Name: イメージングローカルCA 2+培養哺乳動物細胞内シグナル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 学ぶ局所的なIP3媒介カルシウムシグナルの蛍光顕微鏡によるイメージングと自動解析アルゴリズムを用いた検出法。この手法は神経科学および細胞生物学研究においてカルシウム動態を可視化し、疾患モデル解析に応用可能です。

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この作業は、国立衛生研究所の助成金GM 100201からI.F.S.へ、GM 048071とGM 065830からI.P.への支援を受けました。

私たちは、ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞におけるローカルのCa 2+イベントを画像化するための詳細な手順を提示する。これらの手順は、多くの細胞型8-10画像内Ca 2+シグナルに適合させることができる。 細胞の調製<ol><li>培養細胞は、その供給者のウェブサイトに掲載されている指示に従って撮像される。 </li><li>画像化の前の数日間は、収穫細胞を1mlの0.25％トリプシン/ EDTA（2-3分）を用いて組織培養フラスコ中で増殖させた。剥離後、トリプシンを不活性化するために培養培地の等量を加える。 </li><li>皿あたり3-7×10 4細胞の密度でガラスボトムイメージング皿に血球計および種子細胞を用いて細胞カウントを行う。彼らは60％コンフルエンス（2-3日）に達するときイメージング実験のためのセルを選択します。 </li></ol>ソリューションおよび試薬の調製<ol><li>バッファリングされたCa 2+含有HEPESを準備（ミリモル）からなる塩溶液（Ca 2+の-HBSS）：135のNaCl、5.4のKCl、2のCaCl 2、1のMgCl 2、10 HEPES、および10グルコース。でpH = 7.4 NaOHで室温（RT）にて。 4℃でのグルコースや店舗の添加なしのCa 2+ -HBSSを準備します。使用直前に液にグルコースを追加します。 </li><li>蛍光のCa 2+指示薬カル-520（1 mm）で膜透過性のフォームを可溶化、CI-IP 3（200μM）、およびEGTA 20％のプルロニックF-127を含むジメチルスルホキシド（100 mM）を（DMSO）。 -20℃で、湿気や遮光エッペンドルフチュー​​ブとストアにこれらの試薬を分注し。 </li></ol> 3.読み込んで細胞膜透過性、カル- 520 CI-IP 3およびEGTA <ol><li>のCa 2+ -HBSSに、それぞれ、5および1μMの最終濃度になるように膜透過性カル-520及びCI-IP 3のストック溶液を希釈することにより、「ローディングバッファー」を準備します。 </li><li>吸引したCultureメディアとは、Ca 2+ -HBSS 3回メディアを交換することによって、細胞をリンス。 </li><li>のCa 2+ -HBSSを取り外して、暗闇の中で、室温で60分間ローディングバッファーで細胞を培養する。 </li><li>ローディングバッファーを除去し、Ca 2+の-HBSS 3回メディアを交換することによって、細胞をリンス。 <ol><li>必要であれば、この段階で、その後負荷のCa 2+ -HBSSで5μMの最終濃度に原液を希釈することによってEGTA / AMを持つ細胞とは、暗闇の中で、室温で30〜60分間細胞をインキュベート。このインキュベーションの後、3.5のステップに進む前に、Ca 2+の-HBSSで細胞を3回すすいでください。 </li></ol></li><li>ロードされた試薬の脱エステル化を可能にするために30分間のCa 2+ -HBSSで細胞を培養する。 </li><li>イメージングの直前に、最終インキュベーション中に風呂に漏れた可能性のある染料を除去するために、「新鮮な」のCa 2+ -HBSSでのCa 2+ -HBSSを交換してください。 </li></ol> 4.のCa 2+ </sup&gt;画像取得<ol><li> 100X APO TIRF目標（NA 1.49）上に浸漬油の小滴を置きます。 </li><li>倒立顕微鏡のステージ上での結像の皿をマウントし、透過光を用いて、焦点に細胞をもたらす。なお、記録時の移動を防止するために、撮像皿を確保することが重要である。 </li><li>高速EMCCDカメラを使用して発せられる蛍光（λ&gt; 510 nm）をカル-520を励起し、収集するために、488nmレーザーで細胞を照らす。 