Name: 透過性に骨格筋線維によって生成される最大等尺性力の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: 学ぶ透過性骨格筋線維の最大等尺性力測定法。化学的透過化した単一線維から収縮特性を評価し、レーザー干渉パターンで最適サルコメア長を設定する技術を解説。筋生理学の研究に有用です。

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<li>Gumucio, J. P., Davis, M. E., Bradley, J. R., Stafford, P. L., Schiffman, C. J., Lynch, E. B., Claflin, D. R., Bedi, A., Mendias, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotator+cuff+tear+reduces+muscle+fiber+specific+force+production+and+induces+macrophage+accumulation+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Rotator cuff tear reduces muscle fiber specific force production and induces macrophage accumulation and autophagy.</a> J Orthop Res. 30 (12), 1963-1970 (2012).</li>
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<li>Claflin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+high+and+low-velocity+resistance+training+on+the+contractile+properties+of+skeletal+muscle+fibers+from+young+and+older+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of high and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans.</a> J Appl Physiol. 111, 1021-1030 (2011).</li>
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<li>Malisoux, L., Francaux, M., Theisen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+do+single-fiber+studies+tell+us+about+exercise+training%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">What do single-fiber studies tell us about exercise training.</a> Med Sci Sports Exerc. 39 (7), 1051-1060 (2007).</li>
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<li>Trappe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+spaceflight%2C+simulated+spaceflight+and+countermeasures+on+single+muscle+fiber+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gravit+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of spaceflight, simulated spaceflight and countermeasures on single muscle fiber physiology.</a> J Gravit Physiol. 9 (1), 323-326 (2002).</li>
<li>Malisoux, L., Jamart, C., Delplace, K., Nielens, H., Francaux, M., Thiesen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+long-term+muscle+paralysis+on+human+single+fiber+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of long-term muscle paralysis on human single fiber mechanics.</a> J Appl Physiol. 102, 340-449 (2006).</li>
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<li>Mendias, C. L., Marcin, J. E., Calerdon, D. R., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+properties+of+EDL+and+soleus+muscles+of+myostatin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Contractile properties of EDL and soleus muscles of myostatin-deficient mice.</a> J Appl Physiol. 101, 898-905 (2006).</li>
