Name: ヒト乳癌組織および細胞株からマンモスフェア形成アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 学ぶマンモスフェア形成アッセイを用いたヒト乳癌組織および細胞株からのがん幹細胞の分離と自己更新能評価法。CD44陽性・CD24陰性細胞を選別し、低接着プレートで培養して球形成効率を定量化する。

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この作品はヒラリークラフトと卿ダグラスマイヤーズに特別な言及にインペリアルBRC、ヘルスリサーチ研究所、およびアクション対がんによってサポートされています。

以下の手順では、倫理的にインペリアル·カレッジ、ロンドンによって承認されている。 ヒト乳癌細胞株からの一次マンモスフィアの1世代注：無菌培養フードの下で、次の手順を実行します。 <ol><li>マンモスフェアメディア2mMのL-グルタミン、100 U / mlペニシリン、100 U / mlストレプトマイシンを補充したDMEM / F12を含む準備する。 、10ng / mlの組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF; R＆D Systems社）及び1×B27サプリメント、20ng / mlの組換えヒト上皮細胞増殖因子（シグマEGF）を添加することによって使用直前に完全培地を調製する。 </li><li>接着性のMCF-7またはMDA-MB-231細胞（または任意の乳癌細胞株; 70〜80％コンフルエンス）を含むフラスコから培地を吸引除去は、1×PBSで2回洗浄し、細胞をトリプシン処理。 </li><li> 5分間室温で200×gで遠心分離細胞。マンモスフェアメディア1-5 mlの上清と再懸濁細胞をデカントします。ピペット40μmのセルストレーナーキャップフィルタ上下に、必要に使用した場合、単一細胞懸濁液を得た。単一細胞懸濁液が形成された（ない場合は、3回まで細胞懸濁液を注射器25 G針を使用）していることを確認するために血球計数器を使用してください。 </li><li> FACS経由必要な分離株のCD44 + CD24-細胞のサブセットは、抗CD24-フィコエリトリン（PE）および抗CD44フルオレセインイソチオシアネート（FITC）モノクローナル抗体9を使用している場合。また、磁気活性化細胞ソーティング抗CD44及び製造者の指示に従って、抗CD24ビオチン結合されたマイクロビーズとの（MACS）システムを使用してこのような集団を単離。 LDカラムを使用して、LSカラムを用いて正の選択、および負の選択を行い、17フローサイトメトリーにより、すべての単離された細胞の表現型を確認する。 </li><li>トリパンブルーを用いて1mlあたり生存細胞の数を計算します。 注：細胞生存率はhemocy上のグリッド内のセルの総数で割った生存細胞の数として計算される光度計。パンブルーを取る細胞は非生存と考えられている。以下の手順を正確に生存細胞の割合を決定するために使用される。 <ol><li> PBS中トリパンブルーの0.4％溶液を調製する。細胞の1ミリリットルのパンブルーストック溶液0.1ミリリットルを追加します。血球計数器をロードし、低倍率で顕微鏡下ですぐに調べる。総細胞数及び青色染色細胞の数を数える。 生存細胞= [1.00 - （青色細胞の数÷全細胞の数）]×100。 </li><li>培養物1mlあたりの生存細胞数を計算するには、以下の式を使用します。希釈係数を補正することを忘れないでください。 10 4×1.1 =細胞/ mlの文化×生細胞の数</li></ol></li><li> 6ウェルの超低付着性プレートの各ウェルに完全なマンモスフェア培地2ml中の細胞の予め決定された量を再懸濁する。播種密度は、通常、ウェル当たり500-4,000細胞/ cm 2の細胞である。必要に応じてLOを使うワットアタッチメント24ウェルプレートは、培地の0.5mlの同じ濃度で細胞を播種した。 