LEPR

この手順の全体的な目的は、糖尿病モデルであるLEP R DBマウスから生存可能な生存膵島を回収し、ライブセル2光子イメージングを用いて膵島内のβ細胞からのインスリン分泌を評価することです。まず、膵臓消化用の酵素混合液、膵島培養用の培養培地、および2光子アッセイ用の細胞外緩衝液などの試薬を調製します。次に、安楽死させたマウスの腹部を開き、膵臓に酵素混合液を注入して臓器を消化させます。

次に、アイレットを膵臓消化液から分離して培養します。最後に、2光子顕微鏡を用いて、アイレット内のベータ細胞から単一のインスリン顆粒の融合をイメージングします。最終的に、このプロトコルは、健康時および疾患時においてインスリン分泌がどのように制御されているかを研究者が理解するのに役立ちます。

アイレット（膵島）分離法の主な改良点は、アイレットの収量と生存率を向上させるために混合酵素を使用することです。2光子イメージング技術は、現在、無傷のアイレット内の複数の細胞からインスリン分泌を記録できる唯一の方法です。膵島アイレット分離用の酵素を調製するには、5 mgのliase TL 1バイアルを26 mLのDM EMで希釈し、コラゲナーゼ type 4をHank'sバッファーを用いて0.5 mg/mLの濃度に調製し、さらに以下のliase TLおよびコラゲナーゼ混合溶液を添加します。

酵素混合液を体積比4:1で分注し、それぞれ2.5 mLずつ取り分けて-20 °Cで保存します。RPMI分離培地を調製するには、1 Lの水を入れた大きなコニカル・フラスコにRPMI 1640粉末1バイアルを室温で溶解させ、重曹2 gとHEPES 4.02 gを添加します。水酸化ナトリウムを用いてpHを7.4に調整し、その後フィルター滅菌を行い、4 °Cで保存します。

2光子イメージング用のRPMI分離培地に10% FBSと1% 抗生物質を添加し、RPMI培養培地を作製します。以下の試薬を用いてナトリウムリッチ細胞外緩衝液を調製します。細胞外染色液を調製するには、SRBの8 mMストック溶液を作製し、細胞外緩衝液を小型チューブに分注して-20 °Cで保存します。

使用濃度にするため、新鮮な細胞外緩衝液を用いてSRBストック溶液を10倍に希釈します。マウスを安楽死させ、テキストプロトコルに従って70% ethanolで体全体を十分に噴霧した後、頭側を術者の方へ、尾側を術者から遠ざけるように配置します。腹壁の皮膚と腹膜に2本の長い側切開を加え、V字型のフラップを作成します。

皮膚のフラップを上に引き上げ、腹腔全体を露出させます。腸管を脇に避け、折りたたんだ組織を用いて肝臓を固定し、総胆管を露出させます。次に、十二指腸壁の乳頭部に血管クランプを装着し、注入した酵素が十二指腸に流入するのを阻止します。

これは、膵酵素が膵管に逆流するか、注入部位に留まるか、あるいは十二指腸に入るかを決定する重要なステップです。31ゲージの針を用いて、総肝管と胆嚢管の合流点付近で総胆管をカニュレーションし、2回目の注入のためのスペースを確保します。1回目で膵臓に灌流しなかった場合は、約2 mLの冷えた酵素混合液をマウスの総胆管にゆっくりと注入してください。

クランプが正しい位置にあれば、膵臓に速やかに灌流が行われます。灌流後、速やかに臓器を取り出してガラス瓶に入れ、37 °Cのウォーターバスで約19分間インキュベートします。インキュベーション後、約20 mLの冷 isolation mediumを加えて消化プロセスを停止させます。

バイアルを軽く振って膵臓を分散させ、孔径1 mmの通常のTシブでろ過しながら、滅菌済みの50 mLチューブに注ぎます。分離培地を加えてチューブを満たし、400 G、4°Cで1分間遠心分離します。ブレーキをオフにした状態で、ペレットに分離培地を加え、溶解させます。

次に、懸濁液を2本の15 mLチューブに移し、2回目の遠心分離を行います。上清を吸引後、各ペレットに密度勾配細胞分離培地を6 mL加え、ピペッティングまたはボルテックスで再懸濁します。その後、チューブの壁面に沿って、密度勾配分離培地の上に分離培地約6 mLを静かに加え、100 G、4 °Cで15分間遠心分離します。

分離後、上層、中層、下層をそれぞれ3つの異なるディッシュに回収します。次に、解剖顕微鏡下でピペットを用いて、3つのディッシュからアイレットを手作業でピックアップします。酵素消化からの回復を促すため、アイレットの大部分は中層に回収されます。

10 mM glucoseを含むRPMI培地6 mLを入れた25 cmペトリ皿に、アイレットを40個ずつグループ分けして準備し、2日間培養します。培地を毎日交換し、インスリン分泌を測定するための間接的アッセイとして2光子イメージングを実施します。まず、細胞外緩衝液中の3 mM glucoseを用いて、2日間培養したアイレットをプレインキュベートします。

溶液の漏れを防ぐため、顕微鏡ステージにグリースを塗布し、ガラススライドが入った温度制御チャンバーを顕微鏡ステージに設置します。次に、0.8 mMのSRBと様々な濃度のグルコースを含む細胞外緩衝液 500 µLでチャンバーを満たします。続いて、あらかじめインキュベートしたアイレットをチャンバーの中央に配置し、アイレットの3〜4細胞層の深さに焦点を合わせます。

げっ歯類の膵島において、インスリンの免疫染色を行うと、ほとんどの細胞がβ細胞であることが示されます。次に、2光子顕微鏡と60倍油浸対物レンズを用いて、小さな蛍光スポットの突然の出現により、単一のエキソサイトーシスイベントを特定します。最後に、スキャンイメージソフトを用いて、野生型マウスの関心領域における蛍光信号の急速な上昇相を確認し、イベントを確定させます。

このビデオで実演するプロトコルを用いると、約200個のアイレットが得られることが期待されます。健全なアイレットは、明るく、円形で、境界が滑らかであるのが特徴です。一方、消化不足の分離バッチでは、通常、アイレットが小さく不鮮明であったり、細胞が付着したアイレットが見られたりします。

過剰に消化されたバッチでは、グルコースや高カリウムなどの刺激に反応して形質膜と融合するインスリン顆粒のアイレット（eyelet）数が2光子アッセイで減少しますが、SRBが顆粒内に進入すると、直径約400 nanometersの急激な蛍光スポットが出現します。記録時間内に、刺激に対するすべての開口放出（exo）イベントが特定され、イベントの発生場所、出現時間、持続時間、および融合のタイプが記録されます。KISS、Run、または完全融合などのイベントが特性評価され、これらは2型糖尿病モデルにおける顆粒融合の欠陥を評価する上で有用です。

本手法を用いて、糖尿病モデルであるDB DBマウスの膵島における欠損は、個々の顆粒融合のキネティクスの変化ではなく、完全な顆粒融合の消失であることが示されました。さらに、疾患におけるインスリン分泌低下に影響を与える最大の要因は、反応性細胞数の減少であると考えられます。本ビデオを視聴することで、非糖尿病のRDBマウスを用いた膵臓灌流および膵島刺激について十分に理解し、無傷の膵島内におけるインスリン分泌反応を評価するための2段階試験を実施できるようになります。