注：顕微鏡を操作するソフトウェアパッケージは、ユーザが、レーザビームのいずれか（「WF」励起用）より中央または（TIRF励起用）は、対物背面開口部の極端なエッジで導入されることを可能にする集束レンズを翻訳することができる。 </li><li> EMCCDソフトウェアを使用して、ローカルのCa 2+のイベントをキャプチャするために必要な時間分解能でデータを収集するために、完全な512×512画素からの撮像視野を減らす。 注：たとえば、中央クワッド256×256ピクセルの買収は、66 fpsに取得率を高速化します。さらに、単離されたクロップ·モード機能を使用して500 fpsにEMCCDカメラのフレームレートを増加させることも可能である。 </li><li>自動的に、ベースラインアクティビティの数秒を記録し、細胞に紫外線フラッシュを提供し、別の10〜30秒の記録を継続してソフトウェアを設定します。 NOTE：UVフラッシュ、顕微鏡の背面ポートにおける反射ダイクロイックミラーUVを通して導入キセノンアーク光源を用いて送達される。 UVフラッシュの持続時間と強度は、地元のCa 2+イベントの所望の周波数を呼び起こすために経験的に調整されている。 </li><li>オフライン分析のための画像スタックなどのファイルに保存する。 </li></ol> 5.自動化のCa 2+画像解析注：これは、表示プロセスと多くの商用ソフトウェアパッケージを使用して、キャプチャしたデータを分析することが可能である。しかし、我々は急速に識別ANを自動化するためのアルゴリズムを開発した地元のCa 2+シグナルのd分析。このアルゴリズムで使用される空間的および時間的フィルタの詳細な説明は、ΔF/ F 0と識別/分析ルーチンの発生が11に見出すことができる。このアルゴリズムは、オープンソースソフトウェアプラットフォームのPythonで実行するために開発された、対応する著者（ismith@uci.edu）を電子メールで送信することにより、一緒にサンプル実験データと詳細な取扱説明書を得ることができる。 <ol><li>マルチプレーン.TIFFファイル形式にカスタム書かれたアルゴリズムにインポートするファイルを変換します。 </li><li>解析アルゴリズムを含むフォルダを見つけてダブルRUN.EXEをクリックします。 </li><li>分析されるべき.TIFFファイルを選択します。 </li><li> [開く]ダイアログボックスの[解析パラメータを選択してください。サンプルデータのデフォルトのパラメータについて、図2Aを参照のこと。 </li><li> nとし、視野の部分にカーソルを移動させるのいずれかによって画像スタックからオフセットされる黒レベルを決定する細胞が含まれている（ 図2Bを参照）、または手動で「セットブラックレベル」プロンプトを使用して黒レベルを入力することにより、OT。 </li><li>ソフトウェアによる分析（ 図2C-F）以下の画面上に4つのウィンドウを観察します。 Cは、分析された細胞からの蛍光を安静時のモノクロ画像である。この画像に重畳白い四角はイベントに備えた2次元ガウス関数の重心位置として決定し、イベントの場所である。 </li><li>各イベントの場所をクリックするか、イベント間のサイクルにカーソルキーを押してください。そのようにこれらの各サイトでのバックグラウンドを差し引い、ガウシアン平滑化蛍光比の変化（ΔF/ F 0）を実行するとウィンドウDに更新する メモ：Redイベントが隣接する部位に局在活動から「ブリードスルー」からその特定のサイトから発信していないと判断された強調した。選択された部位での蛍光シグナルの検出を超えた場合に低い青のトレースを示ししきい値は、黒い線のに対し、（イベントを強調し赤に相当する）、その特定のサイトから発信するイベントを識別します。 </li><li>赤をクリックしてイベントの時間発展を表示するウィンドウのE、およびイベントの空間プロファイルが一緒にフィットガウス関数の空間プロファイルで、その時間経過にわたって平均化され表示されたウィンドウFを更新するためにイベントを強調した。 </li><li>手動での成果物は、分析から除外することができるように特定されたイベントを確認します。右の赤いをクリックして、このようなイベントを削除するには、イベントを強調した。 注：我々の手では、単一のIP 3 Rチャネルを通じたCa 2+フラックスは約0.11ΔF/ F 0で信号を連想させるので、これは偽陽性である可能性が高いよりも、任意の検出された「イベント」かなり小さい。 </li><li>目的の細胞の周りに描画し、「保存CellRを選択することで、セルごとに、またはエクスポートデータ」をExcelに保存」を選択してデータをエクスポート17 ;. 注：データは元の画像スタックと同じフォルダに保存されます。 </li></ol>

