Name: 生きている人間の目で圧力上昇を小柱網の対応 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 学ぶ、生きた人間の眼における急性眼圧上昇に対する線維柱帯の形態応答を定量化する方法。光干渉断層撮影を用いて、線維柱帯のシュレム管への移動を測定し、緑内障治療の理解に貢献する。

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国立衛生研究所の契約R01-EY13178、P30-EY08098(メリーランド州ベセスダ)、Eye and Ear Foundation(ペンシルベニア州ピッツバーグ)、およびResearch to Prevent Blindness(ニューヨーク州ニューヨーク)からの無制限の助成金によって部分的にサポートされています。

倫理声明：対象の募集が開始される前に承認が医学のピッツバーグ大学の学校の治験審査委員会から入手しました。すべての被験者は研究への参加の前に書面によるインフォームドコンセントを提供しました。 1.データ集録<ol><li>圧力標高<ol><li>眼に0.5％のプロパラカインを一滴点眼することにより、ベースライン測定値（IOPとOCTの測定値）を取ります。有効性のために3分を待ちます。 </li><li>ゆっくり眼底血圧計、コホート1で30グラム、および5で、時間強膜に圧力を適用し、次のようにコホート2の10グラムは、その後、所望の（IOPおよび10月）の測定値を取ります<ol><li> IOP測定<ol><li>ベースラインIOPを測定します。 1.1節で説明したように圧力を上昇させます。 </li><li>コホート1では、0.5％のプロパラカインを一滴を植え付ける効果について3分を可能にし、強膜に圧力の30グラムを適用します。圧力が印加されている間、次のmanufa眼圧計を用いてIOPを測定しますcturerの指示。 </li><li>コホート2においては、0.5％のプロパラカインを一滴を植え付ける効果について3分を許可し、眼底血圧計を使用して強膜圧力の5グラムを適用します。製造者の指示に従って眼圧計を使用して、圧力上昇時にIOPを測定します。 <ol><li> 5gの測定後5分待ってください。 </li><li>眼底血圧計によって強膜圧力の10グラムを適用し、製造者の指示に従って眼圧計を使用して、圧力上昇時にIOPを測定します。研究レコードにIOP、条件（ すなわち、ベースラインまたは10グラム）を記録。 </li></ol></li></ol></li><li> 10月スキャン<ol><li> 10月スキャナの被写体を固定します。新しい主題のために患者の人口統計学的データを入力するか、または以前にスキャン対象のため10月データベースから人口統計データをリコール。 </li><li>前部512×128スキャンプロトコルを選択します。映像ウィンドウに目を中央に配置します。スキャナとの間の距離を減少させます眼角膜断面画像は、スキャンウィンドウに表示されるまで、 </li><li>口頭のコマンドを使用すると、鼻の方向に患者視線を向けることによって、スキャンウィンドウの中心に時間的な輪部を配置します</li><li>ベースラインスキャンを取得し、品質のスキャンを確認します。許容可能な場合は、保存して、許容できない場合は、この手順を繰り返します。 <ol><li>そこには点滅していない、との角度は、画像のエッジから離れて漂流または上部に反転することなく、ボリューム全体で可視化されている場合はスキャンを受け入れます。 </li></ol></li><li> 、0.5％のプロパラカインを一滴を植え付ける有効性について3分を可能にし、1.3.5まで手順1.3.2を繰り返します。 </li><li>コホート1は、眼底血圧計により強膜圧力を30gを適用し、圧力を印加している間にスキャンを取得します。圧力を除去し、高品質のスキャンを確認します。許容可能な場合は、保存して、許容できない場合は、この手順を繰り返します。 </li><li>コホート2では、ophthalmodynamomにより強膜圧力を5g適用圧力が印加されている間計、及びスキャンを取得します。圧力を除去し、高品質のスキャンを確認します。許容可能な場合は、保存して、許容できない場合は、この手順を繰り返します。 </li><li>目が5グラム圧力摂動から回復することができ、5分待ってください。 </li><li>コホート2では、眼底血圧計により強膜圧力10gを適用し、圧力を印加している間にスキャンを取得します。圧力を除去し、高品質のスキャンを確認します。許容可能な場合は、保存して、許容できない場合は、この手順を繰り返します。 </li><li>研究レコードにスキャン時間、条件（ すなわち、ベースラインまたは10グラム）と場所を記録します。 </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> 2.データ処理<ol><li> OCTに大容量のUSBストレージデバイスを接続します。 OCTの[レコード]メニューから「 エクスポート 」 を選択します。 USBドライブ上のファイルをエクスポートするためのファイルの場所を指定します。 「.zipファイル」オプションの選択を解除します。 SCのために患者名を入力してくださいエクスポートするANS、およびエクスポートするスキャンを選択します。エクスポートを開始します。 </li><li>エクスポートが完了すると、USBドライブをアンマウントし、OCTから削除します。画像処理ワークステーションにエクスポート画像を含む大容量のUSBドライブを接続します。 </li><li>この場合のImageJで画像処理プログラムを起動します。 </li><li>生の画像データをインポートします。