生きている人間の目で圧力上昇を小柱網の対応
2015年6月20日
シュレム管の空間内に、小柱網（TM）の移行は、眼底血圧計により、急性の圧力上昇によって誘導され、そしてスペクトル領域光コヒーレンス断層撮影法により観察することができます。この方法の目的は、 その場で生体組織における急性の圧力上昇に住ん流出路の形態学的応答を定量化することです。
この手順の全体的な目標は、生理学的条件下での小柱網の検査により、その場で生きている人間の目の急性 IOP 上昇に対する生体流出路の形態測定応答を定量化することです。これは、最初にベースラインで眼内の圧力を測定し、光干渉断層撮影によって房水流出経路の位置である輪部をイメージングすることによって達成されます。2番目のステップは、眼科ダイナモメーターによって側方強膜に5グラムと10グラムの圧力を加えてIOPが上昇している間に、圧力測定とリンバススキャンを繰り返すことです。
次に、トロピックエイドの1滴で平滑筋をリラックスさせた後。圧力測定とリンバススキャンは、なしで繰り返されます。また、眼圧上昇時には、画像データをエクスポートして処理し、平滑筋の弛緩の有無にかかわらず、眼圧上昇に対する眼圧上昇に応じた形態変化の比較を測定した流出経路構造の形態比較により、海綿網の機械的特性に関する洞察を得ることができます。
この手法が原子間力顕微鏡などの他の技術よりも優れている主な点は、生きている眼の小柱網を測定し、IOP摂動に対する機械的応答を調べていることです。その反応には、それを支える周囲の平滑筋の影響が含まれます。一般的に、この方法に不慣れな個人は、この方法では固定、ターゲット、固定がなく、目の位置が主に口頭でのコマンドによって調整されるため、最初は苦労します。
さらに、腹部ダイナモメーターを適用すると、目の位置がわずかにずれます。したがって、画像取得の前にスキャンを再調整する必要があります。圧力上昇から始めます。
ベースライン圧力は、最初にゴールドマンアプリケーションChronometryを使用して測定され、0.5%のプロパンを眼に滴下し、3分間待ちます。テストグループを2つのコホートに分けます。コホート1には30グラムの圧力がかかり、コホート2には5グラムの圧力がかかります。
眼科ダイナモメーターで側頭強膜に優しく圧力をかけます。次に、5分待ってから、2番目のコホートに10グラムの圧力を加え、別の測定である高血圧測定を行います。次に、被験者のアイシート、スキャナーの被験者の光干渉断層撮影スキャンを実行し、人口統計データを入力します。
次に、口頭でのコマンドを使用して、患者の視線を鼻の方向に向けることにより、スキャンを側頭辺筋の中央に配置します。側頭辺縁部が中央に配置されたら、ベースラインスキャンを行います。次に、0.5%のプロパンを目に一滴垂らします。
3 分待ってから、almo ダイナモメーター コホートを使用して圧力をかけながら別のスキャンを行うと、1 つに 30 グラムの圧力がかかり、コホート 2 に 5 グラムの圧力がかかります。2番目のコホートでは、最初の圧力適用から5分間待ち、目の3回目のスキャンを行いながら10グラムの圧力を加えます。以前と同様に、良好なスキャンのみが許容されます。
データをエクスポートしてImage Jにインポートした後、画像をTIFF画像スタックに変換し、以下の設定で拡張ローカルコントラスト処理を行ってください。パラメータ ブロック サイズを 31、Instagram ビンを 256、マスク 5 の最大勾配を none に設定し、fast オプションを有効に設定します。画像スタックの各フレームでこの操作を行い、変更を保存します。
次に、アスペクト比のサイズを2048 By 10 24に調整し、画像を垂直に反転します。縮尺距離を 2048 に設定します。既知の距離を 4, 000 に設定し、ピクセル アスペクト比を 1 に設定します。
その後、スキャンは船舶の交差について分析できます。マウスホイールをゆっくりと回してスキャンを視覚的に調べ、特徴的な船舶の交差を特定します。スキャン内の参照点として機能するには、画像番号と参照フレーム番号を分析スプレッドシートに記録します。
スキャンボリューム内のフレームをスクロールすることには、2つの目的があります。まず、水性容器の特徴的なランドマークを探しています。これらは、異なる時間に取得されたスキャンボリュームを整列するために使用されます。
次に、巻をスクロールしながら、水容器の形態を頭の中に統合し、その形態を使用して水容器とシュレム運河を区別しています。フリーハンド選択ツールを使用して、シュレム運河に焦点を当てます まず、その断面積を測定します。マウスで境界を一周することにより、運河を手動でセグメント化します。