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<li>Edman, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+properties+of+mouse+single+muscle+fibers%2C+a+comparison+with+amphibian+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Contractile properties of mouse single muscle fibers, a comparison with amphibian muscle fibers.</a> J Exp Biol. 208, 1905-1913 (2005).</li>
<li>Phillips, S. K., Woledge, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+isometric+force%2C+maximum+power+and+isometric+heat+rate+as+a+function+of+sarcomere+length+in+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%22%5BJournal%5D)">A comparison of isometric force, maximum power and isometric heat rate as a function of sarcomere length in mouse skeletal muscle.</a> Pflügers Archiv. 420, 578-583 (1992).</li>
<li>Stephenson, D. G., Williams, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+sarcomere+length+on+the+force-pCa+relation+in+fast+and+slow-twitch+skinned+muscle+fibres+from+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of sarcomere length on the force-pCa relation in fast and slow-twitch skinned muscle fibres from the rat.</a> J Physiol. 333, 637-653 (1982).</li>
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透過性の単一骨格筋線維の収縮特性の評価は、コンテキストの多種多様な筋機能を調査するために使用されます。例としては、繊維構造と機能に12、運動10,13,14、宇宙飛行15、傷害2,3,16、薬物治療17,18、疾患19および遺伝子操作20,21の老化の影響を評価した研究があります。による直接ネイティブ構成で筋原線維の収縮性能を評価する能力に、この技術は、信号伝送と励起誘発性カルシウム放出神経筋に存在する潜在的な交絡効果の筋原繊維の機能は存在しないの理解を形成するのに魅力的なプラットフォームを提供します研究中のシステムに含まれています。また、単繊維の機能テストは、これらのような収縮タンパク質同定の結果を補完するために使用することができ免疫組織化学またはゲル電気泳動+ウエスタンブロット22を経て得られました。 骨格筋の主要な機能の一つは、力を生成することです。したがって、SF 0、収縮システムの固有の力発生能力の尺度は、筋肉の生理学に大きな関心があります。 SF o の信頼性の推定値は、繊維CSAとF Oの両方の正確な措置を必要とします。繊維は、断面において、一般的に、円形でもない、またその長さに沿ってCSAが均一であるので、CSAを推定する際に、細心の注意を払うべきです。この目的のために、測定は、90°で分離された2つの観点から、それぞれの位置で、繊維の長さに沿ったいくつかの場所で作られています。 F o の信頼性の尺度は、カルシウム濃度Tと活性化溶液を用い、厚い及び薄いフィラメントの重なりを最大にするために、筋節の長さを調整する、受動的な力を占めを含むいくつかの詳細に注意を必要とします最大活性化ハット結果は、所望の実験温度に維持し、実験の日の前の繊維の最適な保存条件（温度及び時間）を維持します。 ここで説明する手順は、最大等尺性力を評価するための手順を説明しているが、それは骨格筋線維の他の重要な機能の品質を評価することがしばしば望ましいです。これは、繊維の追加の機械的操作を含むように実験プロトコルを拡張することによって達成することができます。例えば、繊維は、異なる負荷の一連に対して短縮する速度の測定は、力のパワーおよび速度パワー関係は10,23,24を計算することが可能な力-速度関係の決意を可能にします。また、無負荷短縮の速度は、弛み誘発短縮一連の工程を適用することから成る「たるみ試験」25、及びmeasuriを用いることによって決定することができますたるみを除去するために、ファイバによって必要な時間をngの。頻繁に報告されている別の運動パラメータが一時的にすべてのクロスブリッジ26を切り離し機械的摂動次力再開発のためのK TR、速度定数です。最後に、カルシウム濃度と活性力発生（「強制-PCAの関係」）との間の関係は、多くの場合、興味18であり、収縮を活性化するための閾値以下の範囲のカルシウム濃度を有する一連の溶液に繊維を曝すことによって決定することができます最大活性化とそのための最大の力（FのO）を誘発するのに十分なものにシステム。 上記の機器の多くは単繊維の収縮性を評価するために必要とされているが、他の機器では絶対に必要というわけではありません。長さコントローラは、例えば、繊維の急速なまたは正確な延長または短縮を必要とする任意の実験プロトコルのために不可欠です、（力レコード内のゼロ力レベルはまだいくつかの手段によって識別されなければならないが）が、最大等尺性力を評価するために絶対に必要ではありません。実験室内に繊維を配置するときの断面積を評価するのに有用ながら、側面からの繊維の観察を可能にするプリズムは、絶対に必要ではありません。さらに、種々の実験の溶液に繊維を露出させるための代替手段は、チャンバーの手動操作系または溶液の迅速な充填および排出を可能にする単一のチャンバを工夫するなど、使用することができます。