と伝達性海綿状脳症種の障壁を評価する

本手順の全体的な目的は、生きた動物への接種を行うことなく、伝達性海綿状脳症（TSE）の特定の種に対する種バリアを評価することです。まず、in vitroアッセイに使用するための2種類の変換アッセイ基質を調製します。次に、これらの基質を、テストしたいTSE因子とともにインキュベートします。

Proteinase Kで消化した後、サンプルをSDS-PAGEおよび免疫ブロッティングに供します。最終ステップとして、フローサイトメトリーを用いて各基質中のProteinase K耐性PreOnタンパク質の量を測定し、変換効率比（CER）を算出することでこれらの量を比較します。最終的に、CERはテストしたTSEの、基質を調製したホスト種に対する種障壁の指標となります。

本アッセイの利点には、低コストであること、実験期間が短いこと、および生体動物を組織サンプルで代替できることが挙げられます。本手法は、野生動物におけるプリオン病の種族障壁に関する知見を得るのに適していますが、その他の任意の種にも適用可能です。一般的に、本手法を初めて行う方は、基質の調製、品質管理、および標準化に苦労することがあります。

目的種の健康な非感染脳組織を入手した後、ビーズミルまたは乳鉢と乳棒を用いて、ライシスバッファー中で10% w/vのホモジネートを調製します。その後、シリンジと針を用いてホモジネートをさらに精製し、27Gのシリンジ針で基質を容易に吸引および排出できるまで、徐々にゲージ数を上げた針でホモジナイズします。次に、脳ホモジネートを等量ずつ、ラベルを貼った別々のプラスチック製コニカルチューブに分注し、一方のチューブには3 Mのグアニジン塩酸塩を、もう一方のチューブにはpH 3.5または7.4のXPBSを、脳ホモジネートに対して1:1の容量比で加えます。

次に、基質溶液のpH値を確認し、必要に応じて濃塩酸または水酸化ナトリウムを用いて、各基質のpHが目標値の±0.05以内に収まるように調整します。溶液をエンドオーバーエンドミキサーで室温にて5時間回転させます。その後、各コニカルチューブ内の基質溶液に4倍量のメタノールを加えて十分に混合し、タンパク質を沈殿させ、-20°Cで16〜18時間インキュベートします。

インキュベーション後、サンプルを4°Cで13,000 Gにて30分間遠心分離し、沈殿させます。その後、上清を注意深くデカンテーションして廃棄し、ペレットからメタノールを蒸発させます。チューブの内壁に付着したメタノールの吸収を助けるために、綿棒を使用してください。

ペレットを乾燥させすぎないようにしてください。メタノールが見えなくなったら次のステップに進み、脳ホモジネートの開始材料と同量の変換バッファーを用いてタンパク質ペレットを再懸濁させます。再懸濁後、基質溶液を10秒間短時間ソニケーションします。

カップホーンを用いて、最大出力の約30%で超音波処理を行います。次に、各基質中の細胞性プリオンタンパク質がプロテイナーゼK感受性であるはずであるため、溶液をラベル付きの1.5 mLマイクロ遠心チューブに0.5～1 mLずつ分注します。各基質の10～25 µLに、最終濃度100 µg/mLのプロテイナーゼKを加え、サーモシェイカーを用いて37 °C、1000 RPMで1時間消化させます。プロテイナーゼKで消化した基質と、未消化の各基質10～25 µLをロードします。

SDS-PAGEを行い、プリオンタンパク質特異的抗体でゲルおよびイムノブロッキングを実施し、宿主プリオンタンパク質、プロテイナーゼK耐性、および未消化タンパク質のレベルを評価します。この画像はイムノブロットの結果を示しています。左側の2つのレーンは未消化の基質であり、右側の2つのレーンはプロテイナーゼKで消化した基質です。

pH 7.4および3.5の基質におけるタンパク質レベルの差が概ね10%以内であり、かつプロテアーゼK耐性を示さない場合、その基質ペアはCER研究に使用するのに適切です。他の分注サンプルは、CERアッセイを実施するまで-80°Cで保存してください。TSE病原体は、適切なバイオセーフティ上の予防措置を講じ、施設内のガイドラインに従って取り扱う必要があります。目的の種からTSE感染脳組織を入手した後、基質ペアの調製に用いたホモジナイズ法を用いて、pH 7.4の1×PBSで10% w/vのホモジネートを調製します。

