Name: と伝達性海綿状脳症種の障壁を評価するインビトロプリオンタンパク質変換アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: 学ぶ、伝達性海綿状脳症の種間障壁を評価するインビトロプリオンタンパク質変換アッセイ。CERを用いて動物実験なしに種間伝播リスクを定量化し、神経変性疾患研究の倫理的代替法として活用できます。

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組織取得の支援について、John Olsen氏(ウィスコンシン州天然資源局)、Tom Cooley氏、Daniel O'Brien氏、Steve Schmitt氏(ミシガン州天然資源局)、Daniel Walsh博士(USGS国立野生生物保健センター)に感謝します。また、診断検査サービスを提供してくださったウィスコンシン州立衛生研究所、機器の使用について、トニー・ロック博士と彼女のスタッフ(USGS国立野生生物保健センター)にも感謝します。商号、製品名、または会社名の使用は、説明のみを目的としており、米国政府による承認を意味するものではありません。

USGS国立野生生物保健センターで行わ動物の作業は実験動物福祉ガイドラインのNIHオフィスに合わせて、制度的動物のケアと使用委員会プロトコル＃のEP080716で行った。狩猟採取した動物からの組織は、ウィスコンシン州、または天然資源のミシガン部門からの贈り物だった。 1.溶液の調製注：以下に記載されているソリューションは、下記の第2でCERアッセイ基質の製造のために必要とされる。より高濃度のストック溶液からこれらの溶液の各々を準備し;ストック溶液の推奨濃度は、リストされた各それぞれの化学名の後の括弧内に与えられます。使用するまで4℃で基板準備や店舗の際に新鮮なすべてのソリューションを準備します。 <ol><li> 100mMの秒：溶解緩衝液は、10mMトリス、pH7.5の（1 Mトリス、推奨pH7.5のストック溶液）で以下の溶液を調製する憎悪塩化ナトリウム（NaCl、1 Mのストック溶液）、10mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA、500mMのEDTA、pH8.0のストック溶液）、0.5％NP-40（10％ストック溶液）、0.5％デオキシコール酸（DOC、10％ストック溶液）。 </li><li>変換バッファは、1リン酸緩衝生理食塩水（PBS、10、pH7.4のストック溶液）、0.05％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS、10％のストック溶液）及び0.5％のTriton X-100（10％ストック溶液）の溶液を調製する。 </li><li>カオトロピックソリューションでは、1×PBS（10倍原液）における塩酸グアニジン（GdnHCl、8 Mストック）の2つの3 M溶液を調製する。濃塩酸（HCl）を用いて、3.5±0.05の解決策の1のpHを調整する。第2の溶液のpHが7.4±0.05のままであり、必要に応じて、濃HClまたは水酸化ナトリウム（NaOH）を用いて調整することを確認する。 </li></ol> 2. CERアッセイ基質ペアを準備<ol><li>興味の種から健康的、非TSE感染脳組織を入手し、10％の重量あたりのボリュームを準備ダウンス、ビーズミル、又は乳鉢及び乳棒均質化：次のいずれかの方法を使用して、溶解緩衝液中（w / v）のホモジネート。さらに、シリンジおよび針均質に供する基板を吸引し、27 G注射針を介して容易に排出することができるまで増加ゲージの針を使用して得られたホモジネートを絞り込む。 <ol><li>齧歯類および他の小型哺乳類から調製基板について、脳全体（複数可）を均質化する。大型哺乳類から調製した基板について、OBEX（脳幹）ホモジネートを準備するための組織を使用しています。脳ホモジネートの量を選択する場合、ステップ2.6において、タンパク質沈殿のために使用される遠心分離器の容量の50％以下を準備していない。 </li><li>取得された脳組織の品質は疑問がある場合は、SDS-PAGEおよび免疫ブロット16 17基板の前に準備することによってのPrP Cのレベルを評価する。 </li></ol></li><li>独立したラベルプラスチック製コニカルチューブ内の2つの同等のボリュームに脳ホモジネートを分割。 （GdnHClを追加脳ホモジネートへ1体積比：1の各チューブにpHが3.5または7.4のいずれかで1 P​​BS中の3 Mソリューション）。 </li><li> 2の溶液のpH値を確認してください。濃HClを使用して0.05​​±pHにpHを3.5基質のpHを調整します。他の基板のpHは7.4±0.05のままで確認し、必要に応じて、必要に応じてHClまたはNaOHでpHを調整する。酸または塩基の賢明な添加によってpH値をオーバーシュート避ける。 </li><li> 5時間室温（RT）で転倒ミキサーで解決策を回転させます。 </li><li>各コニカルチューブ内の基板ソリューションへのメタノールの4つのボリュームを追加することによって、タンパク質を沈殿させ、ボルテックスよく混ぜ、そして16〜18時間、-20℃でインキュベートする。 </li><li> 4℃で30分間、13000×gで遠心分離により堆積物試料。慎重にデカントし、上清を廃棄し、メタノールはペレットから蒸発させる。チューブの内側にしがみついメタノールを吸収を助けるために綿棒アプリケーターを使用してください。オーバー-DRへのペレットを許可しないyおよびメタノールが見えなくされたら、次のステップに進んでいない。 </li><li>変換バッファにおけるタンパク質ペレットを再懸濁する。ステップ2.2において、各チューブに分注し、脳ホモジネートの出発材料の量に等しい変換バッファの量を使用する。 注：これは、pHが3.5と7.4で処理した基板の製剤の両方からのタンパク質ペレットを再懸濁するために使用する変換バッファは、（洗剤の低レベルと生理的pHを含む）上記のステップ1.2で定義されて解決することが重要です。 </li><li> cuphorn音波処理で簡単に超音波処理基質溶液（30％最大電力〜10秒）、0.5へのアリコート - ラベル1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ中で1.0mlのボリューム。各基板のアリコートに品質管理イムノブロット（ステップ2.9）を実行します。 CERアッセイ（第4節）を実行する準備ができるまで-80℃で、他のアリコートを保管してください。 </li><li>使用前CER基板対（ 図2）上の品質管理を行う。これらのステップは、CER基板が提供します：することを保証する変換の研究で、電子最適な結果を得る。 <ol><li>二枚の基板中のPrP Cの匹敵する量を確認してください。 SDS-PAGE 16およびイムノ17によって各基板の10-25μlの中のPrPレベルを比較。 pHは7.4と3.5の基質中のタンパク質レベルが互いに約10％以内で​​あれば、基板対はCER研究での使用に適している。 注：PrPのイムノブロットは、大規模なPrP Cから劣化の証拠を示すべきではありません。 PrPの免疫反応性は、主&gt; 20kDaのである必要があります。この分子量よりも小さいバンドは分解産物であることができる。バンドパターンは、基板対の間でほぼ同等でなければなりません。 </li><li>両方の基質中のPrP Cの PK敏感であるべきであるように、100μg/ mlの最終濃度でPKと、各基板10〜25μLを治療し、サーモシェーカーで1時間、37℃で1,000rpmで試料を消化する。 SDS-PAGE 16およびイムノ17で残りのPrPの信号を評価する。PrPのRESを持つ基板は、CERの研究に使用するために適切ではありません。 </li></ol></li></ol> 3.東証エージェントの種子を準備<ol><li>興味の種からTSE感染脳組織を入手し、上記のステップ2.1に記載されている方法を使用して、1×PBS pH7.4の中で10％（w / v）のホモジネートを準備します。 NOTE：種子はまた、中枢神経系外の他のTSE感染組織から製造することができ、しかし、TSE感染末梢組織に由来する種子による脳由来の基質の変換効率はまだ実験的に公開された文献において評価されていない。 </li><li> 100へのホモジネート（S）結果の分量 - 直前まで、-80℃で0.5 mlマイクロチューブ内の300μlの体積およびストアはCERアッセイを実行する。 </li></ol> 4. CERアッセイ注：CERアッセイは、ある種から（「シード」で提供される）のPrP TSEの比較的少量の添加を含む部分的にpHが3.5または7.4のどちらかで変性された別の種からのPrP C（非感染脳「基板」で提供される）の相対的過剰に。