer, M., Depoil, D., Dustin, M. L., Hioe, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+HIV-1+envelope-induced+virological+synapse+and+signaling+on+synthetic+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging of HIV-1 envelope-induced virological synapse and signaling on synthetic lipid bilayers.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Vardhana, S., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+Planar+Bilayers+for+the+Formation+of+Study+of+Immunological+Synapses+and+Kinapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse.</a> J. Vis. Exp. , (2008).</li>
<li>Michalet, X., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+photon+statistics+to+boost+microscopy+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Using photon statistics to boost microscopy resolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (13), 4797-4798 (2006).</li>
<li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putting+super-resolution+fluorescence+microscopy+to+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Putting super-resolution fluorescence microscopy to work.</a> Nat. Methods. 6 (1), 21-23 (2009).</li>
<li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Far-field+optical+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Far-field optical nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li>
<li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+immunological+synapse+by+dual+color+time-gated+stimulated+emission+depletion+%28STED%29+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy.</a> J. Vis. Exp. , (2014).</li>
<li>Rak, G. D., Mace, E. M., Banerjee, P. P., Svitkina, T., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell+lytic+granule+secretion+occurs+through+a+pervasive+actin+network+at+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse.</a> PLoS Biol. 9 (9), e1001151(2011).</li>
<li>Leutenegger, M., Ringemann, C., Lasser, T., Hell, S. W., Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+with+a+total+internal+reflection+fluorescence+STED+microscope+%28TIRF-STED-FCS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy with a total internal reflection fluorescence STED microscope (TIRF-STED-FCS).</a> Opt Express. 20 (5), 5243-5263 (2012).</li>
<li>Liu, D., Bryceson, Y. T., Meckel, T., Vasiliver-Shamis, G., Dustin, M. L., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-dependent+organization+and+bidirectional+vesicular+traffic+at+cytotoxic+immune+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Integrin-dependent organization and bidirectional vesicular traffic at cytotoxic immune synapses.</a> Immunity. 31 (1), 99-109 (2009).</li>
<li>Liu, D., Peterson, M. E., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adaptor+protein+Crk+controls+activation+and+inhibition+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The adaptor protein Crk controls activation and inhibition of natural killer cells.</a> Immunity. 36 (4), 600-611 (2012).</li>
<li>Wu, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+conjugated+supported+lipid+bilayer+for+capturing+and+purification+of+viable+tumor+cells+in+blood+for+subsequent+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Antibody conjugated supported lipid bilayer for capturing and purification of viable tumor cells in blood for subsequent cell culture.</a> Biomaterials. 34 (21), 5191-5199 (2013).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

