根神経節ニューロンと差別化された脂肪由来幹細胞を背：インビトロ共培養モデル

この手順の全体的な目標は、in vitro神経再生を研究するための脂肪由来幹細胞および後根神経節またはDRGニューロン共培養を設定することです。これは、まずラットの脂肪組織から未分化脂肪由来の幹細胞を得ることによって達成されます。2番目のステップでは、成長因子のカクテルを使用して、細胞をシュワン様細胞に分化させます。

次に、ラットの脊髄からDRGニューロンを採取し、最終ステップで結合させ、ニューロンを分化した幹細胞に装着してin vitro共培養システムを生成します。最終的に、細胞は神経突起の成長を促進するためにニューロンマーカーとグリアマーカーについて染色され、定量化され、形態学的評価のために走査型電子顕微鏡によって画像化されます。この方法は、再生医療分野のさまざまな質問に答えるのに役立ちます。たとえば、右幹細胞がさまざまな生体材料上の有機ニューロンとどのように相互作用しますか?

この方法のデモンストレーションが重要である理由は、アクセス性が低く、組織のサイズが小さいために習得が困難な手順を含むため、重要です 生物学的キャビネット内。はさみと滅菌カミソリの刃を使用して、成体のオスのスプロドリーラットから採取した内臓脂肪と鼠径脂肪を細かく刻むことから始めます。次に、得られた脂肪スラリーを15ミリリットルの新たに調製したフィルターを含むチューブに移し、滅菌したコラゲナーゼタイプ1溶液を滅菌し、チューブを37°Cの水浴に30〜60分間連続的に攪拌します。

組織が完全に解離する前に消化を綿密に停止し、細胞の生存率と収量を改善します。組織の準備ができたら、100ミクロンのセルストレーナーでろ過します。消化が良いと、均一な脂肪の一貫性が得られ、ベージュ色に見え、穏やかな渦巻き模様になります。

FBSを添加した摂氏37度の幹細胞増殖培地15ミリリットルで消化酵素を中和します。次に、細胞をスピンダウンして、間質血管画分を収集します。脂肪の最上層から始めて仰臥位を吸引します。

ピペッティングでペレットを1ミリリットルの赤血球ISIS緩衝液に再懸濁します。1分後、10ミリリットルの新鮮、培地、遠心分離機を再び細胞に加えて溶解を停止します。次に、S上清を慎重に吸引します。

細胞を10ミリリットルの培地に再懸濁し、75平方センチメートルに細胞を播種します。摂氏37度と二酸化炭素5%のフラスコ。細胞がβ、より多くのキャップエタノール、およびレチノイン酸で処理することにより、細胞がシュワン様細胞に分化する準備ができている最初のまたは2番目の継代まで、細胞をサブコンフルエントレベルに維持し、脊髄を採取した後にDRGニューロンを取得します。

まず、背側部分を取り除くことから始め、次に滅菌された鋭利な手術用ハサミを使用して、脊柱を縦軸に沿って半分に分割し、臍帯組織を露出させます。脊柱を胸郭のレベルより下の2つの小さなセグメントに切断し、次に細い鉗子を使用してすべての臍帯組織を静かに取り除きます。運河から直接出ている白いフィラメントのように見えるDRGの根を引っ張って取り除かないように注意してください。

すべてのコア組織が除去されたら、非常に細かい鉗子を使用してDRGルート全体を引っ張り、垂直管の奥深くまで到達し、神経節の根を傷つけないように注意します。DRGを、抗生物質を補給した3〜4ミリリットルのハムF12培地を含む60平方ミリメートルのペットツリー皿に入れます。次に、解剖顕微鏡下で、滅菌鉗子とメスを使用して、神経節を取り巻く余分な神経根を取り除き、衛星細胞の汚染を減らします。

次に、DRGを1.8ミリリットルの新鮮なF12培地を含む35平方ミリメートルのペトリ皿に移し、200マイクロリットルのコラゲナーゼを加えます。タイプ 4 ストック ソリューション。DRGを1時間インキュベートした後、ガラスピペットで培地を慎重に吸引します。

DRGを誤嚥したり損傷したりしないように注意してください。コラゲナーゼステップを繰り返し、DRGをF 12培地で洗浄します。2回目の洗浄後、1.8ミリリットルのF 12培地と200マイクロリットルのトリプシンを細胞に加えます。

トリプシンを除去し、酵素反応を止めるためにFBSの500マイクロリットルを補充した媒体の1ミリリットルを追加します。次に、培地を吸引し、DRGをF 12培地で3回優しく洗浄して、血清の痕跡をすべて取り除きます。次に、細胞に2ミリリットルの新鮮なF 12培地を供給し、ガラスピペットを使用して細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに慎重に移します。

ピペットを8〜10回上下させてニューロンを穏やかに解離させ、口蓋が落ち着いたらチューブの底に口蓋が蓄積するのを待ちます。すり酸を新しいチューブに移し、2ミリリットルの新鮮なF 12培地を口蓋に加えます。機械的解離と懸濁液への媒体の移動を繰り返すと、均一になります。

次に、細胞懸濁液を3〜4回再評価し、続いて得られた均質化された懸濁液を100ミクロンの細胞ストレーナーを介して新しい50ミリリットルチューブにろ過します。15ミリリットルのチューブで細胞を遠心分離し、ゆっくりと回転させながら、調製したばかりのピペットで回転させます。15ミリリットルのチューブの内側に15%のウシ血清アルブミンを注入し、45度の角度で保持して緩やかなタンパク質の痕跡を作ります。

チューブの数字をフォーミングトラックの基準として使用し、細胞からスナットを吸引し、最後の500マイクロリットルを蘇生のために保存し、ペレットを懸濁し、タンパク質トレイルに沿って細胞を新しいチューブにゆっくりと分注します。細胞をスピンダウンした後、再度、ペレットを1ミリリットルの改変BS培地に再懸濁し、少量の培地に細胞を播種します。24ウェルプレートに2時間、細胞が付着したら、解離後の神経成長因子のミリリットルあたり15ナノグラムを補充した新鮮なBS培地を追加します。

DRG細胞は、プレシード細胞の上に播種することにより、白鳥細胞様脂肪幹細胞との共培養にも使用できます。これらの画像は、ポリカプロラクトンフィルムを基質として使用した共培養モデルにおけるDRG神経突起発芽のためのシュワン細胞様脂肪幹細胞の重要性を示しています。白鳥細胞様脂肪幹細胞の非存在下では、未処理の表面には神経突起は観察されませんでしたが、共培養系では神経突起の形成が明らかに改善されました。

平均して、細胞体あたりの神経突起の数は、幹細胞の存在下で大幅に増加します。実際、これらの画像が示すように、DRGニューロンがニューロンを発芽させる能力は、黄色の矢印のバラで示されているように、分化した幹細胞と優先的に関連して発生します。したがって、このビデオを見た後、lib派生幹細胞を取得し、DGenニューロンを解離することができるはずです。

しかし、また、末梢の平均変性を研究するためのモデルを設定することができるはずです。