マウスにおける安定な高レベルの骨髄キメラ現象を生成するための骨髄抑制剤としてブスルファン

本手順の目的は、レシピエントマウスの骨髄区画を、緑色蛍光タンパク質を普遍的に発現するドナーマウス由来の骨髄細胞に置換することである。これは放射線照射を用いずに行われる。まず、骨髄抑制剤であるブスルファンを腹腔内に連続的に投与し、レシピエントマウスをコンディショニングすることで達成される。

次に、緑色蛍光タンパク質を全身に発現しているドナーマウスの大腿骨および脛骨から骨髄細胞を単離します。最後に、ドナーの骨髄細胞を尾静脈注射により、前処置を施したレシピエントマウスに移植します。最終的に、移植後のマウスから血液を採取し、フローサイトメトリーで解析することで、骨髄キメラの形成率を推定します。

全身照射などの既存の手法と比較して、本手法の主な利点は、全身照射による細胞毒性作用を伴わずに、また専用の施設や設備を必要とせずに、高度な骨髄キメラを樹立できる点にあります。この方法は、骨髄由来細胞の中枢神経系への蓄積に関する知見をもたらすだけでなく、造血系譜の発達、免疫生物学、白血病などの研究テーマの解析にも利用可能です。レシピエントマウスをコンディショニングするために、テキストプロトコルに従って希釈したブスルファンを調製し、レシピエントマウスに1日あたり20 mg/kgを腹腔内投与（IP injection）してください。

施設指針に従ってマウスを安楽死させた後、ラミナーフローフードの下で、マウスに70% ethanolをスプレーします。腹部の皮膚をかき上げ、外科用ハサミを用いて、腹腔から足首に向かって脚の皮膚を切開します。この際、足を持って固定してください。足首から股関節に向かって皮膚をしっかりと引っ張り、脚の組織を露出させます。

足先を軽く引っ張りながら、大腿骨から筋肉と脂肪を取り除き、股関節を露出させます。脚を伸展させるには、はさみを骨盤に押し当て、大腿骨頭の直上で切断しますが、大腿骨自体を切らないように注意してください。無菌状態を維持するため、足先を持って脚を固定し、はさみを用いて大腿骨に残っている組織を掃除し、オートクレーブ済みの組織を用いて骨表面を擦って清浄にします。

膝関節を切断して大腿骨と脛骨を分離し、大腿骨をPBSを含む培養皿に入れ、氷上で静置します。次に、腓骨が脛骨に接続している部位を切断し、腓骨を取り除いて廃棄します。その後、脛骨を洗浄します。

赤色骨髄が終わる位置の脛骨を切断して足を切り離し、脛骨を大腿骨と共に培養皿に入れ、氷上でインキュベートします。ピンセットで大腿骨を固定し、外科用はさみを用いて、骨の遠位端を慎重に削ります。3 mLの滅菌PBSを用いて髄腔を露出させるため、必要最小限の骨を削り取ります。

シリンジに充填し、23ゲージの針を取り付けます。注意深く針を髄腔に刺入し、骨髄を滅菌培養皿に洗い出します。抽出後、目的の細胞を完全に取り出すため、針先を用いて髄腔内を掻き出してください。

赤色骨髄が見えなくなり、骨が白色に見えることを確認します。ピンセットで脛骨を固定し、外科用ハサミを用いて、脛骨が膝に付着していた端の部分を慎重に削り取ります。髄腔を露出させるため、シリンジに3 mLの滅菌PBSを満たし、25Gの針を装着します。

針を骨髄腔に慎重に刺し、骨髄を大腿骨から回収した骨髄をまとめたディッシュの中に洗い出します。1 mLのピペットチップを用いて、細胞を分散させるために骨髄を穏やかにトリチュレーションします。細胞懸濁液を40 µmのバスケットフィルターに通し、滅菌済みの50 mL遠心チューブに回収します。

