Name: マスト細胞の分泌顆粒の調査。生からのエキソサイトーシスへ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 1 s
Description: 学ぶマスト細胞の分泌顆粒の発生とエキソサイトーシスを蛍光レポーター遺伝子を用いてリアルタイムで解析する手法。共焦点顕微鏡による形態計測で遺伝子機能を評価し、免疫応答の機構解明に貢献する。

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私たちは、NPY-mRFPとcDNAの贈り物のために博士U. Asheryに感謝。私たちは、博士に感謝。 MJ Kofron、L. Mittleman、M. Shaharbani、およびY. Zilberstein顕微鏡と画像解析との貴重な援助のために。また、この原稿の重要な読書のために博士ジョセフ·オルリーに感謝。この作品は、科学のためのイスラエルアカデミーによって設立されたイスラエル科学財団からの助成金によってサポートされていました（RS-Eに1139年から1112年。）。

RBL細胞培養メディアの作製<ol><li> （これは、約1％のPESTを行う）（これは、10％FBSを行う）ウシ胎児血清を56 mlの低グルコースのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を500mlを混合し、その後ペニシリンストレプトマイシン5.5mlのを追加する。 </li><li> 4℃で0.22μmの細孔サイズや店舗で500〜1,000ミリリットルボトル·トップ·掃除機用フィルターを使用してメディアをフィルタリングします。 </li></ol> RBL細胞の2.文化<ol><li>どちらのプレートまたはフラスコ中で37℃で5％CO 2の加湿雰囲気中で、RBL細胞を成長させる。 10cmプレート中で増殖されたRBL細胞を、10 mlの培地を補充し、約10 7細胞/プレートのコンフルエントな単層を形成すべきである。 </li><li>細胞層がコンフルエントに近づいたとき、より低い密度で培養物をreplate。 <ol><li>真空に接続され、無菌パスツールピペットを用いてプレート/フラスコから培養液を除去します。 </li><li>あらかじめ温め（37細胞単層をすすぎ全体単層（ボリューム培養プレート/フラスコの大きさに依存するカバー℃）0.25％トリプシン/ EDTA; 10cmプレート2）を加えた。これは細胞を剥離します。 </li><li>あるいは、リンと細胞単層を食塩水（PBS）をバッファリングすすぎ、PBSを除去し、予め温めた（37℃）トリプシン/ EDTAを加える。このステップは、より高速なセルを切り離します。 </li><li> 37°C（せいぜい10分）でインキュベーターでプレート/フラスコを置きます。 </li><li>彼らは切り離さしているかどうかをチェックするために光学顕微鏡で細胞を検査します。細胞は10分後に取り外すなかった場合は、優しくプレート/フラスコをタップします。 </li><li>細胞を懸濁するための培養プレート/フラスコに培地を加える（培地の体積は、少なくともトリプシン溶液の体積よりも2倍であるべきである）。 </li><li> 25℃で200gで3分間の遠心分離によって細胞をペレット化。 </li><li>培地中の細胞を懸濁します。 1：10によって細胞を希釈し、新しい培養皿に播種する。彼らはREACまで、48〜72時間細胞をインキュベートH約90％コンフルエンス。 </li><li>最大3ヶ月（30継代）と同じ手順（セクション2.2.1-2.2.8）を繰り返します。 </li></ol></li></ol>トランスメディアの調製。 <ol><li> K-パイプpHが7、Ca 2+のアセテートの1 mM溶液およびMg 2+アセテートの100 mM溶液の100 mM溶液を準備します。 </li><li> DMEM培地を用いて20 mMの中にK-パイプのpH7の100mM溶液を希釈し、2の最終濃度が10μMおよびMg 2+アセテートの100mM溶液の最終濃度までのCa 2+アセテートの1mM溶液を追加mMの。 </li><li>カリウムグルタミン酸を計量し、128 mMの最終濃度に溶液に添加、よく混合し、使用するまで4℃で維持。 -20℃で残りの解決方法（ すなわち 、K-パイプ、Ca 2+の酢酸塩、Mg 2+を酢酸塩）を保管してください。 </li></ol> RBL細胞の4トランスフェクション<ol><li>使用したプレート/フラスコから培地を除去真空に接続され、無菌パスツールピペット。 </li><li>全体単分子層をカバーする必要があらかじめ温め（37℃）、トリプシン/ EDTAで細胞単層をすすぐ。 37°C（せいぜい10分）でインキュベーターでプレート/フラスコを置きます。細胞は、光学顕微鏡を用いて剥離しているかどうかを確認してください。 </li><li>細胞を懸濁するための培養プレート/フラスコに培地を加える（培地の容積はトリプシン溶液の体積よりも少なくとも2より大きい以上であるべきである）。 </li><li>血球計数器を用いて細胞数を数えます。 </li><li> 25℃で200×gで3分間の遠心分離により1.5×10 7細胞をペレット化。上清を破棄し、トランスフェクション培地の280μlを添加する。 4ミリメートルのキュベットに反応ミックスを転送します。 </li><li> NPY-mRFPとプラスミド20μgのを追加し、いずれかコントロール空のプラスミドまたはテストプラスミド30μgの。反応ミックスの最終容量は300μlのである必要があります。 </li><li>すぐに氷上で10分間置きます。残留水とpからキュベットを拭き9ミリ、300 Vでエレクトロポレーションにroceed。 </li><li>エキソサイトーシスの測定のために、300μlの培地を含む24ウェル組織培養皿に直ちに細胞をreplate。各ウェルに反応ミックスの8μL（4×10 5細胞）を追加します。制御のための追加のウェルに4×10 5の非トランスフェクトされた細胞を追加します。すべてのトランスフェクションのためにそれぞれの治療のために、少なくとも二連のウェルを持ってするのに十分な井戸を準備します。 </li><li>タイムラプス顕微鏡検査のために、80μlの培地を含む8ウェルチャンバーホウケイ酸カバーガラスシステムですぐに細胞をreplate。各チャンバーに反応ミックスの1.5μL（7.5×10 4細胞）を追加します。 （カバーガラスの中央にチャンバーは画像に簡単である、カバーガラスの端にチャンバーを使用しないようにしてください）​​。 注：重要なことは、すべてのセルがトリガに応じていないと時折タイムラプス顕微鏡検査が原因8ウェルチャンバーborosiの焦点の喪失とドリフトに廃止されているlicateカバーガラスシステム。そのため、各トランスフェクションのために、各治療のために、少なくとも8室を用意。 </li><li> FcεRIを媒介活性化のための細胞を感作のために、メディア（少なくとも2時間のIgEで細胞を培養する）に、マウスのDNP特異的モノクローナルIgEの1μg/ mlのを追加します。 </li><li> 18〜24時間後の細胞は、プラスミドを発現することを確認するために、蛍光顕微鏡を使用しています。 mRFPと蛍光の励起および発光波長は、以下のとおりです。λEx584、およびλem607 nmの。 NPY-MRFPがSGSに対応して小胞構造に表示されます。関心のある第二の遺伝子は、蛍光タグに融合されている場合は、同じ細胞に両方のプラスミドの同時発現を確認するために蛍光顕微鏡を使用する。テストされた遺伝子は、GFPに融合される場合、GFP蛍光の励起および発光波長は、以下のとおりです。λEx488、およびλem507 nmの。 GFPタグ付けされたタンパク質は、NPY-mRFPとを表明同じ細胞で表示されます。 </li><li>エキソサイトーシスの測定のためのTを進めるOステップ5とタイムラプス顕微鏡検査のためには、ステップ6に進みます。 </li></ol> 5. NPY-mRFPとエキソサイトーシスを測定<ol><li>タイロード緩衝液の調製： <ol><li> 54のKCl、20のMgCl 2、2.74 M NaClおよびDDWさ8mmのNaH 2 PO 4の溶液を調製する。十分に混合し、4℃で保存する。このステップでは、20倍のタイロードバッファーの調製のためである。 </li><li> 20mMのHepesの溶液のpH 7、1.8のCaCl 2、1mg / mlのBSA、5.6 mMのグルコースとDDWでタイロード20Xの1から20までの希釈を準備し、よく混ぜる。このステップは、1×タイロードバッファーの調製のためである。 </li><li> -20℃で1×タイロードバッファとストアを分注し。繰り返し凍結融解は避けてください。 </li></ol></li><li> 24ウェルプレートから培地を除去し、タイロード緩衝液で3回洗浄する。対照ウェルに200μlのタイロード緩衝液を添加することによって刺激されていない細胞を準備します。 </li><li> 10μL/ウェルの20Xは、試薬[（ 例えば千/ mlのDNP-BSAまたはDNPをアクティブに濃縮準備-HSA（Ag）を、200μMのCa 2+イオノフォア（例えば A23187）、および20μMのCa 2+イオノフォアと1000nmの12-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセテート（TPA）]の組み合わせ。試薬はDMSOに格納されている場合、1％DMSOを含有するタイロード緩衝液中で20倍濃度に試薬を希釈する。 30分間37℃でインキュベートする。 </li><li> 、96ウェルプレートにも慎重にそれぞれの上清を削除し、氷上に置き、光から避ける。 （上清を細胞から放出されたキメラペプチドNPY-mRFPとが含まれている）。 </li><li>各ウェルに、0.5％トリトンX-100を含有する200μlのタイロード緩衝液を添加し、10分間37℃でインキュベートする。 （このステップは、細胞から放出されていなかったNPY-MRFPの残りが含まれている細胞溶解物の準備のために重要である）。細胞溶解物を収集し、96ウェルプレートに移し、氷上に置き、光から避ける。 </li><li> fluorescを用いて、細胞上清および細胞溶解物の蛍光を測定するレンスプレートリーダー、590-、20nmのバンド幅の励起フィルター及び635-、35nmの帯域幅発光フィルターを使用して。 </li><li>リリースNPY-MRFPの割合を計算します。 注：蛍光リーダー対策任意の蛍光単位（AFU）。 AFUの値は、マシンとその感度とトランスフェクション効率に依存します。 <ol><li>ブランクとしてトランスフェクトRBL細胞の自家蛍光を設定します。全蛍光（上清のAFU +対応する溶解物のAFU）に各上清のAFUを分割し、100を掛け。 </li></ol></li></ol>エキソサイトーシスの6タイムラプス顕微鏡<ol><li> 8ウェルチャンバーホウケイ酸カバーガラス系でトランスフェクションされた細胞/チャンバーの種子7.5×10 4。 18~24時間後、チャンバーから培地を除去し、タイロード緩衝液で3回洗浄</li><li>各チャンバーにタイロードバッファーの72を添加する。 10倍の濃度にタイロードバッファ内の活性化試薬を希釈する。 </li> &lt;LI&gt;加熱室（37℃）とCO 2コントローラ（4.8％）、および40Xまたは63X目的を搭載した共焦点蛍光顕微鏡を使用してください。顕微鏡システムをオンにする：水銀ランプ、コンピュータ、およびレーザーを。加熱されたチャンバは、実験を開始する前に、右の温度であることを確認します。 </li><li>加熱されたチャンバー内に室を置き、チャンバーが正しく、安定したインストールされていることを確認してください。 </li><li>関連するフォアに係る蛍光ライトをオンにして、トランスフェクトされた細胞を可視化する。目的の細胞は、漂白及び細胞毒性を最小限にするために、フィールドに入ると蛍光をオフにします。これは、このフィールドは約2-3トランスフェクトされた細胞が含まれることが重要である。トランスフェクトされた細胞は、よく伸びるが、互いに接触しないべきである。 </li><li>ノイズや過飽和ならびに毒性を最小限にする（顕微鏡に応じて）レーザーパワーを調整し、ゲインを設定し、信号対雑音比を変更するためのオフセット。で高速スキャンまたはデルは、レーザー博覧会（平均値2）の持続時間を最小にする。 </li><li>最大ピンホールのサイズを調整し、これはレーザパワーを減少可能になり、長時間の焦点画像を維持する。所望であれば、信号対雑音比に最良の信号を与え、二次元共焦点光学スライスの順次走査を獲得1エアリー単位（AU）にピンホールのサイズを調整し、3次元画像を再構成するためにZスタックのパラメータを設定する≤0.7程度の光学スライスを持つZ -axes。 </li><li> 15分に15〜30秒にそれぞれ取得及び総取得の期間の間隔の時間を設定し、画像の取得を開始。買収の5分後時系列を一時停止する。 10倍のトリガーの8μlを添加し、すぐに取得を継続する。 </li><li> 、写真を保存するデコンボリューションソフトウェアを使用してデコンボリューションを行い、三次元画像およびIMARISソフトウェアを使用してムービーにスタックを再構成する。 </li></ol><ol><li> IMARISソフトウェアに共焦点蛍光顕微鏡によって得られたデコンボリューションされた時系列画像からデータをインポートする。このソフトウェアは、40以上の顕微鏡のファイルを読み込みます。ソフトウェアは、ファイルを読むことができない場合。 TIFファイルとインポートにファイルを変換する。 </li><li>オープンデータセットプレス編集の最後に時間点を追加するには - &gt;時間ポイントを追加し、新しいデータ·セットをインポートします。 </li><li>表面ウィザードオプションを使用してmRFPとチャネルの表面を作成します。デフォルトのアルゴリズムを選択してください。 NPY-MRFPのチャンネルを選択してください。ノイズを低減する平滑化オプションをマークします。細部の損失を回避するために0.05μmのエリア詳細レベルを下げる。 </li><li>強度閾値を設定します。新しいグレーの表面が表示されます。 「設定」に移動し、「中心点」から「面」からスタイルを切り替えます。 </li><li> 、選択したオブジェクトのプロパティの[統計]タブに移動し、詳細タブと特定の値SUCを選択蛍光強度などの時間、音量等</li><li>データを確認し、値が画像と互換性があることを確認します。例えば、二つ以上の隣接する顆粒は、大きな1つの顆粒として測定されることがあります。平均顆粒サイズを定量化するための顆粒の実際の数にマージされた顆粒の大きさに分割。 </li><li> Excelファイルに所望のデータセットをエクスポートし、データを分析する。 </li></ol> F

