不可逆とリバーシブル片側尿管閉塞のマウスモデル

このビデオでは、片側性尿管閉塞によって誘発される閉塞性ニューロパチーのマウスモデルを提示します。このモデルは不可逆的または可逆的に設定することが可能です。また、その結果生じる構造的損傷と、閉塞解除後の回復を示す組織学的データについても提示します。この模式図は、本モデルの主要な手順を示しています。ここでは、左腎臓、尿管、および膀胱が示されています。

標準的な片側尿管閉塞は、尿管を結紮することによって誘導されます。時間の経過とともに尿管は拡張し、腎臓は水腎症となります。可逆的な片側尿管閉塞を行うには、膀胱に近い尿管を結紮し、閉塞部位の尿管の周囲に灰色で示されている軟質プラスチックチューブを装着します。

過度な尿管拡張を制限するため、腎臓を時間をかけて水腎症の状態にし、その後、研究に適した時点で閉塞を解除します。本実験では7日目に、ソフトウォールチューブを取り除き、結紮部位の直上で尿管を切断します。閉塞が解除された尿管を膀胱に吻合して尿の流れを確保し、通常、数日かけて腎臓の圧が低下します。

UUOと呼ばれる片側尿管結紮モデルは、閉塞性腎症後の組織損傷および線維化の進行を研究するために利用できます。RUUOと略される可逆的尿管結紮モデルは、損傷後に起こりうる組織リモデリングに関する知見を得るために利用できます。ここでは、UUOおよびRUUOの両方の手順を組み込んだ典型的な実験例を示します。

0日目にマウスにUULを施し、その7日後に処置を行います。マウスを安楽死させて損傷レベルを評価するか、または尿管の閉塞を解除してRUURを実施します。その後、組織を採取するまで7日間、腎臓を減圧させます。

組織において、構造的損傷、マクロファージの浸潤、筋線維芽細胞の蓄積、および線維化を評価できます。以下は一般的な外科的セットアップです。この処置は、滅菌された手術領域内に配置された、オートクレーブ滅菌済みの器具および消耗品を用いて行われます。

複数の動物を処置する場合は、処置の間にビーズステリライザーで器具を滅菌するか、各処置ごとに新しい器具セットを使用してください。術者は滅菌ガウン、マスク、帽子、および手袋を着用します。この8週齢のC57BL/6雄マウスには、ケタミン、塩酸塩、およびキシラジンを腹腔内投与して麻酔をかけています。

足指へのピンチ刺激に対する反応の消失により、麻酔深度を確認した。手術部位は除毛し、希釈したクロルヘキシジン溶液を用いて消毒した。角膜の乾燥を防ぐため、眼潤滑剤を塗布した。

鎮痛剤の塩酸ブプレノルフィンを皮下注射で投与しました。マウスを滅菌ドレープを敷いた加温手術用パッドの上に配置し、組織分離用鋏を用いて肢を固定した後、正中線腹開術を行い、無血管の直線的な肘に沿って切開を加えます。次の章では、不可逆的なUUOAの手順について詳述します。切開部にcalibraリトラクターを挿入し、マウスを滅菌ドレープで覆います。

腸管を移動させ、滅菌湿潤ガーゼで覆い、左尿管を露出させます。角度付き鉗子を用いて尿管を露出し、単離して閉塞を誘導します。6-0の黒色編み絹縫合糸を用いて、尿管を2箇所結紮します。

尿管は、膀胱から腎盂までの間のどこででも閉塞させることが可能です。その後、縫合糸の間で尿管を切断します。次の章では、可逆的な尿管閉塞を行う方法について詳しく説明します。

これはRUULの第1段階である。角度付き鉗子を用いて尿管を露出および単離し、閉塞を誘導する。6.0の黒色編み絹糸を用いて尿管を2箇所結紮する。

膀胱への吻合に適した長さの尿管を確保するため、尿管の閉塞は膀胱に近い位置で行う必要があります。復元処置において、縫合糸を切り揃えますが、後の工程で使用するため1本は長く残しておき、約5 mmの長さのソフトウォールプラスチックチューブを切り出します。次に、尿管に装着できるように、チューブを広げられるよう縦方向に切り込みを入れます。

軟質壁プラスチックチューブの内径は1 mm、外径は2 mmのものを使用してください。この軟質壁プラスチックチューブを尿管の周囲に慎重に配置し、チューブを閉じたときに長い縫合糸がスリットの中央から出ていることを確認します。次に、6-0の黒色編組シルク縫合糸をチューブに回して結びます。

次に、チューブの中央から出ている長い縫合糸を、次の結紮に組み込みます。これにより、尿管とチューブを確実に固定します。尿管の周囲に配置したチューブは、UUOおよびRUUOの両処置の終末期において、尿管が過度に拡張するのを防ぎます。

腸を元の位置に戻し、腹膜を縫合した後、皮膚を金属クリップで閉鎖します。また、手術部位にヨウ素を塗布します。アマジンを皮下注射し、麻酔を部分的に覚醒させます。

塩酸塩および液体を、加温した生理食塩水1 mLを用いて皮下注射します。マウスは意識が回復するまで観察し、その後、29 °Cに保たれたヒートボックス内で24時間回復させます。尿管閉塞後の数日間で、腎臓に水腎症が生じます。