<ol><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in smooth muscle.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), a004549(2011).</li>
<li>Hagenston, A. M., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+synapse-to-nucleus+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in synapse-to-nucleus communication.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), a004564(2011).</li>
<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elementary+and+global+aspects+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elementary and global aspects of calcium signalling.</a> J Physiol. 499 (Pt 2), 291-306 (1997).</li>
<li>Lipp, P., Niggli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hierarchical+concept+of+cellular+and+subcellular+calcium+signalling%29%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Biophys+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A hierarchical concept of cellular and subcellular calcium signalling).</a> Prog Biophys Mol Biol. 65 (3), 265-296 (1996).</li>
<li>Parker, I., Yao, Y., Ilyin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+kinetics+of+calcium+liberation+induced+in+Xenopus+oocytes+by+photoreleased+inositol+trisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Fast kinetics of calcium liberation induced in Xenopus oocytes by photoreleased inositol trisphosphate.</a> Biophys J. 70 (1), 222-237 (1996).</li>
<li>Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+cytosolic+calcium+based+on+rhodamine+and+fluorescein+chromophores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores.</a> J Biol Chem. 264 (14), 8171-8178 (1989).</li>
<li>Demuro, A., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+activity+and+localization+of+single+voltage-gated+Ca%282%2B%29+channels+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Imaging the activity and localization of single voltage-gated Ca(2+) channels by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 86 (5), 3250-3259 (2004).</li>
<li>Smith, I. F., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+quantal+substructure+of+single+inositol+trisphosphate+receptor+channel+activity+during+calcium+puffs+in+intact+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Imaging the quantal substructure of single inositol trisphosphate receptor channel activity during calcium puffs in intact mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (15), 6404-6409 (2009).</li>
<li>Reissner, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+postsynaptic+mechanism+for+heterosynaptic+sharing+of+short-term+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A novel postsynaptic mechanism for heterosynaptic sharing of short-term plasticity.</a> J Neurosci. 30 (26), 8797-8806 (2010).</li>
<li>Ellefson, K. S., Parker, B., Smith, I., F, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+algorithm+for+automated+detection%2C+localization+and+measurement+of+local+calcium+signals+from+camera-based+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging.</a> Cell Calcium. , (2014).</li>
<li>Smith, I. F., Wiltgen, S. M., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+puff+sites+adjacent+to+the+plasma+membrane%3A+Functional+and+spatial+characterization+of+calcium+signaling+in+SH-SY5Y+cells+utilizing+membrane-permeant+caged+inositol+trisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Localization of puff sites adjacent to the plasma membrane: Functional and spatial characterization of calcium signaling in SH-SY5Y cells utilizing membrane-permeant caged inositol trisphosphate.</a> Cell Calcium. 45, 65-76 (2009).</li>
<li>Shuai, J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+single-channel+recording+by+imaging+calcium+flux+through+individual+ion+channels%3A+theoretical+considerations+and+limits+to+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Optical single-channel recording by imaging calcium flux through individual ion channels: theoretical considerations and limits to resolution.</a> Cell Calcium. 37 (4), 283-299 (2005).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