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著者には金銭的な利益相反はありません。

我々は、エキソサイトーシスのためのレポーター遺伝子を用いて、生細胞中でのSGの時間経過の三次元撮像によりMCのエキソサイトーシス及び4の（x、y、zは、t）は、次元定量化の定量化を組み合わせた、革新的な戦略を記載している。この技術は、それらの成熟、エキソサイトーシスの能力と脱顆粒の買収を通じて、早けれゴルジからの出口として開始のSGの監視などのMC機能への影響のためのタンパク質の家族のスクリーニングを可能にします。一緒のSGの形態計測と運動の特徴付けとエキソサイトーシスの測定値の組み合わせは、試験したタンパク質は、MC機能を媒介するメカニズムへの洞察を提供しています。従って、この方法論を使用して、標的遺伝子の遺伝子操作は、MCのSGストアとは、その貨物を放出することによって、新しい分子機構を明らかにすることができる。特に、NPYは、MCF-7細胞、細胞株由来のfrのような他の分泌細胞におけるエキソサイトーシスのためのレポーターとして機能することができるOM人間乳腺腺癌31、クロム親和細胞34と膵β細胞35。 遺伝子操...

マスト細胞（MC）は、最高の、関節炎、喘息、好酸球性食道炎、慢性皮膚炎、およびアナフィラキシーショック1,2-ならびに冠動脈疾患3,5を含む他の病態などのアレルギー及び炎症反応への関与のために知られている免疫細胞であり癌3,4。また、MCは、同種移植片寛容5,6を誘導例えば、細菌および寄生虫に対する宿主防御および免疫応答の抑制の両方によって、先天性および適応免疫において重要な役割を果たしている。 MCは、CD34 + / CD117 +多能性前駆細胞から7を開発し 、骨髄に由来する。コミット骨髄のMC前駆細胞は血流中に放出し、結合組織と上皮表面8内の主にローカライズする末梢組織中に移行されます。成熟と最終分化は、最終的には影響Oの下で達成されている周囲の環境8,9内のFサイトカイン。 MCがその遭遇イムノグロブリンE（IgE）の生成をもたらした抗体を入力アレルゲン（抗原、Ag）などによって活性化することができる。同じAgに対する再曝露の際のIgE細胞結合の架橋に続いてMCのFcεRIの受容体、このようなIgEの結合、FcεRIの凝集および細胞の脱顆粒で最高潮に達しシグナル伝達カスケードの開始の結果は[10,11に総説] 。 MCはまた、活性化された独立してIgEの、神経ペプチド5,12、13、毒素、細菌抗原およびウイルス抗原14,15によって、正に荷電したペプチドの数は、集合的に、基本的な分泌、免疫細胞およびサイトカイン5,13,12,16と称される、17。 MCがさらに炎症反応を増幅する独自のリリースメディエーターの多くによって活性化される。 MCが免疫を含ま分泌顆粒（SGS）が充てんされていそのようなキマーゼおよびトリプターゼ、血管内皮増殖因子およびいくつかのサイトカインおよびケモカイン8,9などのヒスタミン及び（げっ歯類における）セロトニン血管作用性アミン、プロテオグリカン、プロテアーゼ、を含む調節メディエーター。これらのメディエーターは、「行く準備ができて」いるとMCSが適切な刺激によって活性化されると、これらのメディエーターは、分18,19秒のうちに規制エキソサイトーシス（脱顆粒）によって細胞から放出される。この最初のイベントは、アラキドン酸代謝物、複数のサイトカインおよびケモカイン20,21,22を含む生物学的に強力な物質の大きな配列のデノボ合成および放出が続く。新たに合成された製品のリリースは、独立して、SGの放出が原因で発生します。まとめると、これらのメディエーターは、初期および後期相炎症やアレルギー反応を開始する。したがって、MCの活性化と脱顆粒を占めるのメカニズムを理解することは、理論と臨床IMPの両方があるortance。 遺伝的にプライマリおよび培養されたのMCを操作する難しさが不十分な解決のままのMC脱顆粒のメカニズムを解明しようとする試みを、妨げている。我々は、目的の遺伝子と粘膜マスト細胞株、ラット好塩基球性白血病（RBL）-2H3（本明細書でRBLと呼ばれる）、または骨髄由来のMC（BMMCに）30とを共トランスフェクトすることにより、レポーターベースのアッセイを開発し、この問題を克服するために、及びニューロペプチドY（NPY）は、SGのレポーターとして、単量体のRFP（mRFPと）に融合した。 NPYは、以前に、他のシステムにおける内因性SGマーカーの挙動を再現することが示された。 mRFPと蛍光は、pH非感受性であるため、また、NPY-mRFPとの表現は、酸性のSGの可視化を可能にするだけでなく、定量的な96ウェルプレートを用いて、エキソサイトーシスの評価および蛍光プレートリーダー。我々は、NPY-mRFPとはRBL細胞およびBMMCを酸性のSGに送達されることが示されており、細胞から放出される内因性のSG貨物（ すなわち 、βヘキソサミニおよびセロトニン）30、32と並んで、規制の方法で。このプロトコルは、彼らの表現型およびRBL細胞32内のSGの特性や脱顆粒上の機能への影響のために、目的の遺伝子をスクリーニングすることができ、高分解能イメージングベースの方法論を提供しています。具体的には、このプロトコルは、リアルタイムMCのSGのトラッキングとそのエリアまたはボリュームのサイズ、その数、組立体の動力学、細胞骨格に沿ったそれらの動きと異なる条件下で、原形質膜との最終的な融合の定量化を可能にする。例えば、DNP特異的IgEで細胞を感作し、異なる摂動の下で多価のAg（DNP共役血清アルブミン）を用いて細胞を誘発する（ すなわち 、重量または変異遺伝子の過剰発現は、目的の遺伝子のノックダウン、または薬理学的操作）と対照細胞と比較する。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6046-500ML</td><td>ウォーム 37 °C;Cウォーターバス使用前</td></tr><tr><td>胎児ウシ血清</td><td>GEヘルスケアライフサイエンス</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr>ペ<tr><td>ニシリン-ストレプトマイシン</td><td>ライフサイエンス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>技術セルロースアセテート膜、細孔サイズ0.22&nbsp;&mu;m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430769-1EA</td><td></td></tr><tr><td>コーニング 組織培養処理済み培養皿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA Solution (TE)</td><td>Life technologies</td><td>R001100</td><td>37°Cで温まる;Cウォーターバス使用前の</td></tr><tr><td>パイプジカリウム塩</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>108321-27-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>酢酸カルシウム水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114460-21-8</td><td></td></tr><tr><td>酢酸マグネシウム四水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン酸カリウム塩一水和物(グルタミン酸カリウム)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>4 mmエレクトロポレーションキュベット</td><td>セルプロジェクト</td><td>EP-104</td><td></td></tr><tr><td>パルスコントローラー付き遺伝子パルサー &CAPACITANCE</td><td>Bio rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>チャンバーカバーガラス</td><td>Thermo scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>24 well, flat bottom</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3524</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 well plates</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3367 or CLS390</td><td></td></tr><tr><td>96 well plate fluorescence reader- Infinite 200</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcium ionophore A23187</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7522</td><td>直射日光を避け</td></tr>て <tr><td>12-O-テトラデカノイル-13-アセテート (TPA)</td><td>Calbiochem</td><td>P3766</td><td></td></tr><tr><td>抗 DNP モノクローナル IgE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8406&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DNP-BSA/ DNP-HAS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6661</td><td>直射日光を避け</td></tr>て <tr><td>Triton-x-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>共焦点蛍光顕微鏡:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1 inverted</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris ソフトウェア</td><td>BITLANE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft exel または Prism またはその他の分析ソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>その他の試薬:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>MERK</td><td>5833</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>MERK</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム&nbsp;</td><td>MERK</td><td>2382</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン&nbsp;</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>BDH研究所</td><td>284515V</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム&nbsp;</td><td>MERK</td><td>5345</td><td></td></tr><tr><td>滅菌水</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マスト細胞の分泌顆粒の調査。生からのエキソサイトーシスへ