このような15°Cのサブ生理学的実験の温度は一般的に機械的な測定1,2,3,5,8,12,17,27の再現性を改善するために使用される最後に、それは他の温度23に有効なデータを生成することができます溶液特性（ 等カルシウム濃度、pH）に対する温度の影響を考慮する限り、28。 </P&gt; 試験液の組成は、ここで説明する透過処理繊維技術の最も重要な側面の一つです。溶液組成物に関する検討事項は複雑であり、この記事の範囲を超えています。プロトコルセクションの手順5で説明したソリューションは、一定のイオン強度、陽イオン組成、および浸透圧6,29を維持しながら解決策を活性化に事前に活性化からの転送時に、透過性繊維の急速な活性化に重点を置いて設計されています。溶液組成物への他のアプローチは、他の研究グループによる顕著な成功を収めて使用され、一般的に公開された結合定数と計算ツール27,30,31を利用することがされています。様々な活性化溶液中のカルシウムイオンの濃度は、このような力-PCAの評価として最大下の活性化を含む研究において特に重要です。そのようなもののような繊維が完全に活性化された実験について説明しますDここで、活性化溶液中のカルシウム濃度は、典型的には、その正確な知識があまり重要で作る最大の力を達成するために必要な余裕によって越えます。クレアチンリン酸の添加は、そうでない場合は、収縮活性に関連するであろうintramyofibrillar ATPおよびADPの変動を緩衝するために重要です。クレアチンキナーゼは、ADPのクレアチンリン酸からのリン酸転移を触媒するために必要とされます。高温での作業や高速ファイバ32の高速短縮を測定するなど、高いATP離職率につながる実験条件の下では、クレアチンキナーゼは、繊維に結合したままで、内因性のクレアチンキナーゼを補充するために溶液に添加されなければなりません。あまり厳しい実験条件のために、ATP再生系27はあまり重要です。 透過性単繊維技術の制限は、以下のものが挙げられます。これらのテストによって生成されたデータは、定義します実験装置に取り付けられた特定の筋原繊維ユニットの収縮特性。したがって、これは、セグメントが順番に、筋肉内の繊維の総数のごく一部を表す、取得された全体多核繊維のごく一部を捕捉します。研究者らは、このように、慎重に実験から引き出された任意の結論をサポートするために必要なサンプリングを検討する必要があります。さらに、繊維機能の運動トレーニングの介入の影響を評価する評価した繊維が実際にトレーニング中に動員されたことを前提としています。プロトコルは、繊維の自然な細胞内環境を模倣しようとしたが、筋細胞膜の透過化処理は、非特異的であり、必ずしも可溶性の細胞内成分が自由に入浴液中に拡散することができます。膜透過性のさらなる結果は、繊維体積33に腫脹によって証明浸透圧バランスの変化です。ザ繊維の膨潤は、筋フィラメントシステム34,35の減少カルシウム感受性の結果、アクチンとミオシンフィラメントの間の距離が大きくなりますが、大規模な、浸透活性化合物34の導入によって逆転させることができます。考慮すべき最後の制限は、実験装置に繊維を取り付けるために使用される技術の結果です。これは、常に機能欠損に出席して、取付点で近くフィラメントシステム内の空間的関係を歪める必要です。具体的には、時の繊維および取り付け点に隣接する領域は、機能的に侵害され、それによって、測定システムへの人為シリーズ弾性を貢献しています。 要約すると、我々は、 インビトロで化学的に透過性骨格筋線維の力発生能力を評価する手段を記載しています。この記事の焦点は、最大等尺性力の評価になっているがgeneratinヒト骨格筋線維gの容量、実験的なアプローチは、修飾された哺乳動物または他の種の範囲にわたって速度パラメータとの関係の多様を決定するために拡張することができます。

骨格筋の主要な機能は、力を生成することです。筋力は運動神経活動電位、神経筋伝達、筋線維の活動電位、細胞内カルシウムの放出、および規制と収縮タンパク質の系の活性化が含まれる事象の複雑なシーケンスをin vivoで誘発されます。力発生は、この配列の最終的な結果であるので、力の赤字は、個々のステップのうちの1つまたは複数の障害が原因で発生することが。透過処理繊維の準備の重要な属性は、筋原線維装置が残りに関連した唯一の規制および収縮機能を、in vivoでの力発生のために必要な手順のほとんどを排除することです。研究者は、カルシウムとエネルギー（ATP）を活性化の配信の制御を想定しており、それらの天然の共同で、単離された規制や収縮構造の評価を可能にする簡略化したシステムで報われますnfiguration。 in vivoで観察された筋機能の変化を評価する際に透過性骨格筋線維を用いた力の測定は、このように有用です。例えば、私たちは、ミオスタチン欠損マウス1から繊維の力発生能力を特徴づけるために持続的な筋力低下の原因を評価するためにこの技術を使用している慢性腱板涙2,3次を示しました。 現代の透過処理繊維の方法論は、初期の影響力の研究4,5にトレースし、多数の研究グループによって現在使用中であることができます。技術は、文献に記載されているが、それらはまだビデオフォーマットで提示されていません。この記事の目的は、化学的に透過性に骨格筋試料から単繊維の最大の力を発生する能力を測定するための更新、有効かつ信頼性の高い技術を説明することです。これを達成するために、個々の繊維セグメントは、（本明細書で言及しました̶0;繊維」）繊維のプレ透過性バンドルから抽出され、リラックスした溶液、&lt;10nmのカルシウム濃度となっている決定的な特徴を含む実験用チャンバ内に配置されています。繊維は、次に、力変換器の一方の端部と、長さ制御の他方の端部に取り付けられています。最適なサルコメア長で開催された繊維では、最大活性化し、それによって最大の等尺性収縮力を誘発するのに十分なカルシウム濃度を有する活性化溶液に移されます。力データは、取得された格納されたパーソナルコンピュータを用いて分析します。

