ヒト乳癌組織および細胞株からマンモスフェア形成アッセイ

フローティングマンモスフィアアッセイは、マウスに移植すると懸濁状態で生存し、腫瘍形成が促進される幹様乳がん細胞のサブセットを調査することができます。 このプロトコルは、in vivo腫瘍形成の代理である球形成能力の便利なin vitro測定を提供すると同時に、幹関連転写ランドスケープの分析を容易にします。

次の実験の全体的な目標は、がん細胞株または腫瘍組織サンプル内の幹様細胞の割合を推定し、連続した継代における自己複製の能力を評価することです。これを行うには、がん細胞株または腫瘍組織をプロセシングして単一細胞懸濁液を生成し、次いでこれを選別してCD 44陽性およびCD 24陰性の細胞サブセットを単離します。細胞を低接着プレートに播種し、成長の時間を与えた後、光学顕微鏡球で調べます。

形成効率は、最初に播種された細胞の数に対して形成された球の数を決定することによって定量化されます。単一細胞懸濁液を生成し、成長のための時間を確保し、球体形成効率を決定するプロセスは、連続した継代にわたって繰り返され、最終的には細胞の経時的な自己再生能力の尺度を提供します。この方法は、自己複製などの幹細胞の機能特性を示す細胞を特定するための簡単なパースペクティブアッセイを提供するだけでなく、in vivo腫瘍に由来する幹細胞の数を定量的に推定します。

球体形成アッセイの中心的な信条は、各球体がクローン細胞に存在する単一の細胞に由来するということです。これらの理由から、細胞密度は、無菌培養フードの下での作業に重大な影響を与えるため、このアッセイで最も重要なパラメーターです。この手順は、70 から 80% の cofluent である MCF 7 または MDA MB 2 3 1 セルから開始します。

フラスコから培地を吸引し、PBSで細胞を2回洗浄します。次に、トリプシンEDTAを添加し、剥離ウインチに続いて10%FBSを含むマンモスフィア培地を添加して2〜6分間インキュベートします。細胞が分離したら、15ミリリットルの円錐形遠心チューブに移し、室温でGの200倍に5分間回転させます。

遠心分離後、センナをデカントします。次に、細胞を1〜5ミリリットルのマノスフェア培地に懸濁し、ピペットで10回上下させて細胞ペレットを分解します。次に、細胞懸濁液をさらに40ミクロンの細胞トレーニングキャップフィルターに流し、取り付けられたチューブに流れを回収します。

単一細胞懸濁液を得るために、再懸濁した細胞の20マイクロリットルのアリコートをヘモサイトメーターに撫で、顕微鏡を使用して調べます。ここで見られるように細胞クラスターが観察された場合は、注射器を使用して、25ゲージの針に懸濁液を1〜2回出し入れします。ここに示すように、細胞が単一細胞懸濁液に分散されたら、蛍光活性化細胞ソーシングまたは磁気活性化細胞ソーシングを介して、CD 44陽性CD24陰性細胞サブセットを分離するために後退します。

LSカラムを使用して、CD 44陽性セルを正に選択します。目的のセルがLSカラムの壁に付着しているため、フロースルーを破棄してから、カラムからセルを取り出します。5ミリリットルのバッファーを適用し、カラムに付属のプランジャーを適用して押し下げ、目的のセルを洗い流します。

次に、LDカラムを使用して、ネガティブセレクションによって母集団をさらに精製します。ここでは、LDカラムに付着したCD24の陽性細胞。CD 24の陰性細胞を含む流れを収集します。

次に、フローサイトメトリーを使用して、すべての単離された細胞の表現型を確認します。トライアンブルー排除法を用いて、細胞懸濁液を適切に希釈した後の生細胞の密度を計算します。完全なマンモス球の2ミリリットルで500から4、000細胞センチメートル四方の6ウェル超低アタッチメントプレートの各ウェルに種をまきます。中程度。

球体が観察されるまで、プレートを乱さないように注意しながら5〜10日間プレートをインキュベートします。球体の直径が少なくとも40ミクロンになるまで培養を続けますが、まだ回転し始めていません。アポトーシス。乳房腫瘍の切除手術を受けている患者からヒト乳がん組織を採取します。