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

マスト細胞（MC）は、予め形成され、新たに合成され、アレルギー性​​炎症性および免疫メディエーターを放出することによって、それらの生理学的および病理学的機能を達成する免疫系の分泌細胞である。 MCは「メディエーターは、アレルギーおよび免疫応答で最高潮に達する複数の組織や臓器に影響を与える。 MCメディエーターの合成、貯蔵と放出は、高度に規制されています。予め形成されたメディエーターは、原形質膜と融合し、調節性エキソサイトーシスによってそれらの内容物を放出する細胞の分泌顆粒（SG）にパ​​ックされている。我々は、のSGに対して標的化された内因性SGメディエーターと一緒に調整された様式で放出されるレポーター遺伝子と目的遺伝子の同時発現に基づくプロトコルを提示する。プロトコルは、4次元の共焦点がMCのSGの解析高分解能を可能にし、トリガエキソサイトーシスに生物発生から自分のタイムラインを監視する。したがって、相互の遺伝子をスクリーニングするためのこのプロトコルを使用して彼らの表現型および機能的な影響のためのESTは、MCのSGの生合成とエキソサイトーシスを支配する分子メカニズムを解読すると、関係規制当局を特定することができます。これにより、健康と病気におけるMCの機能を占める細胞メカニズムへのさらなる洞察が提供されるべきである。

そのためMCの低いトランスフェクション効率のため、遺伝子操作は、内因性のSGメディエーターで測定した平均分泌の読み出しに影響を残すことはほとんどありません。それにもかかわらず、レポーター遺伝子のNPY-mRFPと、同じ細胞において同時トランスフェクトされたプラスミドの完全な同時発現を確立することにより、NPY-mRFPとのモニタリングは、排他的に、目的の遺伝子を発現する細胞集団を監視することになる。したがって、従来の方法に比べて、このアッセイの利点は、選択的に遺伝子操作された細胞（ 図1）を監視する能力である。 実際に、このアッセイを用いて、我々は、可溶性NSF [N-エチルマレイミド感受性融合】付着タンパク質受容体（SNARE）タンパク質とのRab GTPアーゼファミリーの44のメンバーを含む小胞輸送を調節する遺伝子をスクリーニングしている。我々はSGsize、数字、カーゴ組成物およびエキソサイトー23を調節する遺伝子を同定した。 Weは、30のRabを特定し、その変...