私たちはここに記述し、蛍光Ca 2+の指標を用いて培養された哺乳動物細胞中で地元のCa 2+イベントを画像化するためのプロトコル。さらに、我々は、取得したデータの識別および分析を自動化する直感的なユーザーインターフェースでアルゴリズムを記述する。ここで説明する手順は、蛍光Ca 2+のインジケーターカル-520が、例えば、Fluo-3、Fluo-4のような他の多くのCa 2+感受性色素を利用して、のFluo-8およびオレゴングリーンBAPTA-1は、画像のCaに十分にうまく機能2+マイクロドメイン。注意は、これらの指標の高親和性バージョン（〜200〜400 nMでのK d）は 、画像に局所Ca 2+のミクロドメインを使用していることを保証するように注意する必要がなく、これらの指標の最適な負荷条件にするために経験的に決定される必要がある調査中の各細胞タイプ。その性質上2+指標は、Caと結合したCa 2+ため、Ca 2+のバッ...

カルシウムイオン（Ca 2+が ）普遍的に遺伝子発現、分泌およびシナプス可塑性1における長期的な変化を含む、生物学的プロセスの多様な範囲を調節。 Ca 2+のような多様な方法で行動できるような一つの方法は、Ca 2+の異なる空間的·時間的パターンを介して行われ、細胞が生成することができます通知します。細胞質ゾルの例グローバル標高平滑筋組織2のに対し、小さい内の[Ca 2+]トリガー収縮、ローカライズされた一過性の上昇（ローカルのCa 2+のミクロドメイン）の場合は学習と記憶3に不可欠な遺伝子発現を刺激する。 無料のサイトゾルは、の[Ca 2+]静止時〜100 nmで維持されるが、急速に細胞膜内とすることにより位置のCa 2+透過性イオンチャネルを通じて細胞質ゾルへのCa 2+の流入、以下のいくつかのマイクロモル濃度に上昇することができます細胞内sからのCa 2+の遊離tores。私たちの研究室では、小胞体（ER）膜に存在するのCa 2+放出チャネルを形成する、イノシトール1,4,5-三リン酸受容体（IP 3 R）に焦点を当てています。受容体のサイトを活性化、細胞質ゾルに両方のIP 3およびCa 2+が結合すると、IP 3 Rチャンネルは、Ca 2+が ER内腔内に隔離遊離するために開きます。 Ca 2+の放出が空間的に（Ca 2+のパフ4）のCa 2+のローカルサイトゾルのミクロドメインを生成するために、IP 3 Rの小さなクラスタに制限されたままであってもよいか、IP 3 Rの隣のクラスタの近接度に応じて、かもしれないのCa 2+誘導性のCa 2+ -放出（CICR）5,6のプロセスを介して複数のパフサイトを補充することによって、細胞全体に伝播。 高度な顕微鏡imagiと相まってツィン7ロジャーによって開発された蛍光小分子のCa 2+指示色素の導入、技術ngを、大幅のCa 2+シグナル伝達の我々の理解を促進してきた。顕微鏡検査のために使用されるカメラの最近の進歩は今そのような前例のない空間および時間分解能でパフなどの一時ローカルのCa 2+イベントを撮像することができます。現在利用可能なEMCCDカメラは、&gt; 500フレーム秒-1数（fps）と相補型金属酸化物半導体の新世代で128×128画素の画像化を可能にする（CMOS）カメラは、わずかに高い犠牲にしてより高い画素解像度、さらに速い速度を提供ノイズレベル。全反射（TIRF）顕微鏡法と併せて、画像を参照する単一のCa 2+チャネルイベント8,9可能である。実行不可能な手動処理、視覚的識別および分析をレンダリングし、自動化されたアルゴリズムの開発に責任を置く大規模なデータセット（毎分約 1Gビット）を発生しながら、このアプローチは、同時にチャネル/イベント数百の画像化を可能にする。 2+指標を用いて、無傷の哺乳動物細胞でのローカルのCa 2+シグナルを画像化するための手順およびプロトコルを提示する。今後は、TIRF、従来の広視野落射蛍光（WF）顕微鏡の両方によって画像化ローカルのCa 2+イベントの識別と分析を自動化し、オープンソース環境Pythonで開発したアルゴリズムを実証する。我々はIPのCa 2+シグナルをと生成さ3のコンテキストでこれらのアプローチを説明したが、彼 ​​らはの[Ca 2+]のCa様々ないずれかの表面に位置2+透過性イオンチャネルを発散する細胞質ゾルの局所的な変化を研究するために容易に適している膜または細胞内小器官8-10。