注：私たちは、対象となる各細胞株について播種密度と文化の時間の最適化をお勧めします。 </li><li>特に最初の5日間の増殖期の間に、プレートを乱すことなく（細胞株およびマンモスフィアのサイズに応じて）5~10日間、37℃、5％CO 2での超低接着6穴プレートをインキュベート。 </li></ol>ヒト乳癌臨床サンプルからの一次マンモスフィアの2世代注：ヒト乳癌組織は、乳房腫瘍を除去するための手術を受けた患者から得ることができる。 100 U / mlペニシリンおよび100 U / mlのストレプトマイシンを含む培地50mlの滅菌チューブ中で24時間まで氷上店組織。無菌培養フードの下に、次の手順を実行します。 <ol><li>メディアの少容量で100ミリメートル組織ペトリ皿にサンプルを転送します。 Remov無菌のはさみ、scapelとピンセットを使用して電子脂肪組織。 </li><li> DMEM / F12 2-3 mlを加え大きな片がなくなるまで、無菌scapelやカミソリの刃で1ミリメートル3枚にサンプルをミンチ。 </li><li>タンパク質分解酵素（3,000 U / mlコラゲナーゼ1,000 U / mlのヒアルロニダーゼ）を含む予め温めておいた10ミリリットルDMEM中で組織片を再懸濁し、すべての組織断片が消化されるまで、ロータリーシェーカーで37℃でインキュベートする。通常、完全な消化は1-3時間かかる。腫瘍の病理学的な文字によると消化時間を調整します。 （例えば、乳腺癌はより壊れやすく、短い消化時間を必要と粘液癌に比べて消化することが通常困難です）。血球計数器の下に20μlのサスペンションを観察することによって消化ごとに1/2時間の程度を評価。 </li><li>断片はその後、5分間沈降室TEMで10分間200×gで15ミリリットルコニカルポリプロピレンチューブと遠心分離機で上清を転送できるようにする温度。マンモスフェアメディア5mlの - 慎重に1上清および再懸濁細胞をオフにデカント。 </li><li>単一細胞懸濁液を得て、メッキする細胞株について上記のステップ1.1から1.4に従ってください。必要に応じて25〜Gの細胞が損傷した細胞を制限するために2回の最大シリンジ渡します。 </li></ol> 3.マンモスフェア効率（％）計算の形成<ol><li>培養期間の後、40倍の倍率で顕微鏡下でマンモスフィア（より大きい40μm）の直径を数える。光学顕微鏡にデジタルカメラを使用してデジタル画像5ランダムフィールドおよび取得ソフトウェアを使用して、マンモスフィアのサイズを決定する。任意の画像解析ソフトウェアを使用してください。 </li><li>マンモスフェアは、以下の式を使用して効率（MFE％）を形成する計算する： MFE（％）=（ウェル当たりマンモスフィアの＃）/（ウェル当たり播種した細胞の＃）×100 </li></ol>自己再生の評価のためのマンモスフィアの4連続継代<ol><li&gt;ピペット15ミリリットルチューブに各ウェルからマンモスフィアを含む培地。 PBSでウェルを洗浄し、収集したメディアに追加する。室温で10分間、115×gで遠心する。 </li><li>上清を捨て、予め温めておいた0.5％トリプシン/ 0.2％EDTAを500μlにペレットを再懸濁。 2-3分間インキュベートする。 </li><li>トリプシンを中和するためにFCSの500を添加する。 5分間500×gで遠心分離する。 、マンモスフィアメディアの100μlの上清と再懸濁ペレットを廃棄ピペッティング球を脱凝集する。 </li><li>血球計で細胞をカウントし、細胞を単一細胞懸濁液にするかどうかを判断。 25 Gを通過しない場合は、単一細胞を得るために3回まで注射器。主要生成に使用したのと同じ密度で新しい超低接着6ウェルプレートに細胞を播種する。 </li><li> 5-10日後、&gt;40μmの球をカウントし、前に報告された式を使って球形成効率を計算。 </li></ol>