本プロトコルの目的は、マスト細胞の分泌の機能的ゲノム解析を可能にする方法を開発することであった。プロトコルは、目的の遺伝子とcotrasfected蛍光レポーター遺伝子の放出を定量的に評価し、実時間に基づいて分泌顆粒の形態の分析。

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

本手順の目的は、肥満細胞の分泌顆粒の形成および放出を調節するメカニズムを研究することです。まず、放出エンドサイトーシス用のレポーター遺伝子と目的遺伝子を肥満細胞に共導入（共転写）します。次に、細胞を刺激し、放出エンドサイトーシス中のレポーター遺伝子の蛍光信号をモニタリングすることで、目的遺伝子が放出エンドサイトーシスに及ぼす影響を評価します。次に、分泌顆粒に局在するレポーター遺伝子の共焦点イメージングにより、標的遺伝子がマスト細胞の分泌顆粒の生成および発達に及ぼす影響を評価します。最終ステップとして、分泌顆粒の形態計測解析を行います。最終的に、レポーター遺伝子を用いたマスト細胞分泌顆粒の蛍光ラベル化により、マスト細胞および分泌顆粒の発達、ならびにそのエキソサイトーシスの変化を明らかにします。内因性メディエーター、β-ヘキソナイド、またはヒスタミンの放出を測定するなどの既存の手法に対する本技術の主な利点は、目的遺伝子の野生型変異体またはshRNAと、エキソサイトーシスのレポーターを共発現させる点にあります。この共発現により、遺伝子操作を施した細胞からの分泌のみをモニターすることが可能となり、マスト細胞の低トランスフェクション能に起因し、結果の解釈を困難にする内因性メディエーター測定時の高いS/N比（信号対雑音比）の問題を克服できます。本手法は、カルゴの選択、顆粒のパッキング、およびエキソサイトーシス能を含む、分泌顆粒の生成過程を制御する分子メカニズムの特定など、マスト細胞の細胞生物学分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法は、キナーゼ、ホスファターゼ、およびその他のタンパク質ファミリーの関与を評価することにより、細胞の大量調節性エキソサイトーシスのプロセスを制御する分子メカニズムの特定にも役立ちます。まず、トランスフェクションを行うために、テキストプロトコルに従ってラット基底性白血病細胞と培地を準備します。最初に、真空接続された滅菌済みパスチャーピペットを使用して、プレートから培地を除去します。細胞単層を、単層全体を覆う量で予熱したtrypsinで洗浄します。プレートを37 °Cのインキュベーターに10分以内で置きます。その後、光学顕微鏡を用いて細胞が剥離したかを確認します。細胞を剥離させた後、トリプシン溶液の2倍以上の体積の培地を培養プレートに加え、細胞を懸濁させます。ヘモサイトメーターを用いて細胞数をカウントした後、200 G、25 °Cで3分間遠心分離し、1,500万個の細胞をペレット化します。上清を除去し、280 µLのトランスフェクション用培地を加えます。次に、反応混合物を4 mmのキュベットに移します。ニューロペプチドY-M-R-F-P（短縮名 N-P-Y-M-R-F-Pとしても知られる）を含む20 µgのプラスミドと、30 µgのコントロール用空プラスミドまたは試験用プラスミドを添加します。反応混合物の最終容量は300 µLにする必要があります。10分間氷上に置いた後、ベッセルに残った水分を拭き取ります。次に、300 V、9 msの条件でエレクトロポレーションを行います。エキソサイトーシスの測定を行う場合は、300 µLの培地を含む24ウェル組織培養プレートに直ちに細胞を再懸濁させてください。各ウェルに反応混合物を8 µLずつ加えます。次に、コントロールとして、未トランスフェクション細胞を別のウェルに加えます。各処理につき2連（デュプリケート）となるよう十分な数のウェルを用意してください。タイムラプス顕微鏡観察を行うトランスフェクションについては、80 µLの培地を含む8ウェルチャンバーのホウケイ酸ガラスカバーガラスシステムに、直ちに細胞を再播種してください。各チャンバーに反応混合物を1.5 µL加え、FcεRIを介した活性化に対する細胞の感作を行います。培地に1 µg/mLのマウスDNP特異的モノクローナルIgEを添加します。細胞をIgEとともに少なくとも2時間インキュベートします。18～24時間後、蛍光顕微鏡を用いて、細胞がプラスミドを発現していることを確認します。MRFPの励起波長は584 nanometersで、蛍光波長は607 nanometersです。N-P-Y-M-R-F-Pは、分泌顆粒に相当する小胞構造内に現れるはずです。N-P-Y-M-R-F-Pのエキソサイトーシスを測定するため、培養液を除去します。24ウェルプレートから除去し、Tyro緩衝液で3回洗浄します。コントロールウェルに200 µLのTyro緩衝液を添加し、非刺激細胞を準備します。次に、活性化試薬と希釈したtyro bufferを加え、37 °Cで30分間インキュベートします。各ウェルのS上清を、96ウェルプレートに慎重に移します。プレートを氷上に置き、遮光して保存してください。S上清には、細胞から放出されたキメラペプチドN-P-Y-M-R-F-Pが含まれています。次に、0.5% Triton X 100を含むtyroバッファーを各ウェルに200 µL加え、37 °Cで10分間インキュベートします。このステップは、細胞から放出されずに残っているN-P-Y-M-R-F-Pを含む細胞溶解液を調製するために重要です。細胞溶解物を回収し、氷上に置く前に96ウェルプレートに転送します。遮光条件下で、励起フィルター（590 nm、帯域幅 20 nm）および蛍光フィルター（635 nm、帯域幅 35 nm）を備えた蛍光プレートリーダーを用い、細胞上清および細胞溶解物の蛍光を測定します。8チャンバーのBOシリケートカバーガラスシステムに、トランスフェクションした細胞を1.5 µL播種します。細胞を37 °Cのインキュベーターで18から24時間インキュベートします。