拡張振盪インキュベーション期間の後、各反応中のPrP TSEによるPrP Cからのテンプレート駆動型の変換は、PrPの解像度の残りのPK消化および免疫ブロット検出後の濃度測定信号によって評価される。以前にpHは3.5 対 7.4で変性基質中のPrP RESレベルを比較することは、種の壁の尺度を提供する。このアッセイ法の実験の概要を図1に提供される。 <ol><li>ゆっくりと非感染CER基板のペア（アッセイは、以前にpHが3.5と7.4の両方で変性基質の等容量を必要とする）と氷のベッド（約1時間の解凍時間）の上にそれらを配置することによってTSE感染シード·ソリューションを解凍。 </li><li>完全に解凍されると、吸引した後、各貫通基質溶液を追い出す27 Gの注射針を数回に再均質化する。簡単に説明すると約30％最大パワーで10秒間各TSE感染シードソリューションを超音波処理。変換反応の準備中に氷の上にすべてのソリューションを保管してください。 </li><li>ラベルTSEエージェントあたり5個々の低結合、薄壁PCRチューブがテストされている。 </li><li> pHは7.4で調製（a）はCER基板およびpH 3.5で調製（b）はCER基板の95μlに10％のTSE感染シード溶液5μlを添加することにより、これらのチューブ内変換反応を準備します。 <ol><li>各実験サンプルについては、以前にpHは3.5と7.4の両方で変性CER基板対における平行反応を準備します。 </li><li>経験的決定を通じて感染していない脳の基板へのTSE因子の種の比率を最適化します。共通シード：採用基板比は100μlの総反応容量を維持し、1：99μL、2：98μLと5:95μlのがあります。ほとんどのアプリケーションでは、5：95μlのシード基板の体積比が適当であると目に提示されるものであるプロトコルである。 </li></ol></li><li>次のようにTSE因子ごとに3つのコントロールサンプルがテストされているの準備：（a）の入力のPrP RESのコントロールとして95μlの変換バッファに10％のTSE感染シード溶液5μlを追加します。非特異的、非テンプレートの変換のための対照として（b）のpHは3.5、及び（c）は、pH 7.4で調製95μlの基質を5μlの変換バッファを追加する。 </li><li>簡単に言えばよく、種と基板を混合するためにその閉じたPCRチューブに各サンプルをボルテックス。 PCRチューブの蓋の中に閉じ込め、反応混合物の任意のボリュームを削除するには、低速ベンチトップミニ遠心機で瞬間的なパルスで従ってください。 </li><li> PCRチューブを受け入れるために装備ベンチトップサーモシェーカーに個別に標識PCRチューブで負荷サンプル。 24時間、37℃で1000rpmでサンプルを振る。 </li><li>以下（w / v）のおよびPKを、100μg/ mlの最終濃度2％の最終濃度までサルコシルを追加し、振盪。ダイジェストサンプルサーモシェーカーで1時間、37℃で1,000rpmで少なくとも。 NOTE：PrP CからのPK消化のサンプル変換後のエイズへのサルコシルを添加する。播種していないサンプル（ステップ4.5）において偽陽性シグナルは事実上サルコシルを添加することによって除去される。 </li><li> 5分間95℃にSDS-PAGE試料緩衝液、熱のサンプルを追加して、17をイムノブロッティング、続いてSDS-PAGE 16により各サンプルの残りのPrP resとを解決する。 注：前のイムノブロッティングサンプルバッファーの添加と加熱後、サンプルをすぐに処理してもよいし、サンプルは-20℃で保存するか、または-80℃である。ここに提示されたすべてのデータは、ノベックスNuPAGEゲル及び転送システムを使用して生成された。 CERアッセイからの個々のサンプルがサンプル·バッファと、製造者の指示に従って還元剤で処理した。サンプルは、その後95℃で5分間加熱し、各サンプルの30μlを、12％ビス - トリスプレキャストゲルにロードした。 </li><li>対策として、変換効率比（CER）を計算種の壁の。デンシトメ17によるPrPのRESの測定レベルと、pHが3.5試料のそれによってpHが7.4の試料の総密度を分割。パーセントを生産する100で掛けます。 </li><li>与えられたTSE因子を有する種の平均CER±標準偏差を生成するために、独立した実験の反復からのデータをコンパイルします。 </li></ol>