<ol><li>Iliopoulos, D., Hirsch, H. a, Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epigenetic+switch+involving+NF-kappaB%2C+Lin28%2C+Let-7+MicroRNA%2C+and+IL6%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An epigenetic switch involving NF-kappaB, Lin28, Let-7 MicroRNA, and IL6.</a> Cell. 139 (4), 693-706 (2009).</li>
<li>Iliopoulos, D., Hirsch, H. a, Wang, G., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+formation+of+breast+cancer+stem+cells+and+their+dynamic+equilibrium+with+non-stem+cancer+cells+via+IL6+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inducible formation of breast cancer stem cells and their dynamic equilibrium with non-stem cancer cells via IL6 secretion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (4), 1397-1402 (2011).</li>
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</ol>

著者らは、この記事の公平性を損なうと認識される可能性のある利益相反は存在しないことを宣言します。

プライマリとセカンダリのマンモスフィアの成功評価は、マンモスフィアは、最小限の球凝集に、単一のクローンから形成する十分に低い密度でメッキされる細胞に依存しています。しかし低すぎる密度で、数が少なすぎるマンモスフィアは、統計学的治療の効果を区別するために形成することができる。播種密度は、彼らは彼らの球の形成効率が大幅に変化することができるので、使用される各細胞株について最適化する必要があります（低E-カドヘリンを発現するものが少なく安定しており、短期のマンモスフェア培養18を形成することができる）。この最適化段階は、単一細胞のクローン成長からほとんどのプライマリとセカンダリの球形成の結果を確認する必要があります。ウェルごとに1つの細胞をプレーティングすることは、完全にクローンマンモスフェア形成を確実にする唯一の方法であり、新たに得られた試料13の自己再生/分化率を定量化するために推奨することができる。しかし、このアプローチは、複雑な要因に苦しんでいる：マンモスフェアが形成1％の効率は、96ウェルプレートあたり単一マンモスフェアが得られると、効率が懸濁された細胞間のシグナリングパラクリン成長因子の...

幹様がん幹細胞が率いる腫瘍細胞系列の存在が大幅に腫瘍の不均一性の我々の理解に追加されました。腫瘍におけるいくつかの表現型の多様性は遺伝的に異なるクローンのクローンの成長から生じませんが、かなりのコンポーネントは、エピジェネティックな違いに起因すると表示されます。癌細胞は、特定の遺伝子の活性化または抑制を経由して幹、前駆、および分化した状態の間で（時には可逆的に）遷移することができる表現のプログラム1から3。これは、現在調節因子を提供する隣接癌、間質、または免疫細胞の傍分泌シグナル伝達と関連して、その結果自己分泌シグナル伝達を細胞内で発現された遺伝子発現プログラムを反映して、細胞内因性または外因性の要因を反映して、そのようなの程度microenviromental条件よい低酸素症2,4,5。 革新的な系統は、アプローチをトレースするが、それらのインビボニッチ6で推定される癌幹細胞を研究する当社の能力進めています- 8、球形成アッセイは、少なくとも使用されるアッセイ条件下では、幹細胞のように振る舞うように乳癌細胞」の可能性を推定するための普及した、便利なアプローチのまま。これは、しばしば膜マーカーCD44およびCD24 9、及び酵素ALDH（アルデヒドデヒドロゲナーゼ）10の活性レベルの発現によって精製癌幹細胞について遡及的な方法は、よりmesenchymal-上皮に対応するために提案されたマーカーと一緒に使用され様がん幹細胞をそれぞれ11。球形成のアプローチは、最初の上皮成長因子（EGF）12を添加して非接着、無血清条件下で単一クローン由来の推定幹細胞の増殖を可能にする、ニューロスフィアアッセイとして開発された、後で有用正常および癌に適用される乳房組織。 骨善意幹細胞は、 生体内で活性化を有利に働く要因の正確な組み合わせは発生しません。マンモスフェアアッセイは、代わりに有糸分裂に構えたり、すでに13を分割するいずれかの細胞の成長を可能にします。これらの前駆細胞ではなく、真に静止細胞が、アッセイにおいて使用されるEGFおよび塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）マイトジェンで増殖する細胞段階であってもよい。それにもかかわらず、それらは活性化された幹細胞に関連するシグナル伝達経路14の範囲を含む。また、それらの形成の速度は、マウス異種移植片2,15,16の中で限界希釈アッセイにおけるそれらの効力により測定し、それらから採取された組織の腫瘍形成に関連する&lt;/ SUP&gt;。 ここでは、単一細胞を単離し、ヒト乳癌細胞株および乳房腫瘍の臨床試料の両方からの一次マンモスフィアを生成するための詳細なプロトコルを提供する。我々はまた、自己再生を評価するために主要なマンモスフィアの連続継代を実行する方法を説明し、どのように異なる播種密度間での比較は（ 図1のスキームを参照）を可能にする効率を形成する球を計算する。