得られたホモジネートを0.5 mLマイクロ遠心チューブに100～300 µLずつ分注し、CERアッセイを行うまで-80 °Cで保存した。開始にあたり、pH 3.5および7.4の非感染CER基質、およびPrPSc感染種種液（seed solutions）の同量を氷上に約1時間置いてゆっくりと融解させる。融解後、溶液を氷上に保持したまま、各基質溶液を27ゲージの注射針で吸引および排出して再ホモジナイズする。

次に、各TSE感染溶液を、最大出力の約30%で10秒間、短時間超音波処理します。続いて、ラベル付きの低吸着薄壁PCRチューブに、pH 7.4で調製したCER基質95 µLを2本のチューブに、pH 3.5で調製したCER基質95 µLをさらに別の2本のチューブにそれぞれ分注し、変換反応を準備します。

次に、pH 7.4および3.5の各基質チューブに、10%TSE感染種子溶液を5 µLずつ加えます。並行して、非特異的な非テンプレート変換をコントロールするため、pH 7.4および3.5のもう一方の各基質チューブに変換バッファーを5 µLずつ加えます。また、インプットのproteinase K耐性プリオン蛋白のコントロールも調製します。

テストする各TSE病原体について、コントロールとして、10% TSE感染シード溶液 5 µL を変換バッファー 95 µL に加えます。密閉したPCRチューブに入った各サンプルを短時間ボルテックスし、チューブの底と壁面を混合します。その後、低速の卓上ミニ遠心機で短時間遠心し、PCRチューブの蓋に付着した反応混合物を除去します。

PCRチューブに対応したベンチトップサーモシェーカーにチューブをセットし、37 °C、1000 RPMで24時間振盪させます。翌日、最終濃度が2% w/vとなるようにsarco cellを、最終濃度が100 µg/mLとなるようにproteinase Kを加え、サーモシェーカーを用いて37 °C、1000 RPMで1時間サンプルを消化させます。SDS-PAGE用サンプルバッファーを加え、サンプルを95 °Cで10分間加熱し、各サンプルに残存するproteinase K耐性PreOnタンパク質をSDS-PAGEで分離した後、前述と同様に免疫ブロッティングを行います。最後に、種の方壁の指標として変換効率比を算出します。

記載されたプロトコルに従い、pH 7.4または3.5で調製したマウスCERアッセイ基質を、マウス適応スクレイピー（RML）、家畜羊の古典的スクレイピー、オジロジカの慢性消耗症、またはハムスター適応スクレイピー（263K株）とともにインキュベートした。CERアッセイにおいて、「none」と表記されたコントロールサンプルには同量の感染剤が含まれており、マウス基質サンプルについては、モノクローナル抗体SAF 83を用いた免疫ブロット法により、プロテアーゼK耐性プリオンタンパク質の有無を解析した。

各サンプルの未補正の $\text{tr}_{\text{ic}}$ 値が、各レーンのプロテイナーゼ処理結果の下に表示されています。K耐性プリオン蛋白レベルは、pH 7.4で変性させ、さまざまなTSE因子を接種したマウス基質間で変動しました。pH 3.5で変性させTSE因子を接種したすべての基質においてプロナーゼK耐性プリオン蛋白が検出されましたが、この棒グラフは、少なくとも3回の独立したアッセイ実行に基づいた、各感染因子におけるpH 7.4と3.5のマウス基質間の平均比（±標準偏差）を示しています。

小文字は、分散分析を用いてp値0.05未満で判定された統計的に均質なサブセットを示します。Tukey-Kramerの最小有意差法によるものです。習得すれば、適切に実施することでこの手法は48時間以内に完了できます。CERアッセイは、生体動物を用いた追加研究の妥当性を判断、あるいは不要とするための、TSE種の種特異的バリアの存在に関する初期評価として利用可能です。

このビデオを視聴することで、基質の調製方法、変換反応の設定方法、および種間障壁を評価するための変換効率比の算出方法について十分に理解することができます。