ファイルメニューから&quot; - - &gt; [インポート]&gt; [RAWファイル 」 を選択します。 「_cube_raw.img」で終わるUSBドライブから処理するとファイルを選択します。 </li><li>元の画像データが変更されずに保存されるように、新しい名前を使用してインポートファイルを保存します（http://www.ori.dhhs.gov/education/products/RIandImages）。 </li><li>次のようにインポートパラメータを入力し、画像の種類：8ビット、幅：512、高さ：1024、オフセット：0;イメージの数：128。 </li><li>プラグインメニューから&quot;&gt; STACKREG - - &gt;のR egistrationプラグイン 」を選択します。とし、 &quot; リジッドボディを選択&quot;オプション。整列スタックを保存するには、次に&quot; - - &gt;名前を付けて保存]&gt; [TIFFファイル 」 を選択します。 </li><li> &quot; - &gt;フィルタ- &gt;平均3Dプロセス 」プロセスメニューからを選択します。フィルタオプションとしてパラメータX = 1、Y = 1、Z = 1を入力します。二回、この手順を繰り返します。 </li><li>平均スタックを保存する&quot; - - &gt;名前を付けて保存]&gt; [TIFFファイル 」 を選択します。アクティブなスタックのフレーム1に移動し、マウスホイールを回転。 </li><li> 「 プロセス- &gt;ローカルコントラスト（CLAHE）強化」を選択Processingメニューからを。 31、ヒストグラムのビン：256、最大勾配：5、マスク：パラメーター·ブロック·サイズを使用しなし、および「高速」オプションをチェックします。次のフレームに進めるために、右矢印キーを使用します。 </li><li>局所コントラスト（CLAHE）を高める&gt;アクティブなスタックのフレーム2に移動し、PROCESS-を繰り返します。すべてのフレームが造影を持っていたまで繰り返します。 </li><li> &quot; - &gt;名前を付けて保存] - &gt; [TIFFファイル 」 を選択します;造影スタックを保存します。イメージメニューから次に&quot;&gt;サイズ- - &gt;イメージ調整 」 を選択します。 「 アスペクト比を固定 」オプションの選択を解除し、その後、幅を入力します。2048、高さ：1024の値を。 </li><li>イメージメニューから&quot; - - &gt;変形&gt;垂直フリップ画像 」 を選択します。次に、「 分析- &gt;セットスケール 」を選択し分析メニューから。 2048、既知の距離：距離をピクセル単位で入力し4,000、およびピクセル縦横比：1、し、[OK]をクリックします。 1のアスペクト比スタック：校正さ1を保存する&quot; - - &gt;名前を付けて保存]&gt; [TIFFファイル 」 を選択します。 </li><li>視覚的にスキャン内の基準点として機能する独特の血管交差を識別するためにスキャンを検討するために、ゆっくりと、マウスホイールを回転。分析スプレッドシートの画像番号と参照フレーム番号を記録します。 </li><li>第1の測定フレームに移動するには、左矢印キーを15回押します。 「フリーハンドSelectionsRを選択21;ツールバーからツール。 </li><li> SCの中央にマウスを置き、上矢印キーを押します。 SCは、画面をいっぱいになるまで、この手順を繰り返します。 </li><li>マウスで境界線を周回して、手動でセグメントSC。現在の画像フレームのためのコントロール（CTRL）キーを押しながらDを保持します。 Ctrlキーを押しながら、Enterキーを押しM.は、解析スプレッドシートにSC断面積と測定フレーム数の測定を転写。概説エリアの選択を解除します。 3回右矢印キーを押してください。 SCは10フレームで測定されるまで、この手順を繰り返します。 </li><li>第1の測定フレームに戻るには左矢印をキー30回押します。 </li><li>ツールバーから直線セグメントツールを選択します。 </li><li> SC上の最前方に後方-ほとんどの場所から直線を引きます。現在のフレームのみの制御キーを押しながらDを保持します。分析のスプレッドシートへのコントロールキーを押しM.議事録SC長とフレーム番号を保持します。概説エリアの選択を解除します。右矢印キーを押します3回。 SC長がSC断面積と同じ10フレームで測定されるまで、この手順を繰り返します。 </li><li>長さの測定により面積測定を分割して外壁の距離（SC-IOWD）までの平均SC内壁を計算するために、分析のスプレッドシートに式SC-IOWD = SC-CSA /軸方向の長さを挿入します。 </li><li>第1の測定フレームに戻るには左矢印をキー30回押します。 </li><li>ツールバーから直線セグメントツールを選択します。 </li><li>最前方小柱網及び前房の国境にSC上から直線を引きます。ラインが​​境界に垂直であることを確認してください。 M.その後、Ctrlキーを押しDを保持します</li><li> SCの後方最も場所とTMの境界線と前房からの線を引きます。国境に垂直なその行を確認してください。制御した後、[D]を押して、Mを保持します</li><li> SCおよびTMの境界と前室の中心から線を引きます。 LINていることを確認してください国境に垂直な電子。現在のフレームのみの制御キーを押しながらDを保持します。 </li><li>分析スプレッドシートに3 TM厚さ測定およびフレーム番号を転写します。このプレスを3回右矢印キーの操作を行います。 TMの厚さはSC断面積と同じ10フレームで測定されるまで、この手順を繰り返します。 </li></ol>