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>ロンザ</td><td>CC-3151</td><td></td></tr><tr><td>2 mM L-グルタミン</td><td>Sigma アルドリッチ</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>100 U/ml ペニシリン &ストレプトマイシン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4083</td><td></td></tr><tr><td>20 ng/ml 組換えヒト上皮成長因子 (EGF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>20 ng/ml 組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子 (bFGF)</td><td>R&D systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>1x B27 supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>12399902</td><td></td></tr><tr><td>0.5% トリプシン/0.2% EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59418C</td><td></td></tr><tr><td>子牛胎児血清</td><td>First Link UK</td><td>02-00-850</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93595</td><td></td></tr><tr><td>低アタッチメント6ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>CLS3814</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ1A型</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>ヒアルロニダーゼ</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>滅菌カミソリの刃</td><td>Fisher Scientific</td><td>12443170</td><td></td></tr><tr><td>滅菌</td>メス <td>Fisher Scientific</td><td>11758353</td><td></td></tr><tr><td>滅菌マイクロ解剖はさみ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>S3146</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト乳癌組織および細胞株からマンモスフェア形成アッセイ

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

より分化した子孫を生じることながら健康な組織に似ては、多くの血液および固形の悪性腫瘍は、現在、自己再生幹様癌細胞のサブセットで、階層的に組織化されると考えられている。非幹腫瘍の大きさと比較して強化された化学療法および放射線抵抗性を有することが、乳癌、これらの癌幹細胞を標的と理解とは、重要な研究分野となっている。マンモスフェアアッセイはまた、広く遡及sphere-を同定する能力について用いられるようになっている：CD44、CD24、およびALDH活性を含むマーカーは、将来に向かって、免疫不全マウスに移植したときに増強された腫瘍形成性を示す細胞を単離するために蛍光活性化細胞選別（FACS）を用いて評価することができる単一の幹細胞様のクローンから発生セルを形成する。ここでは、適切な細胞株または一次患者サンプルからマンモスフィアの培養、彼らの継代、及び球体Fを推定する計算のためのアプローチを概説orming効率（SFE）。まず、適切な計画とマンモスフェア実験の解釈の重要な考慮事項と落とし穴を議論する。

異なるサンプルまたは異なる処理を施したものは播種初期セルに対して正規化した後に形成マンモスフィア&gt;40μmの数が変化してもよい。三重で成長し、各治療のためにマンモスフェア形成効率（MFE）を計算します。これは、異なる播種密度を用いた実験を比較することを可能にする。データは、最高の理想的な陽性および陰性対照を、棒グラフに表示し、三つ組のウェルで標準偏差を表示している。一貫して60〜80％コンフルエンスの間に非接着性プレートに付着細胞を移す。慎重な細胞計数は正確に治療の効果を定量化することが不可欠である。この重要なステップはよく同じ処理とは別に、複数の懸濁液を調製することにより、検索結果に寄与している変動率を推定します。測定される細胞濃度が同じウェルと著しく異なる場合には、（ 図2）を計数アプローチを精製考える。 <pキープtogether.withinページ= &quot;常に&quot;&gt;：FOクラス= &quot;jove_content&quot; <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52671/52671fig1.jpg" /> ...