<table><tbody><tr><td>ヒト神経芽腫 SH-SY5Y細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>Cal-520/AM</td><td>AATバイオクエスト</td><td>21130</td><td></td></tr><tr><td>ci-IP3 (D-23-O-イソプロピリデン-6-O-(2-ニトロ-4,5-ジメトキシ)ベンジル-<-em>myo-イノシトール 1,4,5-三リン酸-ヘキサキス(プロピオノキシメチル) エステル</td><td>SiChem</td><td>cag-iso-2-145-10</td><td></td></tr><tr><td>DMSO/20% プルロン酸 F127</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>EGTA/AM</td><td>Invitrogen</td><td>E-1219</td><td></td></tr><tr><td>35 mmガラス底イメージングディッシュ</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr></tbody></table>

イメージングローカルca<sup&gt; 2+</sup&gt;培養哺乳動物細胞内シグナル

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

細胞質ゾルのCa 2+イオンは、広範囲の遺伝子転写、電気的興奮性細胞増殖のようなプロセスを制御する、ほ ​​ぼすべての細胞型における細胞活性の多くの側面を調節する。のCa 2+シグナル伝達の多様性と特異性は、地元の過渡のCa 2+マイクロドメイン分の期間にわたって発生する細胞全体の振動と波に至るまでのCa 2+シグナルは、異なる時間と空間スケールの上に行動するために生成されるメカニズムから派生（Ca 2+のパフ）持続的なミリ秒。電子の最近の進歩は、CCD（EMCCD）カメラは今&gt; 500フレーム秒-1（FPS）のレートで128×128ピクセル空間分解能で地元のCa 2+シグナルの画像化を可能に掛けた。このアプローチは、高度に並列であり、単一の実験でチャンネルやパフサイトの何百もの同時モニタリングを可能にします。しかし、膨大な量のデータが生成された（ 約 ​​1 GBのPER分）実行不可能なローカルのCa 2+のイベントの視覚的な識別と分析をレンダリングします。ここでは説明し、取得、検出のための方法が示され、かつ広視野落射蛍光（WF）と全反射の両方を使用したCa 2+指標を搭載し、無傷の哺乳動物細胞内でのCa 2+シグナルを媒介3ローカルIPの分析蛍光（TIRF）顕微鏡。さらに、我々は、これらのローカルのCa 2+シグナルの同定および分析を自動化するオープンソースのソフトウェア環境のPythonの中で開発したアルゴリズムを記述します。アルゴリズムは、サブピクセル解像度でのCa 2+放出の部位を局在化する。データのユーザーレビューを可能にする。エクセル互換テーブルの振幅および動力学的データと共に蛍光比信号の時間系列を出力する。

図1Aはまた、ciは、IP 3を装填したヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞におけるカル-520蛍光休止のWF画像を示す。フォト·リリースに100ミリ秒のUVフラッシュへのこれらの細胞の曝露は、I-IP 3は、（ 図1Aに白丸で示される）別個の部位での一過性のCa 2+パフを誘発した。これらの部 ​​位で測定された蛍光トレースはゆっくりとリリースサイトから拡散したCa 2+のような非常に遅い立相（ 図1Bおよび1C）が続くIP 3 Rの一過性の開口部、のために急速な上昇相を示した。赤は、 図1Bのイベントが選択されたサイトから発信されたのは、アルゴリズムによって決定されたのCa 2+シグナルである強調した。非ハイライトのイベントが密接に隣接する部位から拡散するのCa 2+シグナルを汚染...