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著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルが正常に完了するために、注意が基板準備（ステップ2.1.2）と、変換反応（ステップ4.4.2）用の比率を基板へのシードに使用する非感染脳組織中のPrP Cレベルに支払われるべきである。我々の経験では、脳は、限りのPrP Cは、免疫ブロット法（ 図4）によって存在するように、かなりの期間、死後後CER基板として使用するために抽出することができる。実際には、いくつかの自己消化は、CER研究のために使用ボブキャットの脳で観察された。それにもかかわらず、これらの脳から誘導された基質のインキュベーションは、依然としてのPrP resは形成された。我々は、部分的には、CERアッセイのロバスト性は、多くのプロテアーゼを不活性化する、1.5M GdnHClでCER基質の変性に由来する、と推測している。 比率を基材へのシードは、免疫ブロット法により許容さPrPのRES信号を得ることが経験的に決定する必要があるかもしれない。あまりまたはL基質比：ittleのPrP <...

伝達性海綿状脳症（TSE、プリオン病）は、動物およびヒトの様々な影響を与える長時間のインキュベーション期間が致命的な神経変性疾患の一群である。 TSEの推定上の病原体は、感染、疾患関連したPrP（PrP Cから）の正常な細胞形態のテンプレート駆動変換によって自己増殖可能な宿主プリオンタンパク質（PrP）のミスフォールド異性体から構成されている感染したホスト1の中枢神経系組織内に蓄積フォーム（PrPのTSE）。感染哺乳類のプリオンは、一般的に種間の伝送イベント2を制限する「東証種の壁」の概念に上昇を与えている種特異的な方法、ホスト·ツー·ホストから送信する。プリオン種の壁の生物学的決定要因はよく理解されていない。感染性プリオンTSEとホストのPrP C cとのアミノ酸配列類似性強く変換が行わ3-5かかりますが 、 インビボ 6,7 で観察されたすべてのプリオン伝達事象を説明するには不十分なままであるかどうかに影響を与える。 したがって、TSE種の障壁の特性は、主に動物チャレンジ試験に頼っている：別のプリオンに所定の種からのナイーブ動物を曝露し、伝送効率の指標として、疾患の発症および発病率を生じるインキュベーション時間を測定する。異種の種由来のPrP Cを発現するマウスはまた、試験8のこのタイプのために使用される。トランスジェニックマウスの生産と長引くプリオンバイオアッセイと同様に、動物使用の倫理的配慮に関連するコストは、東証種の壁の実験的調査の障害となっている。 TSEはヒト種の壁の評価は、ヒトPrP Cを発現するように遺伝子操作したマウスに依存しています。これらのマウスは、tに人間のTSEや変更に屈するように長い潜伏期間を必要と彼の迅速な疾患発症9用のヒトPrP C分子 。これらのマウスにおける非ヒトのTSEの潜伏期間は、困難な負の結果の解釈を行う通常のマウスの寿命を越えて延びることができる。非ヒト霊長類は、ヒト種の壁を研究するためのプロキシとして使用されてきたが、これらの研究は、ヒト宿主に進むように、他の動物実験の種類、非ヒト霊長類と同様の課題を正確疾患を再現しない可能性をはらんでいる。 動物のバイオアッセイは、東証への種の感受性を測定するための「ゴールドスタンダード」方式のままであるが、障害物、コストとこれらの生きた動物研究の倫理は、代替案調査を強要している。 PrPのTSEによって播種プロテイナーゼK（PK）耐性状態（PrPの解像度 ）にホストのPrP Cの転換を評価することに基づいて、in vitroアッセイの数は、開発され、TSE種を調査するために使用されているECIES障壁10-12。 インビトロアッセイの例は、無細胞転換アッセイ、タンパク質サイクリック増幅（PMCA）のミスフォールディング、および変換効率率（CER）アッセイ10-14を含む。これらのアッセイのいずれも、自然感染した後、種の壁に関与するアカウント末梢要因を考慮しないが、すべてのTSEのための潜在的に感受性のホストを識別することが有用であり得る。 ここでは、正常な脳ホモジネート由来の2つの変性したPrP C基板をベンチトッププリオン転換反応に使用されるCERアッセイのためのプロトコルは、（ 図1）13 を提示する。 pH7.4で変性した基板中のPrP Cは、種の壁14の非存在下での反応中に播種したPrP TSEによってPrPの解像度に変換することができる。対照的に、pHが3.5で他の基板中のPrP Cの変性は、インキュベーション後のPrP 解像度に変換することができ任意の種からのPrP TSEと、変換のためのコントロールとして機能します。 pH3.5の基板とpH7.4の基板の相対中のPrP resはへのPrP Cの転換の比率は種の壁の尺度を提供する。我々は、CERアッセイは、種々のTSEに実験用マウスの既知の種の壁を予測することが見出されており、慢性消耗病（CWD）にオオツノヒツジ、および他のTSE 14を含む多くの哺乳動物種の種の壁を予測するための努力においてアッセイを使用している15。便利なこの方法論を見つける東証種の壁またはPrP Cから-to-PrPの解像度の変換の評価の迅速なスクリーニングを可能なツールに興味を持って研究者。