フローティングマンモスフィアアッセイは、マウスに移植すると懸濁状態で生存し、腫瘍形成が促進される幹様乳がん細胞のサブセットを調査することができます。 このプロトコルは、in vivo腫瘍形成の代理である球形成能力の便利なin vitro測定を提供すると同時に、幹関連転写ランドスケープの分析を容易にします。

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

本実験の全体的な目的は、がん細胞株または腫瘍組織サンプルにおける幹細胞様細胞の割合を推定し、継代を重ねても自己複製能を維持しているかを評価することである。このため、がん細胞株または腫瘍組織を処理して単一細胞懸濁液を作成し、ソートによってCD 44陽性およびCD 24陰性の細胞サブセットを分離する。これらの細胞を低接着プレートに播種して増殖させ、その後、光学顕微鏡を用いてスフィア形成を確認する。形成効率は、最初に播種した細胞数に対する形成されたスフェア数の割合を決定することで定量化されます。単一細胞懸濁液の調製、増殖期間の確保、およびスフェア形成効率の決定という一連のプロセスを継代ごとに繰り返すことで、最終的に細胞の経時的な自己複製能を測定することができます。この手法は、自己複製などの幹細胞としての機能的特性を示す細胞を特定するための簡便な定性的アッセイであるとともに、in vivo腫瘍由来の幹細胞数を定量的に推定する方法となります。スフィア形成アッセイの中心的原則は、各スフィアが単一細胞に由来し、したがってクローナルであるということです。そのため、細胞密度はこのアッセイにおいて最も重要なパラメータであり、再現性に決定的な影響を与えます。滅菌済みの培養フード内で操作を行います。この手順は、コンフルエンシーが70%から80%のMCF-7またはMDA-MB-231細胞を用いて開始してください。フラスコから培地を吸引し、PBSで細胞を2回洗浄します。次に、トリプシンEDTAを加え、2〜6分間インキュベートします。細胞が剥離した後、10%FBSを含むマンモススフィア培地を加えて中和します。細胞が剥離したら、15 mLコニカル遠心チューブに移し、室温で200 ×gにて5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を除去します。次に、1〜5 mLのmanosphere mediumで細胞を再懸濁し、ピペッティングを10回行い、細胞ペレットを分散させます。続いて、細胞懸濁液を40 µmのセルストレーニングキャップフィルターに通し、付属のチューブにろ液を回収します。単細胞懸濁液を得るために、再懸濁した細胞の20 µL分注液を血球計数器に滴下し、顕微鏡で観察します。ここで示しているように細胞の凝集が見られる場合は、注射器を用いて懸濁液を25ゲージの針に1〜2回吸い込み、押し出してください。ここで示しているように細胞が単細胞懸濁液に分散したら、フローサイトメトリー（FACS）または磁気活性化細胞分離（MACS）を用いて、CD44陽性CD24陰性の細胞サブセットを単離します。LSカラムを用いて、CD44陽性細胞をポジティブセレクションします。目的の細胞はLSカラムの壁面に吸着するため、通り抜けた液（フロースルー）は廃棄し、カラムから細胞を回収します。5 mLのバッファーを加え、カラム付属のプランジャーを押し込んで、目的の細胞を洗い出します。次に、LDカラムを用いて、ネガティブセレクションにより細胞集団をさらに精製します。ここでは、CD 24陽性細胞がLDカラムに吸着します。CD 24陰性細胞を含むフロースルーを回収してください。次に、フローサイトメトリーを用いて、単離したすべての細胞の表現型を確認します。トリパンブルー排除法を用い、細胞懸濁液を適切に希釈して生存細胞密度を算出します。6ウェル超低接着プレートの各ウェルに、完全mammosphere培地 2 mLを用いて、1 cm²あたり500から4,000個の細胞を播種します。プレートを乱さないよう注意しながら、スフェアが観察されるまで5～10日間インキュベートします。スフェアの直径が少なくとも40 micronsに達し、まだアポトーシスが始まっていない状態まで培養を続けます。乳癌腫瘍の切除手術を受ける患者から、ヒト乳癌組織を採取します。滅菌済みの組織培養フード内で、100 units/mLのペニシリンおよび100 units/mLのストレプトマイシンを含むDMEMを満たした50 mL滅菌チューブに入れ、組織を氷上で最大24時間保存します。