現在の画像フレームで Ctrl D を押しながら、セグメンテーション ラインの位置をドキュメント化します。次に、CTRL Mを押し続けると、Schlemm運河の面積が自動的に測定されます。拡大すると、シュレム運河には特徴的な境界がないことがわかります。
そのため、全幅の半値法は、セグメンテーションの境界を決定するためのガイドラインとして先験的に使用されます。次に、シュレム運河の断面積と測定フレーム番号を解析スプレッドシートにコピーします。次に、アウトラインで囲まれた領域の選択を解除し、右矢印を押します。
3 回キーを設定すると、3 つの画像フレームが進みます。シュレム運河の断面積が10フレームで測定されるまで、このプロセスを繰り返します。次に、左矢印キーを押して最初の測定フレームに戻り、Schlemm運河の長さの測定を開始します。
ツールバーから直線セグメントツールを選択します。現在のフレームで、シュレム運河の最前方から後方の最上部に直線を引きます。コントロール D を押したままにすると、セグメンテーション線の位置がドキュメント
化されます。次に、コントロールMを押し続けて、シュレム管の長さを測定します。次に、Schlemm運河の長さとフレーム番号を分析スプレッドシートにコピーし、長さの選択を解除し、体積が測定された3枚ごとに運河の長さを測定します。最後に、3つのサンプルで海綿網の厚さを測定します。
最初の測定フレームに戻り、運河の一番前の位置から海綿網と内部チャンバーの境界まで直線を引きます。線が境界線に対して垂直であることを確認します。次に、Controlキーを押しながらDを押し、次にMを押してラインの測定値を取得します。
これらの測定値は、常に、取得元のフレームとともにデータベースにコピーしてください。次に、運河の中心からメッシュワークと前房の境界まで線を引きます。線は境界線に対して垂直である必要があります。
次に、コントロールキーを押しながら、現在のフレームでのみDを押します。第三に、運河の後部最上部から前房とのメッシュワークの境界まで線を引きます。また、この線が境界線に対して垂直であることを確認してください。
次に、Control キーを押しながら D キーを押し、次に M キーを押します。Repeat は、以前に分析された 9 つのフレームのそれぞれでこれらの 3 つの厚さ測定を行います。次いで、記載されたプロトコルを用いてデータの解析を進め、眼圧の大小の変化が流出、シュレム管などの形態学的パラメータ、断面積に対する眼圧の小小の変化の影響を得た。高レベルの圧力上昇は、眼内圧のわずかな上昇が収容された間、運河の観察可能な崩壊を引き起こします 一度習得すると、この技術は適切に実行されれば10〜15分以内に実行できます。
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概要
本研究では、生存しているヒトの眼において、急激な眼圧（IOP）上昇に対する線維柱帯（TM）の形態計測学的反応を調査します。光干渉断層計を用い、生理学的条件下におけるシュレム管腔内へのTMの移動を定量化します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 眼科学
- 生体力学
背景
- 線維柱帯は、房水の流出において重要な役割を果たしています。
- 眼圧（IOP）の上昇は、線維柱帯の形態および機能に影響を及ぼす可能性があります。
- 線維柱帯の反応を理解することは、緑内障研究において不可欠です。
- 光干渉断層計（OCT）は、眼の非侵襲的なイメージングを可能にします。
研究目的
- 急激な眼圧（IOP）上昇に応答したシュレム管（TM）の移動を定量化すること。
- 平滑筋弛緩がTMの形態に及ぼす影響を評価すること。
- TMの機械的特性に関する理解を深めること。
使用された手法
- 光干渉断層計を用いたベースラインの圧力測定および角膜輪部のイメージング。
- 眼圧計を用いた外側強膜への加圧による眼圧（IOP）の上昇。
- tropic aideを用いた平滑筋の弛緩と、それに続く反復的なイメージング。
- 流出路における形態学的変化の解析。
主な結果
- 急性のIOP上昇に応答して、TMの移動が観察されました。
- 平滑筋弛緩の有無によって、形態に差異が認められました。
- 得られたデータから、TMの機械的特性に関する知見が得られました。
- これらの知見は、房水力学の理解に寄与するものです。
結論
- 本研究により、眼圧（IOP）の変化に対する線維柱帯（TM）の応答を定量化することに成功した。
- 結果から、TMの形態における平滑筋の重要性が浮き彫りとなった。
- 得られた知見は、将来の緑内障治療に寄与する可能性がある。