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<li>Kagemann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IOP+Elevation+Reduces+Schlemm%27s+Canal+Cross-sectional+Area%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmolog+%26+visual+scienc%22%5BJournal%5D)">IOP Elevation Reduces Schlemm's Canal Cross-sectional Area.</a> Investigative ophthalmolog & visual scienc. , (2014).</li>
</ol>

博士シューマンはツァイス社にマサチューセッツ工科大学マサチューセッツ目と耳診療所によってライセンス知的財産のためのロイヤリティを受け取りました

本技術は、SCの崩壊を定量化するため、軟組織の機械的応答の非侵襲的観察を利用しています。ヒト死体の目を使用して、今後の作業は、解剖後の組織のたわみを、実際の組織の剛性を校正するために必要とされます。しかし、このような研究は、以前の流出モデルの同様の制限を受けます。具体的には、組織の緊張に住んでいる筋肉の寄与が存在しないこと。生きている哺乳動物の眼のモデルのさらなる較正は、イメージング及びTMの剛性の直接測定の較正を可能にすることができます。 技術には、いくつかの制限があります。これは、他のOCTプラットフォーム上で実証されていません。文献は、同じ構造が他のOCT装置で可視化することができることを示唆している、しかし、それらのデバイス上の急性IOP上昇に関連した変化に対する感度は、人間の目には実証されていません。追加の光学部品はありませんように、本装置は、利便性の外に使用されました前眼部走査に要します。この作品への最大の課題は、スキャン中のSCの同定です。これは間違いなく、単一のスライス内のSCを特定することは不可能です。ボリュームの尋問は、最初にSCを含む組織の領域を見つけるために...