現在の研究の新規性は、NK細胞のシナプスを研究するSTEDとSLBの技術を組み合わせることである。以前の研究は、T細胞のシナプス形成8を研究するためにTIRFと脂質二重層を撮像して、原形質膜6上の分子の輸送をシグナリングしている。他のものは、抗体でコーティングされたガラススライド13,14を使用してNK細胞のシナプスのSTED画像化を記載している。本明細書中にさらに記載のハイブリッド方法は、これらの脂質二重層の表面に超解像画像化によって得られる強化明確にNK細胞のシナプスを撮像する努力、より良いモデルAPCの動的表面上に構築。 のSLBは、実際の標的細胞またはAPCが有すること骨格、脂質ラフトを欠く人工膜、および他のリガンドであるが、この技術は、移動性およびリガンドの向きと重要な特徴を再現することができる。これはSLBシステムは解剖トンで還元主義的なアプローチとして機能することができますISとISのダイナミクスの形成に個々の受容体およびリガンドの寄与彼。のSLBの最も重要な特徴は、研究者はそのような共焦点及びTIRF顕微鏡法のような高分解能イメージング手法を使用して、この手法を組み合わせることができることである。 STED顕微鏡の導入は、さらに研究とその臨床応用がISに前例のない洞察を提​​供し、この利点を増大させる。 このシステムの一つの潜在的な批判は、SLBが十分に得られ、したがってシナプスにおける潜在的に非生理的解剖学的特徴を生じさせる、APCの複雑な表面を模倣しないことである。それがSLB上の表面分子の限られたレパートリーは完全にAPCの不均一人口​​表面を再現しないことは事実ですが、それがシナプス形成上の個々の受容体とリガンドの相互作用の影響を決定するために研究者を可能にするという点で、この制限は、有利であることができる。 Tここでの処理のいくつかの重要なステップがあります。最も重要なの中でのリポソームの酸化は、常にこのようなステップ1.10、2.6のように、チューブ、溶液中の酸素を置換するために、アルゴンを用いて、2.11を介して防止されることである。脂質の酸化は、このように自由に移動し、シナプスの構造に関与する表面タンパク質の能力を阻害、減少、脂質移動度をもたらす。同様に、凍結乾燥（ステップ1.2）により、リポソーム内のすべてのクロロホルムを除去することも重要です。脂質二重層中のタンパク質濃度の測定では、最初のクラスタのない均質な懸濁液にシリコンビーズを分散させるために重要である。必要であれば、ビーズの超音波処理を適用することができる。カバースリップを洗浄されるSLB、初期段階（5.1〜）を組み立てる際に、液滴が配置され、カバースリップは不可欠で固定されている。これらのいずれかでミスが（セクション5の先頭から）上で実験を開始する必要ができます。この理由のため、それは事故の場合には時間を節約するために必要とされるよりも多くのカバーガラスをきれいにすることをお勧め。 このシステムで作業しているとき、非クラスタは、最も頻繁な問題である。最後のステップで細胞を可視化する際に、1は任意の蛍光シナプスを見つけられなかった場合は、撮影することができいくつかのステップがあります。別のコグネイト細胞表面受容体のための染色細胞をガラスカバースリップまたは二重層の表面に非特異的に付着することができるが、細胞は重層とシナプスを形成していないことを確認するために、チャンバーに添加することができ、シナプス-関与する表面タンパク質べき非係合表面タンパク質は、細胞の周囲に拡散染色のように表示されます。一方で、細胞 - 二重層界面の面でのように明確なクラスタを表示されます。このメソッドは失敗した場合、1は、特定のマーカー1は、細胞表面上に十分な豊富に発現して勉強したいと考えていることを確実にするために、フローサイトメトリーを経由して 、それらの細胞を確認する必要があります。一定の表面proteインは、インビボ培養において長期間にわたり下方調節されることが知られている。 NK細胞のシナプス形成を視覚化する方法を具体的に、このプロトコルの詳細が、SLBシステムは単に、ステップ5.11において主リガンドの置換によって想像任意の免疫細胞におけるシナプス形成を研究するために使用することができる。複数のリガンドはまた、同時に添加してもよい。一つには、二重層内表面タンパク質を付着させるためのストレプトアビジン - ビオチン系を使用する必要はありません。ニッケルNTA：ヒスチジン相互作用も生存可能である。しかし、ストレプトアビジンの高強度と特異性に起因する：ビオチン相互作用、私たちの研究室ではこのシステムを好む。一つには、ステップ5.13において、所定濃度の二重層上に添加した細胞の濃度、ならびに成熟の異なる段階でシナプスを観察するために、その後のインキュベーション期間の持続時間を変えることができる。もちろん、これは細胞内のSTRを可視化する可能性を排除が、これはあっても、生きて行うことができますuctures（これらはすでに融合した蛍光タグで標識されていない限り、私たちの研究室は、いくつかのような変更された細胞株を使用しています）。これにより、プロトコルの可能な高度なカスタマイズのために、一つの基本的な脂質ダイナミクス15、シナプス形成を含む、免疫学、細胞生物学、および生化学における質問の非常に多様な範囲に対処するために、STEDイメージングと共に、基本SLB技法を使用することができ16、17細胞内シグナル伝達、および腫瘍細胞の転移18。

