三次元の全層皮膚等価物と自動傷つけ処理の発生

この手順の全体的な目標は、天然の皮膚に似た3次元の全層皮膚同等物を構築し、自動創傷装置を使用して無菌条件下で正確で再現性のある創傷を生成することです。これは、最初に一次ヒト真皮線維芽細胞をコラーゲン1ハイドロゲルに埋め込むことによって達成されます。次に、初代ヒト表皮ケラチノサイトがフィブロネクチン被覆ヒドロゲルの上部に着座します。

次に、モデルを水中条件下で培養し、次に気液界面下で、真皮成分と多層表皮からなる3次元の全層皮膚相当物が形成されます。最後に、標準化された創傷が無菌環境で生成されます。最終的に、免疫組織化学染色と顕微鏡検査を使用して、負傷した全層皮膚当量の組織学的構造を評価します。

この手法の主な利点は、例えば動物モデルのような既存の方法であり、全層の皮膚相当物がヒトの初代細胞で構成されていることです。したがって、自動創傷装置と一緒に、標準化された創傷を生成することができます。したがって、自動創傷装置は、人間化された環境での皮膚創傷治癒プロセスについての洞察を提供することができます。また、骨組織工学などのシステムにも適用できます。

この方法は、生物学的プロセス、基礎となる皮膚修復、表皮と真皮の成分間の細胞クロストークなど、創傷治癒の重要な質問に答えるのに役立ちます。まず、コラーゲンを0.1%酢酸で最終濃度6ミリグラム/ミリリットルまで溶解します。232.5ミリリットルの2つのX dmm、7.5ミリリットルのFCS、7.5ミリリットルの3モルヒース、および2.5ミリリットルの5ミリリットル/ミリリットル/ミリリットルを混合してゲル中和溶液を調製します。

コンドロイチン硫酸は、24ウェルプレートのウェルに挿入し、ヒト真皮線維芽細胞またはHDFSを分離し、細胞懸濁液を5分間遠心分離します。270 Gで、細胞をカウントし、1、200、000 HDFのEloquaを5分間遠心分離します。270 Gでスナットを取り外し、4ミリリットルの冷却ゲル中和溶液を使用して、気泡を引き起こさずにHDFを慎重に再懸濁します。

次に、溶液を8ミリリットルのコラーゲン溶液で再懸濁します。次に、マルチステップピペットを使用して、各インサートに500マイクロリットルのコラーゲン細胞混合物を追加します。24ウェルプレートで、ゲルを摂氏37度と二酸化炭素5%で20分間インキュベートし、ゲルが固化します。

次に、ウェルごとに2ミリリットルのDMMと10%FCSを使用します。ゲルを沈めるには、ゲルを24時間インキュベートします。超純水を使用して、ヒトフィブロネクチンタンパク質を最終濃度50マイクログラム/ミリリットルまで溶解します。

真皮相当のゲルを24時間インキュベートした後、培地を取り出します。25マイクロリットルのフィブロネクチン溶液を使用して各皮膚相当物を覆い、ゲルを30分間インキュベートします。その間に、人間の表皮、ケラチノサイトまたはHKSをkgm 2プラス5%FCSで再懸濁し、各ゲルの上に100,000個のシード、100,000個のヒークを最終濃度にします。

次に、ゲルを45分間インキュベートして、kgm 2 readyと5%FCSを使用して細胞を接着させ、細胞を浸し、インキュベーションを続けます。2〜3日間インキュベートした後、培地を2%FCSに交換し、2〜3日後にFCSなしで培地を交換します。7日目、媒体を完全に取り除きます。

滅菌鉗子を使用して、各インサートを6ウェルプレートの1ウェルに配置します。次に、ウェルごとに1.5ミリリットルの空輸媒体を追加します。FTSCの表面を濡らさないように注意してください。

さらに14日間、2〜3日ごとに媒体を交換します。70%エタノールと紫外線を使用して自動巻線装置を準備し、滅菌鉗子を使用して作業領域を消毒します。皮膚同等物をオートクレーブサンプルキャリアプレートの指定された領域に配置します。

サンプルキャリアプレートをドリルヘッドの下のソケットに配置します。制御ソフトウェアを使用して、次のように巻線パラメータを設定します。スピン速度 15 、 000 RPM の浸透、 1.5 ミリメートル。

推進力100ヘルツ。巻線パラメータを自動巻線装置に移します。完了したら、負傷手順を開始します。

サンプルキャリアプレートをソケットから取り外し、滅菌鉗子を使用して、負傷したFTSEを培養に使用したインサートに戻します。実験的評価まで、負傷したFTSEをインキュベートします。彼の組織学的分析には、いつでもモデルを使用してください。

単離されたHDFSおよびHKSは、FTSEに使用する前に免疫組織化学的染色によって特徴付けられました。HDFは、線維芽細胞の初代HEKが高発現早期分化タンパク質CYTOKERATIN 14のマーカーであるメントンに陽性ですが、後期ケラチノサイト分化タンパク質CYTOKERATIN 10はほとんど陽性ではありません。FTSEは、水中培地条件下で7日間培養され、続いて空気液体界面で14日間培養されました。

このプロセスでは、FTSCは21日以内に大幅に縮小します。HEKは、モデルの表面が空気にさらされるように中レベルを変更することによって増殖しています。また、カルシウム濃度を上げることで、HKSは刺激され、ケラチノサイトのいくつかの重要な細胞層で構成される多細胞表皮に分化します。

D分化と角膜心房の異なる状態。FTSEのヘマチン染色とエオシン染色を天然のヒト皮膚と比較すると、FTSEが皮膚の組織学的構造を模倣していることが明らかになります。コラーゲンワンハイドロゲル中のHDFは、ビメンチンに対する一次抗体で染色することができます。

また、ケラチノサイトは、サイトケラチン14陽性細胞と遅延分化マーカーからなる表皮層を形成します。サイトケラチン10は、スーパー基底層に発現しています。さらに、St.Stratum corniumは、その開発後、RINにプラスです。

この技術は、皮膚科学の分野の研究者が皮膚創傷治癒と、人間の皮膚を厳密に模倣した標準化されたin vitroセットアップを探求する道を開きました。