緑内障は、不可逆的な失明1の世界第二の主要な原因です。上昇した眼内圧（IOP）は緑内障2-7の存在および進行の主要な原因となる危険因子です。 &#160; IOPは、房水8の形成と流出とのバランスによって調節されます。最大の流出抵抗の位置はjuxtacanicular組織とシュレム管（SC）の内壁、SCと小柱網（TM）9-11との間のインタフェースです。 TM剛性はIOPの上昇に直面してSCの崩壊の防止に寄与することができるが、Overby ら 12は、最近でIOPの上昇につながる、細孔の形成を阻害、増加SC内皮硬化をもたらす、緑内障における遺伝子発現が変化することを実証しました緑内障の眼13。 TMの形態および剛性はTを強調し、流出施設14,15と相関します彼は、その生体力学的特性を測定する必要があります。 TMの原子間力顕微鏡の測定は、緑内障（4.0キロパスカル）16のないドナーからの目と比較して、緑内障患者（81キロパスカル）から寄贈された目に上昇した剛性を示しているが、これらの測定は、解剖ex vivoでの組織で行われました。後部TMは、外側lamellatedとcribiform TM 17に挿入縦筋細胞の前方腱を介して毛様体筋に固定されています。毛様体筋（CM）活性が上昇したTM剛性17を模倣する、TMの張りを増大させることができます。平滑筋の摂動により誘導されるSCの崩壊に抵抗の変化を観察する能力は、動物モデル18に示されています。我々は、非侵襲的に画像化する能力に遠位人間の目に住み、スペクトルドメイン光コヒーレンストモグラフィー（OCT）を使用して、SCを含むの主房水流出システムを実証しています&lt;SUP&gt; 19-21。この技術を用いて、我々は、急性IOP上昇22 TMおよびSCの形態学的応答を定量化する能力を実証しました。 本明細書に記載される方法の全体的な目標は、in situで生体組織における急性IOP上昇に住ん流出路の形態学的応答を定量化することでした。この技術は、解剖組織において行わ公開測定と比較して、TM剛性のTM及びCM内の両方収縮繊維活性の寄与を含む、生理学的条件下でTMを検査するという利点を有します。機械TM応答の観察にこの技術を適用することの理論的根拠は、それは我々が今流出抵抗とIOP規制13に直接リンクすることがわかっているTMの機械的挙動にそうでなければ利用できない洞察を提供してくれていることです。全体の剛性、小さなギンザケに対する収縮組織の寄与を識別するために、被験者のRTはなく、かつトロピカミドの投与による平滑筋活動の抑制とを調べました。

<table><tbody><tr><td>スペクトル領域 OCT</td><td>ツァイス</td><td>シーラス</td><td></td></tr><tr><td>イメージングワークステーション</td><td>アップル</td><td>iMac</td><td></td></tr><tr><td>眼鏡計</td><td>Baillairt Matalene 眼鏡計 Surgical instruments CO., Inc.ニューヨーク州</td><td></td><td></td>ニューヨーク</tr><tr><td>画像処理プログラム</td><td>rsb.info.nih.gov/ij</td><td>ImageJ, FIJI</td><td></td></tr></tbody></table>

生きている人間の目で圧力上昇を小柱網の対応

Trabecular Meshwork Response to Pressure Elevation in the Living Human Eye

小柱網（TM）の機械的特性は、流出抵抗及び眼圧（IOP）の調節にリンクされています。この手法の理論的根拠は、急性IOP上昇へのTMの機械的応答の直接観察です。スキャンの前に、IOPはベースライン時とIOP上昇の間に測定されます。輪部は、ベースラインにおけるスペクトルドメイン光コヒーレンストモグラフィーによってスキャンされ、IOP上昇中（眼底血圧計（ODM）30gの力で適用されます）。スキャンは、ImageJのを使用して、房水の流出経路の可視化を強化するために処理されます。血管のランドマークは、ベースライン及びIOP上昇スキャンボリュームにおける対応する位置を識別するために使用されます。シュレム管（SC）断面積（SC-CSA）とその長軸に沿って後方より前方からSCの長さは、SCの1ミリメートルのセグメント内の10箇所に手動で測定されます。平均外壁距離（短軸長）には、その内部で割っSCの面積として計算されます。長軸の長さ。効果IOP上昇に隣接する組織の寄与を調べるために、測定は、トロピカミド点眼と平滑筋の弛緩なしとで繰り返されています。 SCへのTMの移行は、TM剛性によって抵抗されていますが、毛様体内の隣接する平滑筋への取り付けのサポートによって強化されています。この技術は、人間の眼内での生理的条件下で、in situでの圧力上昇に生きているヒトTM応答を測定する最初のものです。

