トランスフェクション、選択、およびAAVS1セーフハーバーへのGFP遺伝子とTALENを標的とする人間の人工多能性幹細胞のコロニーピッキング

この手順の全体的な目標は、GFPを発現する単離AAと1つのセーフハーバー、標的誘導性多能性幹細胞またはIPSCクローンを生成することです。これは、まず、AAVの1つの爪とA VS ONE C-A-G-E-G-F-Pドナープラスミドを核の愛情によって効率的にIPCに送達することによって達成されます。第2ステップでは、マウス胚フィーダー細胞上のpur mycinによって、A a vs oneの標的細胞が選択されます。

次に、A VS ONE ターゲットクローンを発現する個々のGFPを、マトリゲルコーティングされた96ウェルプレートにピッキングします。最終ステップでは、A A VS one G-F-P-I-P-S-CクローンをE 8培地および標準IPSC培養技術で増殖させます。最終的に、免疫蛍光顕微鏡法とフローサイトメトリーを使用して、AA VS One 標的ヒト IPSC クローンにおける GFP の均一で堅牢な発現を示します。

コロニーピッキングステップでは、顕微鏡下で特殊なコロニーピッキングツールを使用して標的クローンをマイクロで解剖するため、この方法を視覚的に実証することは非常に重要です。まず、IPSC培養物をPBSで1回ずつ洗浄します。次に、37°Cの穏やかな細胞解離試薬1ミリリットルを各ウェルに加え、細胞の50%以上が培養容器から解離したら、37°Cで約5分間細胞をインキュベー

P 1000ピペットを使用して、残っている細胞塊または付着した細胞を機械的に破壊します。次に、2ミリリットルのE 8培地を各ウェルに加え、10ミリリットルのピペットを使用して、培養物をさらに単一細胞懸濁液に分解します。次に、採取した細胞を15ミリリットルの円錐形のチューブにプールし、スピンダウンします。

再 カウントのために、最小限の量のE 8培地でペレットを懸濁します。次いで、トライアンブルー排除により培養物の生存率を確認した後、ならびにそれらの十分な解離により、300万個の細胞を2本の15ミリリットル円錐管のそれぞれに移し、遠心分離した細胞は、エレクトロポレーションシステムをヒト胚性幹細胞株H nineの細胞種特異的プログラムにセットした。次に、対照サンプルの1つのペレットに10マイクログラムの相同組換えドナーのみを加え、10マイクログラムの相同組換えドナープラスミドと実験サンプルの各Talonプラスミド5マイクログラムを追加します。

次に、100マイクロリットルの室温完全P 3初代細胞トランスフェクション溶液を各コントロールペレットおよび実験ペレットに添加し、細胞を再懸濁します。サンプルを個々のキュベットに移し、トランスフェクション直後にサンプルを食べました。各Qのvetに室温E 8媒体の500マイクロリットルを加え、次いでトランスフェクションされたIPSCのサンプルをDRを含む個々の10センチメートルの皿に滴下に移す マウス胚性線維芽細胞 コロニーを選ぶ前に、基底膜マトリックス溶液の50マイクロリットルを含む96ウェルプレートの井戸を共教え、その後、プレートを翌朝摂氏4度で一晩保存する。

プレートが室温に達したら、余分な溶液を吸引し、10マイクロモルのY 2 7 6 3 2を補充した100マイクロリットルのE8培地を各ウェルにロードします。次に、倒立顕微鏡を生物学的安全キャビネットに入れ、70%エタノールの光スプレーで滅菌します。次に、ガラス製の牧草地ピペットをブンゼンバーナーの上に置いて、70%エタノールで滅菌した後、先端に小さなフックが付いたコロニーピッキングツールを作成します。

フックをフードに入れて乾燥させ、IPSE培養物を顕微鏡ステージに置いてクローンを取り出します。低倍率で適切なコロニーを見つけ、コロニーピッキングツールを使用して追跡し、四分の一にします。次に、培養容器から四分の一のコロニーを静かに掻き取り、約30マイクロリットルに設定されたP 200ピペットを使用して、細胞を基底膜マトリックスに直接プレーティングする自由に浮遊するIPCを収集します。

それらが収穫されると、IPCはメッキから2〜4時間以内に取り付けられるはずです。最後に、摘み取ったコロニーを摂氏37度で一晩インキュベートし、翌朝、完全なEエイト培地で細胞をリフレッシュします。実験全体を通して、高品質のI PSCのみをトランスフェクションすることが重要です。

IPSC培養物は、ここに見られる細胞と分化した細胞が培養物の10%を超えないように、石畳のような形態を持つ主に異なるコロニーを含むべきであり、PAX GFPによるトランスフェクションは通常、その小さなサイズのために達成可能な最大効率を表すため、IPCのトランスフェクション能力は小さなPAX GFPベクターを使用して評価および最適化できます。A VS one C-A-G-E-G-F-P intelおよびトランスフェクションされたIPCの一過性発現は、トランスフェクション後48〜72時間でピークに達し、これはフローサイトメトリーによってトランスフェクションされた細胞のごく一部で確認することができます。トランスフェクション効率は大きく異なります。

A GFP陽性画分がわずか10%の実験でも、均一な蛍光を示す個々のクローンは、純粋なマイシン選択後のコロニーピッキングに十分な大きさであるべきです。さらに、1旦96にすると、拡大した標的IPSCクローンをウェルフォーマットし、GFPの安定かつ均一な発現を示すはずである。このビデオを見れば、核結合によってI PSCを効率的にトランスフェクションする方法と、AVを1つのセーフハーバーとして分離する方法を十分に理解できるはずです。

コロニーピッキングツールを用いたIPSEクローンの標的化。