チャンバーから培養液を除去し、tyroidバッファーで3回洗浄します。その後、各チャンバーに72 µLのtyroidバッファーを加えます。加熱チャンバー、二酸化炭素コントローラー、および40倍または63倍の対物レンズを備えた共焦点蛍光顕微鏡を使用します。水銀灯、コンピューター、レーザーを含む顕微鏡システムをオンにします。加熱チャンバーが適切な温度に設定されていることを確認してください。実験を開始する前に、8ウェルチャンバー付きホウケイ酸カバーガラスシステムを加熱チャンバー内に設置し、チャンバーが正しく取り付けられ、安定していることを確認します。適切な手順に従って蛍光灯を点灯させ、トランスフェクションされた細胞を観察します。目的の細胞が視野に入ったら、蛍光灯を消灯してください。退色と細胞毒性を最小限に抑えるため、この視野にはトランスフェクションされた細胞が2～3個含まれ、細胞同士が接触せず十分に分散している状態が適切です。本ケースでは、レポーター遺伝子であるN-P-Y-M-R-F-Pと、GFPタグ付きの構成的活性型RAB5変異体を細胞に共導入します。ノイズ、過飽和、および毒性を最小限に抑えるようにレーザー出力を調整し、ゲインとオフセットを設定してSN比を調整してください。レーザー照射時間を短縮するため、高速でスキャンを行います。次に、Zスタックを用いて画像を3次元で再構成するためのパラメータを設定します。最高の信号対雑音比を得るためにピンホール径を1 area unitに調整し、Z軸方向に0.7 µm以下の光学切片として、2次元共焦点光学切片を連続的にスキャンして取得します。続いて、各取得間の時間間隔を30秒に、総取得時間を15分に設定し、5分間の待機時間の後に画像取得を開始します。タイムシリーズを一時停止し、10xトリガーを8 µL加え、すぐに再開します。最後に、画像を保存します。デコンボリューションソフトウェアを用いてデコンボリューションを行い、スタックを3次元画像および動画に再構成して、画像解析を行います。共焦点蛍光顕微鏡により得られたデコンボリューション処理済みの時系列画像を、MRSなどの科学画像解析ソフトウェアにインポートします。このソフトウェアは40種類以上の顕微鏡ファイル形式に対応しています。開いたデータセットの末尾にタイムポイントを追加するには、[edit]から[add time points]を選択し、新しいデータセットをインポートしてください。コントラストと色調を調整し、最適な画像表示にします。ダウンロードしたファイルを使用して、サーフェスウィザードオプションを用いてMRFPチャネルのサーフェスを作成します。デフォルトのアルゴリズムを選択し、チャンネルN-P-Y-M-R-F-Pでノイズを低減するためにスムージングオプションにチェックを入れます。微小な詳細情報の消失を防ぐため、エリア詳細レベルを0.05から0.1 µmの間に設定してください。次に、強度閾値を設定します。新しいグレーの面が表示されます。次に、設定に移動し、スタイルを「中心点」から「面」に切り替えます。選択したオブジェクトのプロパティにある統計タブに移動してください。次に、「詳細（detailed）」タブと、蛍光、強度、または体積などの特定の値を選択します。データを確認し、値が画像と一致していることを確認してください。例えば、平均粒径を定量化する場合、2つ以上の隣接する顆粒が1つの大きな顆粒として計測される可能性があります。マーチ顆粒のサイズを実際の顆粒数で除します。最終ステップとして、目的のデータセットをExcelファイルにエクスポートし、データを解析します。ここでは、構成的に活性化されたRAB5の発現によって形成されたマスト細胞の巨大分泌顆粒の代表的なタイムラプス画像と、エキソサイトーシスの速度論、および単一の分泌顆粒の分解過程を示しています。刺激後、マスト細胞のエキソサイトーシスが行われる際、分泌顆粒は細胞膜に向かって移動し、融合します。顆粒は、緑色で示されている構成的に活性化したRAB5によって被覆されています。本実験でマゼンタ色で示されている分泌貨物 N-P-Y-M-R-F-P は、その後、細胞から細胞外空間へと放出されます。緑色で示される RAB5 の構成的活性型変異体によって融合した顆粒が、本実験でマゼンタ色に色付けされた貨物 N-P-Y-M-R-F-P を細胞内から細胞外空間へと放出します。エキソサイトーシス中のN-P-Y-M-R-F-Pの放出により、N-P-Y-M-R-F-Pの蛍光強度が劇的に増加し、N-P-Y-M-R-F-Pを含む分泌顆粒が収縮した後、消失します。カルシウムイオン担体で細胞を刺激した後、分泌顆粒は異なる時点でエキソサイトーシスを起こしており、分泌顆粒の蛍光強度が示されています。一方で、ある分泌顆粒は形質膜と融合せず、その蛍光強度は一定に維持されました。このビデオを視聴することで、分泌顆粒に導入され、刺激された細胞から放出される蛍光遺伝子レポーターを用いて、マスト細胞の分泌顆粒の発達とエキソサイトーシスをモニタリングする方法を十分に理解することができます。内在性メディエーターとともに、レポーター遺伝子とテスター遺伝子を用いて細胞を共導入し、観察することで、マスト細胞の分泌顆粒の発達およびエキソサイトーシスの根底にあるメカニズムを特定することが可能です。目的の遺伝子を共導入した細胞の分泌顆粒の形態計測分析を行い、コントロール細胞と比較することで、マスト細胞の分泌顆粒の発達におけるテスター遺伝子の役割を評価できます。さらに、レポーター遺伝子の放出をモニタリングすることで、制御されたエキソサイトーシスにおける解析対象遺伝子の役割を特定することができます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオでは、肥満細胞の脱顆粒活性を測定するための比色分析を実演しています。肥満細胞によって放出された酵素は、基質を加水分解し、着色された製品を生成します。肥満細胞の脱顆粒活性は、細胞外への酵素の放出率を細胞内の総酵素含有量で正規化して測定しました。...