マウスは、傷害相のさまざまな時点、または閉塞解除後に安楽死させることができます。次の章では、RUUO処置の第2段階である閉塞解除の実施方法について詳しく説明します。マウスへの麻酔および準備は、前述の方法で行います。

金属製の皮膚クリップを取り除き、開腹術を行います。腹膜の縫合糸を取り除き、ラット用歯状鉗子で腹膜を慎重に開きます。次にマウスを準備し、前述の方法に従って角度付き鉗子を用いて左尿管を露出させます。

尿管と軟質壁プラスチックチューブを周囲の組織から分離します。軟質壁チューブを固定している縫合糸をメスで切断し、取り除きます。続いて軟質壁プラスチックチューブを慎重に除去すると、尿管の拡張が確認できます。

尿管は閉塞部位において脆弱であり、本動画のように閉塞部より上側で断裂することがよくあります。しかし、UUOの第1段階で膀胱近くに配置された縫合糸は維持されるため、膀胱から腹腔内へ尿が漏出することはありません。以前に閉塞していた尿管から排出される尿沈渣を回収するため、尿管の下に滅菌ガーゼを配置します。

尿管の閉塞を解除した後、尿管腔内のデブリが完全に取り除かれたことを確認するため、透明な尿が排出されるまで排液させます。尿管と腎盂の排液が完了したら、尿管の末端に6-0の黒色編み込みシルク縫合糸を掛けます。これは、その後の尿管膀胱吻合術を補助するために使用します。

その後、尿管を元の位置よりも前方に移動させ、腎臓の上に配置します。尿管の末端に、単一のナノポリアミドモノフィラメントTA縫合糸を留置します。この際、縫合糸が筋層にとどまり、尿管腔内に入らないよう注意を払います。

縫合糸は、後に尿管を膀胱に固定するために使用します。膀胱を吻合の準備に合わせるため、21ゲージの針を膀胱に斜めに刺して、膀胱内に管を形成します。次に、この21ゲージの針を用いて、アイニードルを膀胱に通します。あらかじめ尿管に留置しておいたNino縫合糸を、膀胱の最初の切開口から通し、尿管を膀胱内に通すため、刺入点に隣接した膀胱壁から外へ引き出します。

尿管の末端に配置した6-0の長い縫合糸を、針穴に通します。次に、尿管も一緒に膀胱内に引き込まれるように注意しながら、針をゆっくりと膀胱から引き抜きます。尿管が膀胱内に位置したところで、尿管を確実に固定するために、尿管と膀胱壁に配置したナノ縫合糸を結束して固定します。

2本目のotax縫合糸を配置します。これも同様に尿管に通し、筋層内に留まっていることを確認してから、膀胱の切開部を通り、膀胱壁から外へ出します。その後、同様の方法で結紮します。

さらに、膀胱の後方に3本目のナノタックス縫合糸を配置します。次に、開いた鋏の背面を使用して膀胱壁をわずかに押し戻し、尿管の長さを露出させます。その後、肺縫合部の上の尿管を切断します。

その後、塗布した尿管を斜めに膀胱内へ後退させます。尿管が完全に膀胱内に後退していることを確認するため、4つのチップを使用します。最後に、膀胱の出口の傷口を9-0ポリアミドモノフィラメント縫合糸で閉鎖します。閉鎖前に、尿管が膀胱内にしっかりと固定されていることを確認してください。

前述のとおり腹膜と皮膚を縫合し、前述のとおり術後ケアを行う。本研究では、閉塞解除後の腎臓を減圧させるため、すべてのUUOマウスを7日間回復させたが、より早いまたは遅い時点での検討も可能である。次に、閉塞した腎臓および閉塞解除後の腎臓の外見と、それに伴う損傷を示すデータを提示する。

この図は、正常な腎臓と比較した、U-U-L-U-U-Oにおける腎臓、腎盂、および尿管の外観を示している。7日間閉塞させたUUO腎は、水腎症の状態となり、色が蒼白に見える。閉塞解除から7日後、RUO腎は減圧され、腎盂と尿管は正常な腎臓と同等のサイズと色に戻っている。

IUOの尿管は、脱構築の手法および膀胱への吻合のため、UUOおよび正常腎臓の尿管よりも短くなっていることに留意してください。この図は、正常腎、UUO腎、およびRUUO腎から得られたH&E染色腎臓切片の代表的な画像を示しています。正常腎の健全な間質は、緻密で健全な尿細管の横断面で構成されています。

黒い矢印で示された多くの尿細管が、7日目に劇的な拡張を示しています。対照群のQUL後とは対照的に、UULの解除から7日後には、この拡張が著しく軽減しています。ここで提示する閉塞性腎症のマウスモデルは、不可逆的または可逆的な片側尿管結紮によって誘導されます。

ここで詳述する可逆的モデルでは、尿管閉塞を解除し、尿管と膀胱を吻合させることで、尿流を完全に回復させることができます。その結果、腎臓の減圧が可能となり、損傷後実験における組織リモデリングの研究が行えます。不可逆的および可逆的な両方の閉塞性腎症モデルを組み合わせることで、疾患プロセスや、治療的介入が損傷の進展およびその後の組織リモデリングをどのように調節するかについて、強力な知見を研究者に提供します。