滅菌済みのハサミ、メス、およびピンセットを使用して、少量の培地が入った100 mm組織培養ディッシュにサンプルを移します。脂肪組織を除去します。2～3 mLのD-M-E-M-F 12を加え、滅菌済みのメスまたはカミソリの刃を用いて、大きな塊がなくなるまでサンプルを細かく刻みます。組織片を曲げ、タンパク質分解酵素を含む予熱したDMEM 10 millilitersを加え、ロータリーシェーカーを用いて37 degrees Celsiusで1〜3時間インキュベートします。消化酵素を用いて生存可能な霊長類腫瘍細胞を回収する場合、細胞死と細胞マトリックスからの十分な抽出との間で重要なトレードオフが存在します。成功させるには、この消化状態を定期的にモニタリングすることが不可欠です。30分ごとに、懸濁液 20 microlitersをヘモサイトメーターにピペッティングし、顕微鏡を用いて消化度を評価してください。消化が完了したら、フラグメントを5分間静置して沈殿させます。その後、上澄みを15 mLのコニカルポリプロピレンチューブに移します。室温で 200 ×g で10分間遠心分離します。遠心後、上清を注意深く除き、細胞を 1～5 mL のmammosphere medium に再懸濁します。その後、前のセクションで説明した方法に従い、単一細胞懸濁液を調製して播種します。このビデオでは、必要に応じて細胞を分散させるため、25ゲージの注射針を用いて細胞を最大2回までピペッティングします。培養期間の後、デジタルカメラを備えた顕微鏡を用いて、40倍の倍率で細胞を観察します。ランダムに選んだ5つの視野の画像を撮影してください。すべての画像を撮影後、解析ソフトウェアを使用して、直径が40 µm以上のマイクロスフィアの数を決定します。最後に、各ウェル内のマイクロスフィアの数を、各ウェルに播種した細胞数で除し、100を乗じることで、メタスフィア形成効率を算出します。各ウェルからマイクロスフィアを含む培地を15 mLチューブに回収します。各ウェルをPBSで洗浄し、それを回収した培地に追加します。次に、細胞を室温で10分間、115 ×gで遠心分離します。遠心後、上清を捨てて乾燥させます。ペレットをあらかじめ加温した500 µLのtrypsin EDTAに懸濁し、2〜3分間インキュベートします。インキュベーション後、トリプシンを中和するために500 µLのFBSを加え、500 ×gで5分間遠心分離します。遠心終了後、上清を捨て、ペレットを100 µLのmammosphere mediumで再懸濁し、ピペッティングしてスフィアを分散させます。再度、血球計数計を用いて細胞数を計測し、単一細胞懸濁液に分散したかを確認します。そうでない場合は、25ゲージの注射針に最大2回通して単一細胞にし、一次生成で使用したときと同じ密度で新しい超低接着6ウェルプレートに播種します。5〜10日後、40 µmより大きいスフィアをカウントし、前述と同様にスフィア形成能を算出します。マンモスフィアは、本ビデオで説明した通り、上皮性エストロゲン陽性のCF7および間葉系トリプルネガティブのMDA 2 3 1細胞株から育成されました。40 µmより大きいマンモスフィアの数は、各細胞株のスフィア形成能の推定値となります。ここでの最小限の細胞融合凝集は、MCF7では500 cells/cm²、MDA-MB-231では1000 cells/cm²という低密度での播種によって達成されたことに注意してください。このビデオを視聴することで、異なる細胞株または外科的腫瘍サンプルから誘導されたマンモスフェア（mammospheres）の培養および計数方法について十分な理解を得られるはずです。この手順を行う際は、クローン性を確保するために細胞を低密度で播種すること、および外科的サンプルから細胞を抽出する際に高い生存率を確保することが重要であることを忘れないでください。本手順に加えて、目的組織のin vivoでの腫瘍原性を判定するために、免疫不全マウスへの異種移植細胞集団などの他の手法を実施する必要があります。

mammosphere-formation-assay-from-human-breast-cancer-tissues-cell

Research

JoVE Journal

Medicine

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