PBSを用いてディッシュを洗浄して残っている細胞を回収し、フィルターを通して遠心分離チューブにバッファーを移します。チューブにPBSを加え、最終容量を30〜40 mLにして、450 ×g、4 °Cで5分間遠心分離します。その後、上清を取り除いて廃棄します。

ペレットを3 mLのエリスロサイト溶血バッファーで再懸濁し、氷上で8.5分間インキュベートします。続いて、溶血バッファーを停止させるために滅菌PBSを約30 mL加え、遠心分離して上清を捨てます。滅菌PBSを1 mL用いてペレットを再懸濁し、氷上で保持します。

PBSを用いて少量の細胞ホモジネートを希釈し、血球計数器を用いて細胞数を計測します。細胞懸濁液を 8 × 10⁶ cells/mL に希釈し、注入まで氷上で静置します。骨髄移植を行うため、希釈した細胞懸濁液 300 µL を 0.5 mL シリンジに加えます。

注入するマウスごとに、必ず気泡を取り除いてください。処置済みのレシピエントマウスが入ったケージをヒーティングパッドの上に置き、尾側静脈を拡張させます。レシピエントマウスを適切なサイズの保定装置に入れ、70% ethanolを浸した外科用ガーゼで尾を拭き、尾をしっかりと保持します。針の斜面を上に向け、尾側静脈のいずれかに慎重に針を挿入し、細胞懸濁液を注入します。

止血するまで、注射部位に外科用ガーゼを当てます。骨髄移植から約2〜3週間後、マウスを新しい清潔なケージに移す前に、マウスを拘束管に入れ、後肢の被毛を剃って外側伏在静脈を露出させます。次に、肢に薄くワセリンを塗り、25ゲージの針を使用して、ヘパリンコーティングされた毛細管で伏在静脈を穿刺します。

約50 µLの血液を採取し、外科用ガーゼを用いて止血します。止血後、マウスをケージに戻します。採取した血液を、1 mLのfax bufferを含むマイクロ遠心チューブに加えます。

チューブを転倒混和し、氷上で保持した後、血液サンプルを 900 ×g で5分間遠心分離します。上清を除去して廃棄し、500 µL の赤血球溶解バッファーを用いてペレットを再懸濁し、氷上で8.5分間インキュベートします。その後、1 mL の FACS バッファーを加えて溶解バッファーをクエンチし、900 ×g で5分間遠心分離します。

テキストプロトコルに従って、2回目の溶解および遠心分離を行った後、ペレットが白色になっているか確認します。もし赤色である場合は、溶解ステップを3回繰り返してください。ペレットをfaxバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーを用いてGFP陽性細胞の割合を定量します。

このグラフは、100 mg/kgのブサラールでコンディショニングし、同系骨髄移植に成功したマウスと、80 mg/kgのブサラールでコンディショニングし、同種骨髄移植に失敗したマウスの末梢血において、毎週定量したキメラ率を示しています。通常、キメラ率は骨髄移植後3〜4週間で80%以上に達します。ここに示されているのは、骨髄移植から3週間後の、骨髄移植の成功および失敗を示す末梢血の代表的なデータです。このフローサイトメトリーのデータは、骨髄において高いレベルのキメラ状態が少なくとも1年間維持されること、およびビークルによるコンディショニングでは骨髄キメラを誘導するのに不十分であることを示しています。

ブスルファンを60から100 mg/kgの用量で投与した場合、骨髄キメラの到達レベルに有意な差は見られませんが、GFP陽性細胞は用量依存的に中枢神経系内に蓄積します。この図は、野生型マウスおよび、より顕著な蓄積が見られる筋萎縮性側索硬化症（ALS）の神経変性疾患モデルマウスにおいて、脊髄腰髄領域に蓄積した骨髄由来のGFP陽性細胞を示しています。この手順を実施する際は、移植拒絶の可能性を最小限に抑えるため、同系であり、かつ同性のレシピエントマウスとドナーマウスを使用することが重要です。

骨髄由来細胞が中枢神経系に進入するメカニズムを研究するために、フローサイトメトリーや免疫組織化学などの他の手法を利用することができます。