ここでは、Ca2+インジケーターをロードした無傷の哺乳類細胞で蛍光顕微鏡を使用して、局所的なIP3媒介Ca2+イベントをイメージングする技術と、これらのイベントの識別と分析を自動化するアルゴリズムを紹介します。

イメージングローカルCA<sup&gt; 2+</sup&gt;培養哺乳動物細胞内シグナル

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

この手順の全般的な目的は、カメラベースのイメージングを用いて、生存している哺乳類細胞における局所的なIP₃介在性カルシウムシグナルの取得、検出、および解析を実証することです。これは、まず細胞をガラスボトムカバースリップ上で培養し、細胞膜透過性の蛍光カルシウムインジケーターであるCAL-520およびケージドIP₃をロードさせることで達成されます。第2ステップでは、カバーガラスを倒立顕微鏡のステージ上に配置し、488 nanometerの光でサンプルを照らして、カルシウム感受性蛍光色素であるCal five 20を励起させます。次に、細胞に短時間のUV光パルスを照射することで、局所的なカルシウム信号を誘導します。これにより、ケージ化された前駆体からIP threeが光放出され、それがイノシトール三リン酸受容体に結合して、小胞体からのカルシウム放出を媒介します。最終ステップは、記録されたデータの自動解析を開始するために、カスタム作成されたアルゴリズムに画像スタックをインポートすることです。最終的に、このアルゴリズムはサブピクセル解像度でカルシウム放出部位を迅速に特定し、ユーザーによるデータの確認を可能にし、蛍光比シグナルの時系列データとともに、振幅およびキネティクスデータをExcel互換形式で出力します。このアプローチにより、数百のチャネルまたはイベントを同時にイメージングすることが可能になりますが、従来の手法よりもはるかに多くのデータが得られるため、生成される膨大なデータ量は、手動での処理、視覚的な同定および解析を困難にします。この手順を実演するのは、私の研究室のポストドクであるJeff Lockeです。まず、膜透過性CAL five 20とCI IP threeのストック溶液を、カルシウム含有HBSSを用いてそれぞれ最終濃度5 µMおよび1 µMになるように希釈し、ローディングバッファーを調製します。次に、培地を吸引し、細胞をカルシウム含有HBSSで3回洗浄します。次に、カルシウム含有HBSSを除去し、ローディングバッファー中で室温・暗所で60分間細胞をインキュベートします。続いて、カルシウム波を遮断して局所的なカルシウム信号の解析を容易にするため、ローディングバッファーを除去し、カルシウム含有HBSSで細胞を3回洗浄します。その後、5 µMのEGTAを含むカルシウム含有HBSSを用い、室温・暗所で30〜60分間細胞をインキュベートします。このインキュベーション後、細胞をカルシウム含有HBSSで3回洗浄します。その後、イメージングの直前に、導入した試薬のDエステル化を促進させるため、細胞をカルシウム含有HBSS中で30分間インキュベートします。最後のインキュベーション中にバスに漏出した可能性のある染料を除去するため、カルシウム含有HBSSを新鮮なカルシウム含有

imaging-local-ca2-signals-in-cultured-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

小胞体は、タンパク質の生合成とカルシウムの恒常性において重要な役割を果たしている。私たちは、私たちはCa2 +のリークチャネルの役割に対処し、それらの推定調節機構を特徴づけることを可能にする実験系を確立しています。このシステムは、siRNAを介した遺伝子サイレンシングと生細胞のCa2...

siRNAを介した遺伝子サイレンシングと組み合わせることで生細胞のカルシウムイメージングでは、CAを識別 2 + ER膜のリークチャネルとその調節機序

線条体におけるアストロサイトの細胞内Ca2+シグナルの特性と機能は、まだ完全には調査されていません。血清型2/5のアデノ随伴ウイルス(AAV2/5)を使用して、線条体アストロサイトで遺伝的にコードされたカルシウムインジケーターを発現する方法、および線条体アストロサイト内のCa2+シグナルをin...