<table><tbody><tr><td>キャップ付きポリスチレン培養試験管</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-956-3D</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml スクリューキャップ微量遠心機</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>02-681-334</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml マイクロ遠心キャップ Oリング付き</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>02-681-358</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心分離機用クライオボックス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>5055-5005</td><td></td></tr><tr><td>pHメーター</td><td>メトラー・トレド</td><td>FE20</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック&nbsp;</td><td>08-757-11YZ</td><td></td></tr><tr><td>非滅菌縫合糸 10-0 モノフィラメント</td><td>アサウェイ ライン トワイン</td><td>S30002</td><td></td></tr><tr><td>昆虫ピン</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>鉗子 - デュモン #5</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ解剖ハサミ</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ライカ マイクロシステム</td><td>MZ8</td><td></td></tr><tr><td>マイクロメーターは</td><td>パーカーハネフィン</td><td>3936M</td><td></td></tr><tr><td>温度計</td><td>Physitemp</td><td>BAT-12</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバスサーキュレーターを駆動します&nbsp;</td><td>Neslab Instruments</td><td>RTE-111</td><td></td></tr><tr><td>温度調節器</td><td>Aplha Omega Instruments</td><td>Series 800</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW ソフトウェア</td><td>National</td> <td>Instruments-Computer</td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td>Varied-Chamber</td><td></td></tr> <tr><td>system</td><td>Aurora Scientific</td><td>802D</td><td></td></tr><tr><td>長さ調節器</td><td>Aurora Scientific</td><td>312C</td><td></td></tr><tr><td>力変換器</td><td>Aurora Scientific</td><td>403A</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">試薬</td></tr><tr><td>K-proprionate</td><td>TCI America</td><td>P0510</td><td></td></tr><tr><td>Imadizole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0125</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&bull;6H20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Brij 58</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5884</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (酸)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0396</td><td></td></tr><tr><td>Na2H2ATP&bull;0.56H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (酸)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>MgO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>529699</td><td></td></tr><tr><td>HDTA (酸)</td><td>TCI America</td><td>D2019</td><td></td></tr><tr><td>CaCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>KOH (1 N)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>35113</td><td></td></tr><tr><td>HCL (1 N)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>318949</td><td></td></tr><tr><td>Na2CrP&bull;4H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>pH 10 標準</td><td>Fisher Scientific</td><td>SB115</td><td></td></tr><tr><td>pH 7 標準</td><td>Fisher Scientific</td><td>SB107</td><td></td></tr></tbody></table>