免疫学的シナプスは（IS）細胞の活性化と機能1の臨界接合部である。これは、抗原提示および細胞性免疫が行われることにより、主要な媒体である。シナプス形成の最も初期の顕微鏡研究は、細胞-細胞複合体システム2を利用した。このアプローチの主要な制限は、それがあったとして、複合体のほとんどは、このようにシナプスの構造自体の観察者の視界を制限する、「プロファイルで「見られることである。 1999年には、ダスティンの研究室では、以前のMcConnelラボ4,5によって開拓されていたガラスサポート脂質二重層（SLB）技術3を利用することによって、この制限に対処。このアプローチは、タンパク質が結合し、二次元で自由に移動することができたにガラスサポート脂質平面表面を支持する抗原提示細胞（APC）、処分した。この方法を使用して、ダスティンと同僚は、Tに直接バックアップピアすることができました彼は、高解像度の蛍光顕微鏡を用いて、初めてISの構造の「対面」外観を得るシナプス。 SLBシステムを用いて、ISを視覚化することが可能な詳細は、現在の画像化技術6-8の限界によって制限されている。標準照射技術を用いて、最小分解能（これらは区別することができる、請求つの異なるオブジェクト間、即ち、最小距離）は、レイリーの基準9に基づいて&lt;200nmであった。この制限は、シナプスを構成する非常に微細な、分子スケールの構造の画像化を妨害し、超解像技術の開発10-12まで、これらの構造の可視化は、電子顕微鏡を用いて固定された細胞の画像化に限定された。 そのようなSIMのような超解像技術は、種々の最近の出現により、（構造化照明顕微鏡）、PALM（光活性化ローカライゼーション顕微鏡）、STORM（stochastical光学復興顕微鏡）、およびSTED 10-12は 、研究者らは現在、順番にISのますます明確に理解を提供してきたこれまでにない詳細にこれらのシナプスの構造を研究することができます。 STED顕微鏡法の利点は、13の前に記載されている。ここでは、新たに開発された660nmの枯渇レーザーを備えたSTED顕微鏡で超解像画像を記述する。従来の592 nmの枯渇レーザーと比較して、660 nmのレーザーは、蛍光色素（http://nanobiophotonics.mpibpc.mpg.de/old/dyes/を参照）、特に、これらの赤色蛍光体のより広い選択が可能になる。 他の刊行物は、抗体でコーティングされたスライドガラス13,14にNK細胞のシナプスのSTED画像化を記載している。ここで、SLBシステムはNK細胞のシナプスを研究するために、超解像STED顕微鏡法と組み合わされる。この技術は、抗体を上回る利点を有している埋め込まれた表面タンパク質が平坦二次元平面（xy平面）内で自由に移動できる流動モザイクという被覆スライド。これは、より忠実に標的細胞の有機及び移動表面を模倣し、その結果、優れた生理学的に関連する免疫シナプスの形成を再現する。 このプロトコルの目的は、SLBシステムと、超解像STED顕微鏡法を組み合わせることにより、NK細胞のどの画像に免疫学的シナプスの詳細な説明と、エンドユーザに提供することである。それに必要な手順をエンドユーザに提供する：リポソームを調製し、タンパク質包埋二重層を構成する脂質二重層にタンパク質濃度を決定し、STED顕微鏡を用いて超解像画像を取得する。これらの技術は、免疫学の分野に限らず、広く、様々な分野にわたって使用することができる。