これらのデータ収集及び画像解析技術を用いて、そのようなSC断面積と流出路にIOPにおける大小の変化の影響を形態学的パラメータが得られる（ 図1）。我々は、断面積の大きな減少によって表されるようにIOP上昇の高レベルは、SCの観察可能な崩壊を作り出すことがわかります。眼は、SC-CSA（ 図1）の変化の欠如によって証明されるように、IOPの小さな増加に対応することができるように思われます。これらの結果は、技術は、急性IOPチャレンジに対する流出路の形態学的応答を定量化することが可能であることを示しています。技術や技法の他の家族は、流出路の生体力学に関する視覚的かつ定量的な情報を提供していません。 研究を通して、TM厚の有意な変化は観察されませんでした。 23 mmHgのIOPの上昇に応答して、外壁の内側の距離SCは5.03ミクロンに減少しました。 Withoutと平滑筋活性の抑制には、IOPの6 mmHgの上昇は、外壁の距離に内部SCはそれぞれ0.18ミクロンと2.34ミクロン減少していました。また、ベースラインSC...

シュレム管の空間内に、小柱網（TM）の移行は、眼底血圧計により、急性の圧力上昇によって誘導され、そしてスペクトル領域光コヒーレンス断層撮影法により観察することができます。この方法の目的は、 その場で生体組織における急性の圧力上昇に住ん流出路の形態学的応答を定量化することです。

The mechanical characteristics of the trabecular meshwork (TM) are linked to outflow resistance and intraocular pressure (IOP) regulation. The rationale ...