透過性に骨格筋線維によって生成される最大等尺性力の測定

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

化学的にスキンされた、または透過処理された骨格筋線維の収縮特性の分析は、単一の筋肉細胞のレベルで筋肉機能を評価するための強力な手段を提供します。単一筋線維の研究は、基礎科学と臨床研究の両方で有用です。基礎研究では、単一筋線維の収縮性測定により、力産生の基本的なメカニズムの調査と、遺伝子操作の文脈での筋機能の解析が可能になります。臨床的には、単一筋線維研究は、損傷や疾患が筋肉機能に及ぼす影響について有用な洞察を提供し、筋肉の病状の理解を導くために使用できる可能性があります。このビデオ記事では、個々の骨格筋線維セグメントを準備して分離し、それを力測定装置に取り付け、それを活性化して最大等尺性力を生成し、生成された力を正規化する目的でその断面積を推定するために必要な手順を概説します。

健康、化学的に透過性に単繊維の形状が均一に表示され、高倍率で見たときに、一貫した線条の間隔を持っている必要があります。鉗子で操作したときに柔軟性がないか、明らかな構造的損傷を持っている繊維は、廃棄されるべきです。 ステップ15の間に採取高倍率のデジタル画像は、繊維の中央部に沿って5対の直径の測定のために分析されます。繊維CSAは、 図7（a）に示すように楕円形の断面を仮定し、5個々のCSAの測定値を平均。 図7Bはまた、1つのビューの繊維寸法は、他のビューでペアリングの寸法と比較して有意に異なることができる方法を説明するのに役立つ（すなわち、クロス推定されていますセクション）は、一般的には、丸くなっていません。 人間の低速および高速の繊維からの代表的な力のトレースは、それぞれ、 図8Aおよび8Bに示されています。 VOLTAG力変換器の電子出力は、テスト中に取得され、データ収集および分析ソフトウェア（LabVIEWの）を使用して（Mn）を強制的に変換される。 図9は、減算することにより算出された最大活性力（F o を ） を評価するために使用する方法を示しれます最適な筋節長で繊維を維持するのに必要な力弛緩状態にある間に（受動的な力、F P）、最大繊維活性化の間に開発され、最大等尺力（合力、F T）から。ゼロの力に対応する力変換器の出力は、一般的に、別の入浴室の各々のために異なるので、我々は簡単で、ゼロ力レベルを捕捉するために、両方のプレ活性化し、活性化溶液中で繊維を緩め実験記録。繊維CSAによる最大活性力の正規化は、特定の力（SF 0）のより有益な値を生成するために使用されます。それは考慮に入れ、繊維のCSAがかかるので、SFのO </sUB&gt;これにより、異なるサイズの繊維との間の機能の比較を可能にする、繊維の収縮装置の固有の力発生能力の尺度を提供します。しかしながら、CSAの測定は、他の細胞内構造占める割合対収縮フィラメントにより占有繊維の割合を区別することができないことに留意すべきです。 クラフリンらから健康な成人の繊維の代表的な特性。人間のために2011年10、Mendias らマウスとGumucio ら 2011 1。ラットの2012年2 表3に示すデータはすべて使用して生成された表3に詳述されています。この資料に記載された技術。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="text-align:center"><tbody><tr><td rowspan="3" style="border:0px #fff solid"></td><td colspan="4"> 人間 （外側広筋） </stronG&gt; </td><td> マウス （EDL） </td><td nowrap="nowrap"> ラット （棘） </td></tr><tr><td colspan="2">男性</td><td colspan="2">女性</td><td>男性</td><td>男性</td></tr><tr><td>タイプ1 </td><td>タイプ2A </td><td>タイプ1 </td><td>タイプ2A </td><td> （型付きではありません） </td><td> （型付きではありません） </td></tr><tr><td> CSA（μmの2） </td><td> 6900 - 4880 </td><td> 8380 - 5270 </td><td> 5470 - 3870 </td><td> 5610 - 4010 </td><td> 3080 - 1850 </td><td> 8010 - 5290 </td></tr><tr><td> FのO（MN） </td><td> 0.79から1.17 </td><td> 1.02から1.54 </td><td> 0.64から0.97 </td><td> 0.71から1.07 </td><td> 0.14から0.25 </td><td> 0.55から0.97 </td></tr><tr><td> SFのO（キロパスカル） </td><td> 142から182 </td><td> 165から210 </td><td> 156から193 </td><td> 172から214 </td><td> 67から94 </td><td> 102から131 </td></tr><tr><td> N </td><td> 129 </td><td> 160 </td><td> 149 </td><td> 207 </td><td> 37 </td><td> 94 </td></tr></tbody></table> 人間広筋からの健康な成人の繊維の表3.一般的な特性は10 lateralis、マウス長指伸筋1およびラット棘は2筋肉。最適な筋節の長さは、両方のマウスのためのヒト繊維7,8 2.7ミクロンと2.5ミクロン（36に設定しました37）およびラット繊維（38）。実験L Fの範囲 （25 番目と75 番目の四分位数）は、それぞれ1.39〜1.73ミリメートル、1.17〜1.53ミリメートルとヒト、マウス、ラットのための1.32〜1.59ミリメートルでした。示された範囲は、25 番目と75 番目の四分位数を示し、nは試験された繊維の数です。 