<table><tbody><tr><td>18:1 (&デルタ;9-CIS) PC (DOPC) 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン</td><td>アバンティ&nbsp;</td><td>850375C</td><td>リポソーム調製</td></tr>物<tr><td>18:1ビオチニルキャップPE 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(キャップビオチニル)(ナトリウム塩)</td><td>アバンティ&nbsp;</td><td>870273C&nbsp;</td><td>リポソーム調製</td></tr><tr><td>アルゴンガス、圧縮空気</td><td>&nbsp;</td><td>UN1006</td><td>リポソーム製剤</td></tr><tr><td>A 凍結乾燥機</td><td>Labconco&nbsp;</td><td>Freezone 7740020</td><td>リポソーム製剤</td></tr><tr><td>凍結乾燥機チューブ</td><td>Labconco&nbsp;</td><td>7540200</td><td>リポソーム調製</td></tr><tr><td>クロマトグラフィーカラム</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-205558</td><td>リポソーム調製</td></tr><tr><td>1 M Tris pH 8.0</td><td>Ambion&nbsp;</td><td>AM9856</td><td>リポソーム調製</td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Ambion&nbsp;</td><td>AM9759</td><td>リポソーム製剤</td></tr><tr><td>オクチル-β;-D-グルコピラノシド</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>O1008</td><td>リポソーム製剤</td></tr><tr><td>透析チューブ</td><td><a href="http://www.spectrumlabs.com/generic/tms.html?LiFrom=%2Fdialysis%2FRCtubing.html;FrName=Spectra%2FPor+RC+チューブ;rtm=キット;#KIT">スペクトラムラボ&nbsp;</a></td><td>132676</td><td>リポソーム調製</td></tr><tr><td>96ウェル V底ポリスチレンプレート(未処理)</td><td>Corning</td><td>3896</td><td>抗体密度測定</td></tr><tr><td>非機能化シリカビーズ</td><td>Bangs Laboratories&nbsp;</td><td>SS06N</td><td>抗体密度測定</td></tr><tr><td>FACSチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>14-959-2A&nbsp;</td><td>抗体密度の測定</td></tr><tr><td>QuantumTM MESF beads</td><td>Bangs Laboratories</td><td>可変</td><td>抗体密度測定</td></tr><tr><td>カゼイン&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>C0875</td><td>脂質二重層調製</td></tr><tr><td>HEPES緩衝生理食塩水+ 1%HSA</td><td>自家製</td><td></td><td>脂質二重層調製</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー&nbsp;</td><td>434301</td><td>脂質二重膜調製</td></tr><tr><td>物 蛍光標識ビオチン化タンパク質&nbsp;</td><td></td><td></td>自家製<td>脂質二重層調製</td></tr><tr><td>同上 スティッキースライドVI 0.4</td><td>同上&nbsp;</td><td>80608</td><td>脂質二重層調製</td></tr><tr><td>25x75 mm ガラス カバースリップ</td><td>同上&nbsp;</td><td>10812</td><td>脂質二重膜調製</td></tr><tr><td>過酸化水素(30%)</td><td>Fisher Scientic&nbsp;</td><td>BP2633</td><td>脂質二重膜調製</td></tr><tr><td>物 硫酸</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>258105</td><td>脂質二重層調製</td></tr>物 <tr><td>D-ビオチン</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>B20656</td><td>脂質二重膜調製</td></tr><tr><td>レンズペーパー</td><td>VWR&nbsp;</td><td>54826-001</td><td></td></tr><tr><td>イメージング用 タイプF 浸漬オイル</td><td>ライカ&nbsp;</td><td>11 513 859</td><td>イメージング</td></tr><tr><td>用 A ライカ TCS STED 顕微鏡</td><td>ライカ</td><td></td><td>イメージング用</td></tr></tbody></table>

グラスサポート平面脂質二重層上のナチュラルキラー細胞免疫シナプスの超解像イメージング

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

ガラス支持平面脂質二重膜システムは、さまざまな分野で利用されてきました。この技術の最も有用な用途の1つは、ガラスで支持された平面脂質二重層が標的細胞の表面を模倣しながら水平界面を形成する能力により、免疫学的シナプス形成の研究でした。近年の超解像イメージングの進歩により、科学者はシナプス構造の細部をよりよく見ることができるようになりました。本研究では、これらの先進的手法の一つであるSTED(Stimulated Emission Depletion)を用いて、担持脂質二重膜上のナチュラルキラー(NK)細胞シナプスの構造を研究します。ここには、ガラス支持二重膜の合成に使用するための生の合成リン脂質の調製方法、およびガラス支持二重膜の合成に使用するための簡単なプロトコルの詳細が記載されています。特定の濃度のタンパク質が二重膜の付着部位をどの程度密に占めるかを決定する方法。NK細胞活性化受容体CD16に対する抗体を含む支持脂質二重層をどのように構築するか;そして最後に、STED超解像顕微鏡を使用して、NKシナプスにおけるパーフォリン陽性溶解顆粒と糸状アクチンの分布に焦点を当てて、この二重層上のヒトNK細胞をイメージングする方法を紹介します。したがって、ガラス支持平面脂質二重膜システムとSTED技術を組み合わせることで、この組み合わせ技術の実現可能性と応用、およびNK免疫シナプスの細胞内構造を超解像で実証します。