<table><tbody><tr><td>12% Bis-Tris SDS-PAGEゲル</td><td>Life Technologies</td><td>NP0342</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mm 酸化ジルコニウムビーズ</td><td>Next Advance</td><td>ZROB05</td><td>他の種類のビーズも効果的です</td></tr><tr><td>抗体</td><td>様々なサプライヤー</td><td></td><td>目的の種からのPrPresのイムノブロット検出に適した一次抗体と二次抗体を選択します</td></tr><tr><td>ビーズホモジナイザー ビーズホモジナイザー</td><td>次へ</td><td>前進 BBY24M</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>369434</td><td>温度制御付き高速</td></tr><tr><td>円錐管</td><td>任意のブランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>綿先端アプリケーター</td><td>Uline</td><td>S-18991</td><td></td></tr><tr><td>カップホーン ソニケーター</td><td>ヒートシステム-超音波</td><td>W-380</td><td>ヒートシステム-超音波 - 超音波株式会社は、Qsonica, LLC</td></tr><tr><td>デンシトメトリーになりましたソフトウェアプログラム</td><td>UVP</td><td>Vision Works LS 画像取得および分析ソフトウェア</td><td>NIH ImageJなどの他のプログラムも機能します</td></tr><tr><td>ドンスホモジナイザー</td><td>キンブルチェイス</td><td>885300</td><td></td></tr><tr><td>エンドオーバーエンドミキサー</td><td>Labnet International</td><td>H5600</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミンテトラ酢酸</td><td>ボストンバイオプロダクツ</td><td>P-770</td><td>有害化学物質:眼の刺激</td></tr><tr><td>グアニジン塩酸塩、8 M</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>24115</td><td>有害化学物質:急性毒性、皮膚刺激性、眼刺激性</td></tr><tr><td>加熱ブロック</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11-718</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>435570</td><td>有害化学物質:強酸</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸リチウムサンプルバッファー、4x</td><td>Life Technologies</td><td>NP0008</td><td>有害化学物質:皮膚&呼吸器刺激、深刻な眼の損傷、可燃性固体</td></tr>メタ<tr><td>ノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A454-4</td><td>危険な化学物質:急性毒性、可燃性液体</td></tr><tr><td>微量遠心チューブ任意の</td><td>ブランド</td><td></td><td></td></tr>ミニ<tr><td>遠心分離機</td><td>Labnetインターナショナル</td><td>C1301N</td><td></td></tr><tr><td>-ラウロイル-サルコシン(サルコシル)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>L-5125</td><td>有害化学物質:急性毒性、皮膚刺激性、眼障害</td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Amresco</td><td>M158</td><td>有害化学物質:皮膚刺激性、眼障害</td></tr><tr><td>SDS-PAGEゲルシステム</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>NuPAGE電気泳動システム</td><td>その他のSDS-PAGEシステムもPCR</td></tr><tr><td>チューブ(低結合)</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-L-C</td><td></td></tr><tr><td>乳棒ホモジナイザー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>03-392-106</td><td></td></tr><tr><td>pH</td><td>メーターSentron</td><td>SI600</td><td></td></tr><tr><td>ポリフッ化ビニル膜</td>ミリ<td>ポア</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼK</td><td>プロメガ</td><td>V3021</td><td>危険な化学物質:皮膚と目の刺激、呼吸器感作、臓器毒性</td></tr><tr><td>SDS-PAGEサンプルの還元剤、10x</td><td>Life Technologies</td><td>NP0009</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>D6750</td><td>有害化学物質:急性毒性</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>28364</td><td>有害化学物質:急性毒性、皮膚刺激、眼障害、可燃性固体</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td>有害化学物質、強塩基</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>各種</td><td>均質化する基質の体積に適したシリンジサイズを使用</td></tr><tr><td>シリンジ針</td>BD <td>Biosciences</td><td>の様々な</td><td></td></tr><tr><td>サーモシェーカー(PCRチューブシェーカー)</td><td>杭州すべてのShengインスツルメンツ</td><td>MS-100</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>バイオベーシック</td><td>77-86-1</td>危険な<td>化学物質:皮膚、目、呼吸器への刺激トリ</td></tr><tr><td>トンX-100</td>インテグ<td>ラケミカルカンパニーT756.30.30</td><td></td>危険な<td>化学物質:急性毒性、眼の刺激</td></tr><tr><td>ボルテクサー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-812</td><td></td></tr></tbody></table>

と伝達性海綿状脳症種の障壁を評価する<em&gt;インビトロ</em&gt;プリオンタンパク質変換アッセイ

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

>jove_content<伝染性海綿状脳症(TSE、プリオン病)の種間感染を理解するための研究は、通常、長くて費用のかかるin vivo動物チャレンジ研究に依存しているという点で挑戦的です。プリオン種のバリアの測定を支援するために、多くのin vitroアッセイが開発されており、それにより動物の使用を減らし、動物バイオアッセイよりも迅速な結果を提供しています。ここでは、Conversion Efficiency Ratio(CER)アッセイと呼ばれる迅速なin vitroプリオン変換アッセイのプロトコールを紹介します。このアッセイでは、感染していない宿主脳由来の細胞プリオンタンパク質(PrPC)をpH 7.4と3.5の両方で変性させ、2つの基質を作製します。pH 7.4の基質をTSE剤とインキュベートすると、プロテイナーゼK(PK)耐性状態に変換するPrPCの量は、TSE剤に対する元の宿主の種バリアによって調節されます。対照的に、pH 3.5基質中のPrPCは、TSE剤によって誤って折り畳まれます。2つの基質中のPK耐性プリオンタンパク質の量を比較することで、宿主の種バリアを評価することができます。CERアッセイが実験用マウスの既知のプリオン種障壁を正しく予測することを示し、例として、ボブキャット(Lynx rufus)がオジロジカ(Odocoileus virginianus)の慢性消耗病病原体に感受性がある可能性があることを示唆するいくつかの予備的な結果を示しています。