イメージング細胞内Ca 2+シグナル

この資料では、プラズマまたは哺乳類細胞における地上州枯渇 (GSD) 超解像顕微鏡法を用いた細胞膜タンパク質の検出のためのプロトコルについて説明します。ここでは、我々...

哺乳類細胞における地上州枯渇超解像イメージング

マウスの神経筋接合部で個々 のセル型の集団のイメージ...

Ex Vivoセル固有カルシウム マウス ダイヤフラムの三者のシナプスでシグナル伝達のイメージング

遺伝子にエンコードされた Ca2 +インジケーター (GECIs) がどのようにその場で Ca2 +イメージングの実行と根本的に変更されました。そのような録音からのデータ回復を最大限に Ca2 +シグナルの適切な分析が必要です。本プロトコルは、Ca2...

その場で細胞内 Ca2 +シグナル伝達を定量化する時空マッピングと粒子分析技術の応用

ここで Ca2 +イメージング ニューロンとグリア細胞内 Ca2 +シグナル細胞レベル下の解像度での解剖を可能にするためのプロトコルを提案する.このプロセスは、遺伝子にエンコードされた Ca2...

膜をターゲットとした Ca2 +インジケーターによる培養細胞のローカル Ca2 +シグナルの解剖

蛍光カルシウムイメージングとin...

ゼノプス・ラエビスにおける神経前駆体特性評価のための蛍光カルシウムイメージングとその後のその後の位置ハイブリダイゼーション

現在の方法は、容易に入手可能な遺伝的にコードされたカルシウム指標を使用して、カエノラブディティスエレガンスのin...

in vivoでの神経細胞カルシウムハンドリングの細胞内イメージング

このプロトコルは野生型マウスの皮質をそのまま残している間2光子の顕微鏡検査との単一ニューロンの活動をイメージ投射すること、および部分皮質の突然変異体のマウスの広視野顕微鏡検査が付いている全体のSCをイメージ投射することを含む目がさめているマウスの優秀なcolliculus (SC)のカルシウム応答を、イメージ投射するためのプロシージャを詳述する。...

マウス上結腸におけるカルシウムイメージング

ここでは、蛍光顕微鏡法を用いて、初代マウスおよびヒトT細胞におけるCa2+マイクロドメインとして知られる初期の局所Ca2+シグナルを分離するための包括的なプロトコールを提供します。このプロトコルは、免疫細胞内のCa2+シグナル伝達経路を研究し、その機能をさらに解明するための研究者にとって貴重なリソースとして機能します。...

初代T細胞における初期Ca2+ マイクロドメインのイメージング

この記事では、Fura-2/AM色素を用いたシングルセルCa2+イメージングを使用して、細胞内のカルシウムイオン(Ca2+)濃度をリアルタイムで定量的にモニタリングする方法を紹介します。この技術により、効率的な色素ローディングと、蛍光強度比によるCa2+レベルの正確な計算が可能になり、研究アプリケーションのためのシンプルで迅速なアプローチが可能になります。...

カルシウムイオンチャネルの活性化を研究するためのシングルセルカルシウムイメージング

学ぶ局所的なIP3媒介カルシウムシグナルの蛍光顕微鏡によるイメージングと自動解析アルゴリズムを用いた検出法。この手法は神経科学および細胞生物学研究においてカルシウム動態を可視化し、疾患モデル解析に応用可能です。

イメージングローカルCA

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