ティッシュは50ミリリットルで最大24時間氷上に保存します。DMEMの滅菌チューブには、100単位/ミリリットル、ペニシリン、100単位/ミリリットルが含まれています。無菌組織培養フードの下で働くストレプトマイシン。

少量の培地を入れた100mmの組織培養皿に、滅菌ハサミ、メス、ピンセットを使用してサンプルを移します。脂肪組織を取り除きます。2〜3ミリリットルのD-M-E-M-F 12を加え、滅菌メスまたはカミソリの刃を使用して、大きな破片がなくなるまでサンプルをミンチにします。

リースは、組織片とタンパク質分解酵素を含む10ミリリットルの予熱DMEMを曲げ、ロータリーシェーカーで摂氏37度で1〜3時間インキュベートします。消化酵素を使用して生存可能な霊長類腫瘍細胞を積み重ねると、細胞死と細胞マトリックスからインへの十分な抽出との間には重大なトレードオフがあります。この消化を定期的に監視するためには、成功が不可欠であることを確認する 30分ごとに、20マイクロリットルの懸濁液をヘモサイトメーターにピペットで移し、顕微鏡を使用して消化の程度を評価します。

消化が完了したら。フラグメントを5分間沈殿させます。次に、すり酸を15ミリリットルの円錐形ポリプロピレンチューブに移します。

Gを200倍、室温で10分間遠心分離します。スピン後、仰臥位剤を慎重にデカントし、細胞を1〜5ミリリットルのマンモスフィア培地に再懸濁します。次に、前のセクションで説明したように、単一細胞懸濁液を調製し、プレートします。

このビデオでは、必要に応じて、25ゲージの注射器で最大2回、細胞を上下に動かして細胞を分散させます。培養期間終了後、デジタルカメラを搭載した顕微鏡で細胞を40倍に拡大して観察します。5 つのランダム フィールドの画像を取得します。

すべての画像が撮影されたら、取得ソフトウェアを使用して、直径40ミクロンを超えるマイクロスフェアの数を決定します。最後に、メタスフィア形成効率を計算します 各ウェル内のマモス球の数を各ウェルに播種された細胞の数に100を掛けた値で割ることにより、各ウェルからのマモス球を含む培地を15ミリリットルのチューブに賭けます。それぞれをPBSでよく洗い、収集した培地に加えます。

次に、細胞をGの115倍で室温で10分間遠心分離します。スピン後、仰臥位のアンドリーを捨てます。ペレットを500マイクロリットルの予熱tryin EDTAに懸濁し、2〜3分間インキュベートします。

インキュベーション後、500マイクロリットルのFBSを加えてトライインを中和し、Gの500倍で5分間遠心分離します。スピンが完了したら、仰臥位を捨て、100マイクロリットルのマンモス球体でペレットを回転させ、中型ピペットを上下に動かして球体を分解します。再度、ヘモサイトメーターを使用して、細胞をカウントし、それらが単一の細胞懸濁液に分散しているかどうかを判断します。

そうでない場合は、25ゲージの注射器に最大2回通して単一細胞を取得し、細胞を新しい超低細胞に播種します。添付資料6は、1次世代で使用したのと同じ密度でウェルプレートを5〜10日後に、40ミクロンより大きい球をカウントし、球形成効率を推定するために前回と同様に恐怖形成効率を算出する。このビデオで説明されているように、上皮性エストロゲン陽性CF 7およびam間葉系トリプルネガティブMDA2 3 1細胞株から雰囲気を増殖させた、40ミクロンを超えるマンモス球のカウントは、各細胞株の球体形成効率の推定値を提供する。

ここで見られる最小の細胞融合凝集は、MCF 7では500セル/センチメートル四方、MDAでは1000セル/センチメートル四方の低密度プレーティングによって達成されたことに注意してください2 3 1。このビデオを見れば、異なる細胞株または外科的腫瘍サンプルに由来するマンモ球の増殖方法とカウント方法を十分に理解できるはずです。この手順を試みる際には、クローン性を確保し、手術サンプルから細胞を抽出するときに高い割合の細胞が生存可能であることを確認するために、低密度で細胞を播種することを覚えておくことが重要です。

この手順に加えて、免疫不全マウスへの異種移植細胞集団などの他の方法を実行して、目的の組織のin vivo腫瘍性を決定する必要があります。