図1は、脂質二重層上の抗体密度の結果を示す。原理は、フローサイトメトリー（A） を介して MFI対MESFの標準曲線を作成するための標準的なビーズを使用することである。サンプル列のMFIは、標準曲線を用いてMESFに変換した。脂質二重層上の抗体密度は、直線的に抗体濃度（B）と相関している。 図2ガラス支持平面脂質二重層におけるNKシナプスの三色STED画像を示す。脂質二重層上の抗CD16抗体は、Fアクチン形成及び分極およびNK細胞における免疫シナプスの焦点パネルでFアクチンメッシュパーフォリンの浸透を誘発する、蓄積する。この組み合わせたアプローチを使用して、1はきれいに直接NK細胞上のCD16のクラスタリングを反映しSLB、内抗CD16蛍光標識のマイクロクラスタを観察することができます。従来の共焦点画像を、CD16セントラの構造と比較してlのクラスタは、より容易により枯渇周囲の蛍光にSTED画像において識別される。また、アクチン細胞骨格の微細構造が大幅に向上解像度で見られる。以前の観察16,17と一致して、パーフォリン陽性溶菌顆粒はSTED画像、大部分は共焦点画像で失われている重要な詳細に低F-アクチン密度の領域の上に配置見られている。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52502/52502fig1highres.jpg" /> 脂質二重層における3G8抗体の図1の密度。（A）は 、標準シリーズのMESFおよびMFIとの間の線形相関。（B）のタンパク質濃度及び試料タンパク質の希釈系列の濃度と線形相関当たり蛍光標識されたタンパク質のモノマーの数を示す脂質でコーティングされた済州に増加する濃度の関数としての単位面積LICAビーズ。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52502/52502fig2highres.jpg" /> 平面脂質二重層におけるNKシナプスの図2 STEDイメージング。初代NK細胞は、SLBを含むビオチン化、蛍光標識された抗CD16（赤）で刺激した固定、透過処理し、その後ファロイジン（青色）および抗Fアクチンで染色した（緑色）。個々のセルは、第1、通常の共焦点設定で画像化され、その後、STED設定した。共焦点とSTED画像はホイヘンスソフトウェアを使用してデコンボリューションされた。スケールバーは1μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52502/52502fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版については、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、免疫学的シナプスを形成するガラス支持脂質二重膜技術と、誘導放出枯渇(STED)顕微鏡の超解像イメージング技術の組み合わせについて説明します。このプロトコルの目標は、これら 2 つの手法を成功裏に実行するために必要な指示をユーザーに提供することです。