よくある質問
産業界への適用性
この技術により、生存しているヒトの眼球において、眼圧上昇に対する線維柱帯の機械的応答を直接測定することが可能となり、緑内障のターゲット検証に生理学的に的に関連したデータを提供します。生体組織の相互作用を維持した条件下で形態学的変化を定量化することで、流出路に関する仮説のメカニズム的なリスク低減を支援します。このアプローチは、前臨床モデルとヒトの病態生理学を橋渡しし、眼圧降下療法のターゲット選択における予測の信頼性を高めます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 隅角篩状網の剛性と、流出抵抗に対する平滑筋の寄与を検証する。
- 運用的価値： 固定によるアーティファクトのないヒト組織において、TMバイオメカニクスの仮説検証を可能にする。
- 予測的価値： 分子レベルの摂動をin situでの機能的な形態計測結果に結びつけることで、ターゲットへの信頼性を裏付ける。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備： 構造的表現型解析のための、シュレム管の断面積および長さの定量的な指標を算出します。
- 再現性： 血管の指標（ランドマーク）を用いてスキャン位置を合わせることで、縦断的解析および比較解析が可能になります。
- 拡張性： 本プロトコルでは、用量反応性の生体機械的変化をモデル化するために、圧力滴定（5g、10g、30g）への対応が可能です。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 疾患との関連性： IOP上昇に対するヒトTMの反応を測定し、緑内障の病理生理学に直接的な知見を提供します。
- トランスレーショナルな連続性： 平滑筋弛緩（トロピカミドによる）がある場合とない場合でTMの挙動を比較でき、組織特異的な寄与を分離することが可能です。
- メカニズムの不確実性の排除： 観察されたTMの移動が、内在的な剛性に依存しているのか、あるいは外在的な毛様体による支持に依存しているのかを明確にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、流出路に関するヒト由来の生物力学的データを提供することで、標的仮説から前臨床検証に至るディスカバリー・コンティニュアム（発見の連続体）に適合します。
- 探索生物学：生理的なIOP負荷条件下におけるTMの剛性と細胞外マトリックスのリモデリングに関する仮説を検証する。
- スクリーニング：アッセイの標準化に適した標準的な形態計測リードアウト（SC-CSA、SC長、TM厚）を提供する。
- 分析：圧力条件および薬理学的モジュレーター間での構造変化の統計的比較を可能にする。
- トランスレーショナルリサーチ：生体ヒト組織を用いて、流出施設の動物モデルまたは工学的モデルから得られた知見を検証する。
- エンタープライズ再利用：ヒトの眼培養またはオルガノイドシステムにおいて、IOP調節化合物を評価するための再利用可能なプラットフォームを確立する。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 生体眼における天然組織の反応を測定することで、TM（線維柱帯）バイオメカニクスにおけるメカニズムの曖昧さを軽減する。
- 運用的価値： 言語による視線誘導と圧力滴定を通じて、ユーザー間およびセッション間でのIOP（眼圧）上昇およびイメージングプロトコルを標準化する。
- 戦略的価値： 臨床的に関連のある機械的表現型におけるターゲットエンゲージメントを検証することで、Go/No-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響： ヒトTMのバイオメカニクス的検証に基づき、リスクを調整した緑内障ターゲットの優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- 眼球解剖学、OCTイメージング、および手動による形態計測セグメンテーションの専門知識が必要である。
- コントラスト強調およびスケール校正には、スペクトルドメインOCTおよびImageJによる処理に依存する。
- ランドマーク（血管交差部）の特定および10フレーム以上の手動測定において、チーム間での標準化が必要である。
- 輪部解剖学における個体間差、およびダイナモメーター適用時の圧力誘発性の眼球運動を考慮しなければならない。
- 明確な組織学的マーカーなしにシュレム管の境界を特定する技術者の熟練度に制限されるため、半値全幅（FWHM）のガイドラインが必要である。