この手順の全体的な目的は、生理学的条件下で線維柱帯を検査することにより、生体ヒト眼のin situにおける急激なIOP上昇に対する生きた流出路の形態計測学的反応を定量化することである。まず、ベースラインでの眼圧を測定し、光干渉断層計（OCT）を用いて房水流出路の部位である角膜輪部を画像化する。次に、眼圧計を用いて外側強膜に5gおよび10gの圧力を加え、IOPを上昇させながら、圧力測定と輪部スキャンを繰り返す。次に、tropic aideを1滴点眼して平滑筋を弛緩させます。その後、同様に眼圧測定とリムバススキャンを繰り返します。眼圧上昇中の画像データをエクスポートして処理し、流出路の構造形態を測定します。平滑筋弛緩の有無による眼圧上昇への形態的変化を比較することで、線維柱帯の機械的特性に関する知見が得られます。この手法が原子間力顕微鏡などの他の手法よりも優れている主な点は、生体眼において線維柱帯を測定し、IOP変動に対する機械的応答を検証できることです。その応答には、線維柱帯を支持する周囲の平滑筋の影響が含まれます。一般的に、この手法に不慣れな方は、固定やターゲットが存在せず、また固定および眼の位置調整が主に口頭指示によって行われるため、最初は苦労することがあります。さらに、腹部ダイナモメーターを使用すると、眼の位置にわずかなずれが生じます。そのため、画像取得前にスキャンの再アライメントを行う必要があります。まず、圧力上昇から開始します。まず、ゴールドマン圧平法を用いて基準圧を測定します。0.5%プロパノールの滴下を眼に行い、3分間待ちます。次に、テストグループを2つのコホートに分けます。コホート1には30 gの圧力を、コホート2には5 gの圧力を加えます。眼圧計を用いて側頭部の強膜を軽く圧迫します。その後5分間待ち、第2群に10 gの圧力を加えて再度測定を行い、これを上昇圧測定値とします。次に、被験者の眼底の光干渉断層撮影（OCT）スキャンを行い、被験者をスキャナーに案内し、人口統計学的データを入力します。次に、患者に鼻側を向くよう指示し、口頭指示によってスキャンの中心を耳側角膜縁に合わせます。耳側角膜縁が中心に位置したら、ベースラインスキャンを行います。ここで、目に0.5% propaneを1滴点眼します。3分間待ち、アルモダイナモメーターを用いて圧迫しながら再度スキャンを行います。コホート1には30 gの圧力を加え、コホート2には5 gの圧力を加えます。コホート2については、初回圧迫から5分後、10 gの圧力を加えながら眼の3回目のスキャンを行います。前述と同様に、良好なスキャン結果のみを有効とします。データをエクスポートしてImage Jにインポートした後、画像をTIFFイメージスタックに変換し、以下の設定で「Enhanced Local Contrast」処理を行います。Parameter block sizeを31、Instagram binsを256、maximum slope at five masksをnoneに設定し、fastオプションを有効にします。イメージスタックの各フレームにこの操作を行い、変更を保存します。次に、アスペクト比のサイズを2048 By 1024に調整し、画像を垂直方向に反転させます。スケール距離を2048に設定します。既知の距離を4,000に設定し、ピクセルアスペクト比を1に設定します。その後、スキャンデータを解析して血管の交差を確認します。マウスホイールをゆっくりと回転させてスキャンデータを視覚的に検証し、特徴的な血管の交差を特定してください。スキャン内での参照点とするため、画像番号とリファレンスフレーム番号を解析用スプレッドシートに記録します。スキャンボリューム内のフレームをスクロールすることには、2つの目的があります。まず、水系血管における特徴的なランドマークを探します。これらは、異なる時点で撮影されたスキャンボリュームを位置合わせするために使用されます。次に、ボリュームをスクロールしながら、水路の形態を頭の中で統合し、その形態を用いて水路とシュレム管を区別します。フリーハンド選択ツールを使用して、シュレム管に焦点を当てます。まず、その断面積を測定してください。マウスで境界を囲み、管を手動でセグメント化します。現在の画像フレームでCTRL Dを押し続け、セグメンテーションラインの位置を記録します。次にCTRL Mを押し続け、シュレム管の面積を自動的に測定します。拡大すると、シュレム管に明確な境界がないことがわかります。そのため、セグメンテーションの境界を決定するためのガイドラインとして、あらかじめ半値全幅（FWHM）アプローチを用います。次に、シュレム管の断面積と測定フレーム番号を解析用スプレッドシートにコピーしてください。続いて、囲った領域の選択を解除し、右矢印キーを押します。キーを3回押し、3つの画像フレーム分進めます。この操作を繰り返し、10フレーム分、シュレム管の断面積を測定します。次に、左矢印キーを押して最初の測定フレームに戻り、シュレム管の長さを測定し始めてください。ツールバーから直線セグメントツールを選択します。現在のフレームにおいて、シュレム管の最も前方から最も後方の位置まで直線を引きます。Control + D キーを押し続けて、セグメンテーションラインの位置を記録します。次に、Control + Mキーを押し続けてシュレム管の長さを測定します。その後、シュレム管の長さとフレーム番号を解析用スプレッドシートにコピーし、長さの選択を解除します。体積を測定した3枚ごとの画像において、管の長さの測定を行ってください。最後に、3つのサンプルで線維柱帯の厚さを測定します。最初の測定フレームに戻り、管の最前方位置から線維柱帯と前房の境界に向かって直線を描きます。直線が境界に対して垂直であることを確認してください。次に、Controlキーを押しながらDを押し、続いてMを押して、直線の測定値を取得します。これらの測定値は、抽出元のフレームとともに、常にデータベースにコピーしてください。次に、管の中心から、隅角帯と前房の境界に向かって線を引きます。この線は、境界に対して垂直である必要があります。次に、controlキーを押しながら、現在のフレームのみに対してDキーを押します。3番目に、管の最も後方の位置から、前房に接する線維柱帯の境界まで線を引きます。また、この線が境界に対して垂直であることを確認してください。次に、Ctrlキーを押しながらDを押し、続いてMを押します。これら3箇所の厚さの測定を、以前に解析した他の9つのフレームについても同様に繰り返します。その後、記述したプロトコルを用いてデータの解析を行い、眼圧の小規模および大規模な変動が流出路の形態学的パラメータ（シュレム管の断面積など）に及ぼす影響を算出しました。高度な圧上昇は管の明らかな虚脱を引き起こしますが、小規模な眼圧上昇は許容されました。この手法を習得すれば、適切に実施した場合、10分から15分以内に完了させることができます。

trabecular-meshwork-response-to-pressure-elevation-living-human

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

出典:Sharma, T. P., et al., Translaminar Autonomous System Model for the Modulation of Intraocular and Intracranial Pressure in Human Donor Posterior Segments.J. Vis. Exp.

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