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

本手順の全体的な目的は、支持脂質二重層上にあるナチュラルキラー（NK）細胞の免疫シナプスの超解像画像を正常に撮影する方法を実証することです。これは、チャンバースライド内にNK細胞活性化受容体CD 16に対する抗体を含むガラス支持平面脂質二重層を構築することで達成されます。あらかじめ単離したNK細胞を、この抗体組み込み平面脂質二重層に添加し、続いてf actinおよびパフォリンで細胞を染色します。最終ステップは、STEAD顕微鏡を用いて得られたNK細胞シナプスのイメージングを行い、最終的に支持脂質二重層上のNKシナプスを可視化することです。STEADを用いることで、NK細胞シナプスをより詳細に観察でき、アクチン細胞骨格の超微細構造や、F-actin密度の低い領域に配置されたperforin陽性の溶細胞顆粒の視覚化が可能になります。したがって、この手法の主な利点は、ガラス支持平面脂質障壁が標的細胞の細胞膜や、その平面脂質障壁上のタンパク質を模倣できることです。これらは側方向に移動することができ、免疫シナプスの形成という非常に論理的な関連性をより適切に再現することが可能です。本手法は、免疫学分野における主要な疑問への回答に寄与し、市販の顕微鏡アプローチでは不可能な、詳細かつ制御された方法でのシナプス形成の可視化を研究者に可能にします。ポストドクターのPainting氏と大学院生のGrant氏が、ガラス支持平面脂質二重層を構築する手順を実演します。まず、ビーカー内で30%過酸化水素と硫酸を1:3の比率で混合し、ピラニア溶液を100 milliliters調製します。2枚の長方形のNo.1.5カバーガラスをこの溶液に20～30分間浸し、洗浄します。あらかじめ調製しておいた400 micromolar DOPC脂質のチューブ1本と、80 micromolar biotin PE脂質のチューブ1本を用意します。アルゴンで脱酸素化した新しいマイクロ遠心チューブに入れ、氷上でアルゴンタンクまで運搬します。DOPCとビオチンPEを1:1の比率で混合します。具体的な容量は実験上のニーズにより異なりますが、最低2 µLとする必要があります。各デオキシゲネイゼ混合チューブおよび個々の試薬チューブを密閉し、ラダーを冷蔵庫に戻します。洗浄後、カバーガラスを蒸留水で十分にすすいでください。カバーガラスを数分間室温で自然乾燥させた後、リポソーム混合液を1.5 µL分取し、チャンバースライドのレーンチャンバーの1つに1滴ずつ分注します。1レーンあたり2滴の使用が一般的ですが、必須ではありません。次に、素早く効率的に、乾燥したカバーガラスを液滴の上に載せます。この際、カバーガラスを載せた後に液滴同士が混ざり合わないよう、十分な間隔を空けて配置してください。さらに、液滴がチャンバー壁の端に触れることなく、円形で明確な形状を維持していることを確認してください。カバーとの間に水密シールが形成されるよう、各レーンの間と周囲をしっかりと押し付けます。マーカーペンを用いて、ドロップの位置にスリップおよびスライドの印を付けます。その後、100 µLの5% casing水溶液をチャンバーに通し、バイレイヤーをブロッキングします。フローチャンバー内に気泡が入っていないことを確認してください。次に、333 nanograms per milliliter の濃度のストレプトアビジンを各レーンに 100 microliters 注入します。室温で 10 ～ 15 分間インキュベートした後、1% human serum albumin を含む HEPES 緩衝生理食塩水を各レーンに 3 milliliters 流して洗浄します。過剰なストレプトアビジンを除去するため、暗所での20〜30分間のインキュベーション後、テキストプロトコルに従ってあらかじめ決定したタンパク質濃度のビオチン化蛍光標識抗CD 16を100 µL添加します。1%ヒト血清アルブミンを含むHEPES緩衝生理食塩水を各レーンに3 mL流して、再び洗浄します。次に、過剰なストレプトアビジンを結合させ、細胞へのストレプトアビジンの非特異的結合の可能性を排除するため、25 nM濃度のD-ビオチンを100 µLチャンバー内に流します。次に、ヒトNK細胞をカウントし、1%ヒト血清アルブミンを含むHBSSで500,000 cells/mLの濃度に再懸濁します。各レーンにつき、1%ヒト血清アルブミンを含むHBSS 3 mLを用いて、チャンバー内からD-ビオチンを洗浄します。細胞を目的の濃度に再懸濁した後、各レーンに100 µLずつ加えます。チャンバーを37 °C、5% carbon dioxideインキュベーターに30〜60分間置きます。このインキュベーション期間の後、室温で4% paraform aldehydeを用いて細胞を10〜20分間固定します。各レーンに3 mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を流して洗浄し、paraform aldehydeを除去します。次に、ブロッキングバッファーを400 µL加え、室温で30分間インキュベートします。続いて、希釈した蛍光標識Phalloidinおよび蛍光標識抗perforinモノクローナル抗体を各2 µL加え、f-actinおよびperforinを染色します。室温で1時間インキュベートした後、チャンバーに3 mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を流して洗浄します。これでイメージングの準備が完了しました。stead顕微鏡の必要なハードウェアモジュールをすべてオンにします。画像解析ソフトウェアを起動し、レゾナンススキャンおよびsteadモジュールの両方を有効にします。これらの選択を行った後、ソフトウェアが起動するまで3〜5分ほど待ちます。画面上部の設定（configuration）タブをクリックし、レーザー設定（laser config）を選択します。次に、白色光と592 nmの定常レーザーをオンにします。100倍対物レンズを選択し、励起レーザービームを592 nmの脱励起レーザーに合わせて調整します。レーザー構成モジュールを選択し、592 nmの枯渇レーザーをオフにして、660 nanometerの枯渇レーザーをオンにします。スライドをステージ上のレンズの上に配置します。白色光ランプと接眼レンズを使用して、区分けされた二分子層領域に結合している細胞に焦点を合わせます。次に、コンフィギュレーション（Configuration）タブのすぐ右にあるアクイジション（Acquisition）タブに戻ります。「Switch to white light」タブをクリックし、そのモジュールをオンにして、励起レーザーラインを適切な波長までドラッグします。目的の検出器を選択し、検出範囲を設定した後、左側の取得ツールバーにある「Sequential」ボタンをクリックして、左側ツールバーの下部にシーケンシャルスキャンダイアログを表示させます。これにより、ユーザーは異なる色ごとに異なる励起ビームを持つ複数のシーケンスを追加できます。フレーム間をクリックし、追加する各色の励起周波数検出器と検出範囲を設定してください。すべての設定が最適化されたら、「start」を押してデータ取得プロセスを開始します。ガラス支持平面脂質二重層上のNK細胞シナプスの3色STED画像では、赤色で示される抗CD16抗体が脂質二重層上に蓄積してF-アクチンの形成を誘発し、青色で示されるパフォリンが焦点面においてF-アクチンのメッシュを通り、極性化および浸透することが示されています。この複合的なアプローチを用いることで、ガラス支持脂質二重層内における蛍光標識抗CD16のマイクロクラスターを鮮明に観察することができ、これはNK細胞上のCD16のクラスター形成を直接的に反映しています。従来の共焦点画像と比較して、周囲の蛍光が低減されているため、STED画像ではCD16中央クラスターのリング構造をより容易に識別できます。さらに、アクチン細胞骨格の微細構造が著しく向上した解像度で観察されます。以前の観察結果と一致して、perin陽性の溶解顆粒はF actin密度の低い領域に位置していることが分かります。これは定常画像における重要な詳細であり、共焦点画像ではほとんど失われてしまいます。この手法に習熟すれば、適切に手順を進めることで、約4時間で完了させることが可能です。アルゴンで繰り返し酸素を置換すること、およびカバーガラスを速やかにサンプルの上に配置してケーシング溶液に浸すことでチャンバーを組み立てることにより、サンプルを脱酸素状態に維持することが重要です。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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免疫シナプスとKinapseの研究の形成のためのサポートされている平面二重層