標的化学物質の効果を研究するための肥満細胞脱顆粒アッセイ

このビデオは、成体マウスの腹腔から成熟結合組織型肥満細胞を単離するための腹膜洗浄法を示しています。初代免疫細胞の混合物を腹腔から単離すると、適切な培養条件下で肥満細胞の選択的増殖が行われます。...

マウス腹腔から初代肥満細胞を単離する技術

このビデオは、カルシウムイオノフォアを含む活性化試薬によって誘発される肥満細胞のエキソサイトーシスを実演し、蛍光レポータータンパク質NPY-mRFPを含む分泌顆粒の放出を開始することを示しています。続いて、放出されたNPY-mRFPを蛍光プレートリーダーを用いて測定することにより、エキソサイトーシスを定量的に評価します。...

ニューロペプチドY単量体赤色蛍光タンパク質放出による肥満細胞エキソサイトーシスの測定

このビデオは、肥満細胞のエキソサイトーシスを視覚化する手法を示しています。細胞は、蛍光レポーターであるFITC-デキストランとインキュベートされ、分泌顆粒(SG)内の細胞に取り込まれ、酸性のpHによって蛍光が消光されます。顆粒のエキソサイトーシスを刺激すると、培地の高pHにより、融合したSGs内にレポーター蛍光が誘導され、蛍光顕微鏡で可視化されます。...

肥満細胞の分泌顆粒のエキソサイトーシスを可視化するIn Vitro技術

マスト細胞の脱顆粒、アレルギー性​​メディエーターの放出は、アレルギー、喘息、および寄生虫防御に重要です。ここでは、脱顆粒で薬や毒物の影響を評価するための技術1を実証、方法論は、最近抗菌剤トリクロサン2の強力な阻害効果を発揮するために利用。...

RBL-2H3マスト細胞脱顆粒に対する化学的影響を評価するために、マイクロプレートアッセイ：有機溶剤を使用せずに、トリクロサンの影響

浸透圧ストレスは、エキソサイトーシスとこの処理中に解放の神経伝達物質の量に影響します。透過型電子顕微鏡と共に電気化学的方法を組み合わせることを使用エキソサイトーシス活動、小胞素量サイズ、および神経伝達物質解放の量に細胞外の浸透圧の影響を検討することができる方法を紹介します。中に分泌します。...

浸透圧ストレスの分泌小胞、分泌に及ぼす影響を監視

ここでは、分離し、マウスの腹腔肥胖細胞を養うプロトコルを提案します。2 つのプロトコルの機能特性評価についても述べる: リリースされた β-ヘキソアミダーゼの比色定量に基づく細胞内 Ca2...

腹膜由来マスト細胞とその機能特性と Ca2 +の単離-イメージングと脱顆粒の試金

ここで規制エキソサイトーシスの生きているセルイメージ投射のための方法を詳しく説明します。このメソッドは、記者として FITC...

規制エキソサイトーシスの記者として FITC デキストランをイメージング

微小パターン化細胞上のリソソームエキサイトーシスのライブイメージングは、このプロセスの空間的定量化を可能にする。マイクロパターンを用いたモルフォロジーの正規化は、細胞プロセスの空間分布に関する一般的なルールを明らかにする優れたツールです。...

微小パターン化細胞における細胞興奮性の時空間的パラメータの定量

CD19特異的キメラ抗原受容体（CAR）を発現するT細胞は、私たちのファースト·イン·ヒトの遺伝子治療の臨床試験におけるB細胞悪性腫瘍の治験治療として注入される。我々は、使用して、T細胞の遺伝子改変を記述...

の臨床応用<em&gt;眠れる森の美女</em遺伝的に末梢及び臍帯血由来のT細胞を変更する&gt;と人工抗原提示細胞

学ぶマスト細胞の分泌顆粒の発生とエキソサイトーシスを蛍光レポーター遺伝子を用いてリアルタイムで解析する手法。共焦点顕微鏡による形態計測で遺伝子機能を評価し、免疫応答の機構解明に貢献する。

マスト細胞の分泌顆粒の調査。生からのエキソサイトーシスへ

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