CERアッセイの使用の成功は、変換反応に使用される基板のペアの品質に大きく依存する。この理由のために、CER基板対を調製する手順に従い、品質管理イムノブロット（ 図2）を実行すべきである。両基板の場合、アッセイ免疫ブロット法によって10〜25μL。 PrP Cからは、各基板において容易に検出可能であるべきとのPrP Cレベルは、2つの間でほぼ同じでなければなりません。免疫反応は、20kDaの上記主に表示されますが、小さいバンドも明らかである。我々の経験では、より小さなバンドの存在は、種に依存します。低分子量の生成物が認められた場合に、それらの存在は両方の基質ペアで確認すべきである。 それは、そのCER基板はPKで基板を処理することにより（ 図2）内因性プリオンRESから自由であることを確認することが重要です。 PrPの解像度が存在する場合、動物がでsubstに使用レートの調製は、TSE感染または無症状感染...

プリオン病の種間伝播に対する障壁を測定することは困難であり、通常、動物実験や生化学的アッセイを伴います。ここでは、種障壁を予測する能力を持つin vitroプリオンタンパク質変換アッセイを紹介します。

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

本手順の全体的な目的は、生きた動物への接種を行うことなく、伝達性海綿状脳症（TSE）の特定の種に対する種バリアを評価することです。まず、in vitroアッセイに使用するための2種類の変換アッセイ基質を調製します。次に、これらの基質を、テストしたいTSE因子とともにインキュベートします。Proteinase Kで消化した後、サンプルをSDS-PAGEおよび免疫ブロッティングに供します。最終ステップとして、フローサイトメトリーを用いて各基質中のProteinase K耐性PreOnタンパク質の量を測定し、変換効率比（CER）を算出することでこれらの量を比較します。最終的に、CERはテストしたTSEの、基質を調製したホスト種に対する種障壁の指標となります。本アッセイの利点には、低コストであること、実験期間が短いこと、および生体動物を組織サンプルで代替できることが挙げられます。本手法は、野生動物におけるプリオン病の種族障壁に関する知見を得るのに適していますが、その他の任意の種にも適用可能です。一般的に、本手法を初めて行う方は、基質の調製、品質管理、および標準化に苦労することがあります。目的種の健康な非感染脳組織を入手した後、ビーズミルまたは乳鉢と乳棒を用いて、ライシスバッファー中で10% w/vのホモジネートを調製します。その後、シリンジと針を用いてホモジネートをさらに精製し、27Gのシリンジ針で基質を容易に吸引および排出できるまで、徐々にゲージ数を上げた針でホモジナイズします。次に、脳ホモジネートを等量ずつ、ラベルを貼った別々のプラスチック製コニカルチューブに分注し、一方のチューブには3 Mのグアニジン塩酸塩を、もう一方のチューブにはpH 3.5または7.4のXPBSを、脳ホモジネートに対して1:1の容量比で加えます。次に、基質溶液のpH値を確認し、必要に応じて濃塩酸または水酸化ナトリウムを用いて、各基質のpHが目標値の±0.05以内に収まるように調整します。溶液をエンドオーバーエンドミキサーで室温にて5時間回転させます。その後、各コニカルチューブ内の基質溶液に4倍量のメタノールを加えて十分に混合し、タンパク質を沈殿させ、-20°Cで16〜18時間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを4°Cで13,000 Gにて30分間遠心分離し、沈殿させます。その後、上清を注意深くデカンテーションして廃棄し、ペレットからメタノールを蒸発させます。チューブの内壁に付着したメタノールの吸収を助けるために、綿棒を使用してください。ペレットを乾燥させすぎないようにしてください。メタノールが見えなくなったら次のステップに進み、脳ホモジネートの開始材料と同量の変換バッファーを用いてタンパク質ペレットを再懸濁させます。再懸濁後、基質溶液を10秒間短時間ソニケーションします。カップホーンを用いて、最大出力の約30%で超音波処理を行います。次に、各基質中の細胞性プリオンタンパク質がプロテイナーゼK感受性であるはずであるため、溶液をラベル付きの1.5 mLマイクロ遠心チューブに0.5～1 mLずつ分注します。各基質の10～25 µLに、最終濃度100 µg/mLのプロテイナーゼKを加え、サーモシェイカーを用いて37 °C、1000 RPMで1時間消化させます。プロテイナーゼKで消化した基質と、未消化の各基質10～25 µLをロードします。SDS-PAGEを行い、プリオンタンパク質特異的抗体でゲルおよびイムノブロッキングを実施し、宿主プリオンタンパク質、プロテイナーゼK耐性、および未消化タンパク質のレベルを評価します。