この資料では、全内部反射蛍光（全反射）顕微鏡による平面脂質二重層をサポートしてガラス基板上にHIV-1エンベロープによって誘導されるウイルス学的シナプスの形成を可視化する方法について説明します。方法はまた、HIV-1エンベロープ誘発性ウイルス学的シナプス形成時に発生するシグナル伝達分子の活性化および再配布を検出する免疫​​蛍光染色と組み合わせることができます。...

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生細胞における受容体-リガンド相互作用を可視化するための格子ライトシート顕微鏡法

このビデオは、支持脂質二重膜(SLB)上のナチュラルキラー(NK)細胞における免疫学的シナプスの形成を視覚化する技術を示しています。SLBは、最初に蛍光色素でタグ付けされたNK細胞活性化受容体リガンドで標識され、続いてNK細胞とインキュベートされます。続いて、重合アクチンおよびパーフォリン陽性溶解顆粒について細胞を染色します。このアプローチにより、STED(Stimulated Emission...

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デュアルカラータイム·ゲーティッド誘導放出枯渇（STED）ナノスによる免疫シナプスの可視化

タンパク質官能基化平面ガラス支持脂質二重膜の調製、タンパク質内のタンパク質移動度の決定、およびタンパク質密度の測定がここに示されている。ノイズを低減した全反射顕微鏡を構築するためのロードマップが概説されており、これにより、高い時空間分解能で単一の二重層常在蛍光色素を視覚化できます。...

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プロトコルでは、平面脂質二重膜を用いたシナプス インターフェイスを形成する主なポリクローナル T 細胞の機能を研究する手法について説明します。主に由来するリンパ節、末梢血 T...

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ヒト免疫シナプスのイメージング

学ぶグラス支持平面脂質二重層とSTED顕微鏡を用いたナチュラルキラー細胞免疫シナプスの超解像イメージング手法。アクチン細胞骨格と穿孔素顆粒の詳細な可視化が可能になり、免疫応答の細胞レベル理解が進む。

グラスサポート平面脂質二重層上のナチュラルキラー細胞免疫シナプスの超解像イメージング

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