この画像はイムノブロットの結果を示しています。左側の2つのレーンは未消化の基質であり、右側の2つのレーンはプロテイナーゼKで消化した基質です。pH 7.4および3.5の基質におけるタンパク質レベルの差が概ね10%以内であり、かつプロテアーゼK耐性を示さない場合、その基質ペアはCER研究に使用するのに適切です。他の分注サンプルは、CERアッセイを実施するまで-80°Cで保存してください。TSE病原体は、適切なバイオセーフティ上の予防措置を講じ、施設内のガイドラインに従って取り扱う必要があります。目的の種からTSE感染脳組織を入手した後、基質ペアの調製に用いたホモジナイズ法を用いて、pH 7.4の1×PBSで10% w/vのホモジネートを調製します。得られたホモジネートを0.5 mLマイクロ遠心チューブに100～300 µLずつ分注し、CERアッセイを行うまで-80 °Cで保存した。開始にあたり、pH 3.5および7.4の非感染CER基質、およびPrPSc感染種種液（seed solutions）の同量を氷上に約1時間置いてゆっくりと融解させる。融解後、溶液を氷上に保持したまま、各基質溶液を27ゲージの注射針で吸引および排出して再ホモジナイズする。次に、各TSE感染溶液を、最大出力の約30%で10秒間、短時間超音波処理します。続いて、ラベル付きの低吸着薄壁PCRチューブに、pH 7.4で調製したCER基質95 µLを2本のチューブに、pH 3.5で調製したCER基質95 µLをさらに別の2本のチューブにそれぞれ分注し、変換反応を準備します。次に、pH 7.4および3.5の各基質チューブに、10%TSE感染種子溶液を5 µLずつ加えます。並行して、非特異的な非テンプレート変換をコントロールするため、pH 7.4および3.5のもう一方の各基質チューブに変換バッファーを5 µLずつ加えます。また、インプットのproteinase K耐性プリオン蛋白のコントロールも調製します。テストする各TSE病原体について、コントロールとして、10% TSE感染シード溶液 5 µL を変換バッファー 95 µL に加えます。密閉したPCRチューブに入った各サンプルを短時間ボルテックスし、チューブの底と壁面を混合します。その後、低速の卓上ミニ遠心機で短時間遠心し、PCRチューブの蓋に付着した反応混合物を除去します。PCRチューブに対応したベンチトップサーモシェーカーにチューブをセットし、37 °C、1000 RPMで24時間振盪させます。翌日、最終濃度が2% w/vとなるようにsarco cellを、最終濃度が100 µg/mLとなるようにproteinase Kを加え、サーモシェーカーを用いて37 °C、1000 RPMで1時間サンプルを消化させます。SDS-PAGE用サンプルバッファーを加え、サンプルを95 °Cで10分間加熱し、各サンプルに残存するproteinase K耐性PreOnタンパク質をSDS-PAGEで分離した後、前述と同様に免疫ブロッティングを行います。最後に、種の方壁の指標として変換効率比を算出します。記載されたプロトコルに従い、pH 7.4または3.5で調製したマウスCERアッセイ基質を、マウス適応スクレイピー（RML）、家畜羊の古典的スクレイピー、オジロジカの慢性消耗症、またはハムスター適応スクレイピー（263K株）とともにインキュベートした。CERアッセイにおいて、「none」と表記されたコントロールサンプルには同量の感染剤が含まれており、マウス基質サンプルについては、モノクローナル抗体SAF 83を用いた免疫ブロット法により、プロテアーゼK耐性プリオンタンパク質の有無を解析した。各サンプルの未補正の $\text{tr}_{\text{ic}}$ 値が、各レーンのプロテイナーゼ処理結果の下に表示されています。K耐性プリオン蛋白レベルは、pH 7.4で変性させ、さまざまなTSE因子を接種したマウス基質間で変動しました。pH 3.5で変性させTSE因子を接種したすべての基質においてプロナーゼK耐性プリオン蛋白が検出されましたが、この棒グラフは、少なくとも3回の独立したアッセイ実行に基づいた、各感染因子におけるpH 7.4と3.5のマウス基質間の平均比（±標準偏差）を示しています。小文字は、分散分析を用いてp値0.05未満で判定された統計的に均質なサブセットを示します。Tukey-Kramerの最小有意差法によるものです。習得すれば、適切に実施することでこの手法は48時間以内に完了できます。CERアッセイは、生体動物を用いた追加研究の妥当性を判断、あるいは不要とするための、TSE種の種特異的バリアの存在に関する初期評価として利用可能です。このビデオを視聴することで、基質の調製方法、変換反応の設定方法、および種間障壁を評価するための変換効率比の算出方法について十分に理解することができます。

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Medicine

医学

ここでは、すぐに精製することにより腹腔内接種に従い、蛍光して注射部位からの彼らの取り込みと動きを監視し、これらのイベントを媒介する細胞を特徴づける感染脳材料から集約されたプリオンロッドを標識する免疫細胞によるプリオンの取り込みと人身売買を監視するための新たなアッセイを説明します。...

腹腔内感染後に免疫細胞の人身売買蛍光プリオンロッドの時間を監視

タンパク質のミスフォールディングサイクリック増幅（PMCA）はプリオン変換とひずみと種の壁の研究のためのin...

プリオンのタンパク質のミスフォールディングサイクリック増幅

タンパク質分解酵素とインキュベートして正常なプリオンを消化し、耐性のある凝集体はそのまま残します。...

ウェスタンブロッティングを用いたマウス脳組織におけるミスフォールドプリオンタンパク質凝集体の検出

スカベンジャーは無病領域に糞中の感染伝達性海綿状脳症プリオンを移動させる可能性を持っている。私たちはマウス適応スクレイピープリオンはアメリカのカラスの消化管（ アメリカガラス ）、死んだ動物の共通の消費者も通過した後、感染のままかどうかを判断するために使用される詳細な方法。...

鳥類の消化器系を通過した後の感染プリオンを識別するための手順

プリオン様のタンパク質凝集体の伝播は、最近、多くの神経変性疾患に関与していることが明らかになりました。このプロトコルの目標は、線虫C.エレガンスをモデルシステムとして使用して、タンパク質の拡散を監視し、プリオン様現象を調査する方法を説明することです。...

拡散とプリオン様タンパク質の毒性は後生動物モデル生物を用いて調査<em&gt; C。エレガンス</em

このプロトコルでは、出芽酵母でタンパク質に基づく継承のため画面の機能的に高スループット方法論について説明します。...

出芽酵母におけるタンパク質ベース継承の高速スクリーニング

ここでは、単純な高速かつ効率的なプリオンの増幅技術、リアルタイムで揺れる誘起変換 (RT QuIC) メソッドを記述するプロトコルを提案する.

リアルタイム揺れる誘起変換用糞便材料の CWD プリオンの検出

免疫組織化学プロトコルを使用して異常なプリオンタンパク質を免疫標識するには、特定のサンプルおよび抗PrP抗体調製方法が必要です。本プロトコルは、適切なPrP免疫標識を確保し、非特異的バックグラウンド染色を最小限に抑えるためのエピトープデマスキングの重要なステップを説明しています。また、このアプローチは、プリオン感染組織を用いて免疫組織化学研究を行う際のバイオセーフティ対策を考慮する。...

免疫組織化学による異常プリオンタンパク質の検出

実験室で一般的に使用される領域をプリオン汚染と効果的な除染のために評価する方法が不足しています。ここで説明するプロトコルは、特定のラボの個々のニーズに合わせて簡単に変更できるラボプリオン安全性スワイプテストを実装するための重要な基本を提供します。...

プリオン安全研究所 スワイプ試験

我々は、神経内分泌機能と遅延の長期的、誇張された恐怖反応、PTSD患者の特性に永続的な変化を明らかにする心的外傷後ストレス障害（PTSD）のラットモデルを記述します。動物モデルとここで説明する方法は、機械論的であるが、末梢白血細胞におけるバイオマーカーと、患者で測定することができない脳核中のバイオマーカー、缶を相関させるために有用である。...

PTSDの、ニューラル血液学的および行動的相関関係を明らかにするための動物モデルにおけるバイオマーカー

学ぶ、伝達性海綿状脳症の種間障壁を評価するインビトロプリオンタンパク質変換アッセイ。CERを用いて動物実験なしに種間伝播リスクを定量化し、神経変性疾患研究の倫理的代替法として活用できます。

と伝達性海綿状脳症種の障壁を評価する

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