テスト中に経験した最も一般的な問題は、力RESPONSになる縫合糸ループスリップを含み、このような図10（a）に示すような「キャッチ」し、急に向かってまたは（中断）に戻る力応答をもたらす繊維の部分的または完全な厚さの涙、ゼロの電子繊維はまだ解決策を活性化中に浸漬されている間（ 図10B）。スリップ、涙やブレークが実験中に発生した場合、繊維の失敗の記録を維持することも11有益であることができるが、繊維が破棄されるべきであり、データは除外しました。発生する可能性のある他の否定的な結果は、事前活性化溶液（ 図10C）にある間に繊維の早期活性化です。予備活性化溶液中の部分的な活性化は、（ すなわち、中のカルシウム濃度の意図しない上昇よくプレ活性化）有意な交差ウェル汚染を示唆しています。この例では、すべての浴は、吸引されるべきであり、脱イオン水で十分にすすぎました。チャンバ間の分割面を乾燥することもrecommenですこれらの領域中の水分や結露などのDEDは風呂の間、溶液のウィッキングにつながる可能性があります。データを含めるか除外するかどうかは、最終的には実験的な焦点に依存し、調査を設計する際にこのように考慮されるべきです。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig1.jpg" /> 図1：縫合糸ループ（10-0モノフィラメントナイロン縫合糸）。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig2.jpg" /> 図2：バンドル切開鉗子は左手にあるが、顕微解剖はさみは右手にあります。赤い線は、繊維の縦軸と手首とはさみの良好な姿勢を示しています。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig3.jpg" /> 図3： </stron標識されたコンポーネントとG&gt;（A）試験装置。 （a）は、透明な底部との実験室。 （b）は長さコントローラ。 （C）フォース·トランスデューサ。 （d）の光源。デジタル表示（e）の長さコントローラのxyzマイクロドライブ。デジタル表示（F）ステージマイクロドライブ。 （G）フォーストランスデューサのxyzマイクロドライブ。 （H）に較正レーザー回折ターゲットスクリーンのためのプラットフォーム。 （I）除振台。 （B）は、実験室のクローズアップビュー。 （j）の長コントローラから延びるステンレス取付面。 （k）は 、力変換器から延びるステンレス取付面。 （L）サイドビュープリズム。 （m）は 、熱電冷却モジュール用ハウジング。室TEを報告するための（n）の熱電対mperature。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig4.jpg" /> 図4：実験室に解剖皿から繊維を転送するために使用される改変された100μlのピペットチップ。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig5.jpg" /> 図5：実験装置の上に単繊維のマ ​​ウント（A）を調製した縫合糸ループは、ステンレス製の取付面にねじ込ま。 （B）光ファイバは、実験室に移しました。 （C）光ファイバを除去し、過剰な縫合糸で縫合糸ループの最初のペアによってステンレス鋼取付面に固定します。縫合糸ループの（D）第二の対は、第1の縫合糸ループの上にねじ山及び場所に結びました。 <img alt="図6"SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 52695 / 52695fig6.jpg&quot; /&gt; 図6：サルコメア長さを較正ターゲットスクリーン上にレーザー干渉パターンを投影することによって評価される（a）は、レーザ光 ​​源。 （b）のミラー。 （c）の画面を対象とします。 （d）のレーザー干渉パターン。 <img alt="図7A" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7A.jpg" /><img alt="図7B" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7B.jpg" /> 図7：最適な筋節長（人間= 2.7ミクロン）で繊維断面積の（A）決意。楕円形の断面を想定すると、CSAは、繊維中央部に沿って5箇所のそれぞれについて計算され、5個々の測定値の平均を繊維CSAとして報告されます。図2aは、トップビューの直径を表し、あります<html>楕円の一方の軸は、図​​2（b）は側面直径を表し、楕円の他方の軸です。 （B）は上面と側面の両方で撮影した5相当径測定のそれぞれを示す代表的なファイバ像。 <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig8.jpg" /> 図8：健康なヒト外側広筋からの代表的な力トレースは筋線維をlateralis（A）1繊維（CSA：5710μm2で、FのO：0.89 MnおよびSFのO：156キロパスカル）を入力します。。 （B）は図2（a）繊維（：9510μm2で、F O：1.66 MnおよびSFのO：174キロパスカルCSA）を入力します。繊維ミオシン重鎖タイプは、電気泳動分離及び銀染色技術22を使用することによって決定しました。 OAD / 52695 / 52695fig9.jpg &quot;/&gt; 図9：最大活性力（F 0）の計算前活性化溶液中に開始長コントローラのたるみ誘導移動中の繊維の力応答の（a）の拡大図。 F Pは、安静時に繊維と2.7ミクロンの筋節の長さを維持するために必要な力です。 （b）は長さコントローラたるみ誘導運動の拡大図。 F P -そのF 0 = F Tに注意してください。 <img alt="図10" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig10.jpg" /> 図10：力の立ち上がり時に力トレースで「キャッチ」によって証明（A）縫合糸ループスリップ、。ループは、繊維を活性化する前に、安全であるかどうかを確認してください。 （B）活性化中の繊維の休憩。縫合糸ループの場所の間に乏しい繊維の完全性や積極的な繊維処理が原因である可能性がありメント。原因のCa 2+とのプレ活性化チャンバーの汚染を（C）早期の部分的な繊維の活性化。

化学的に皮を剥がれ、または透過化、骨格筋線維の収縮特性の分析は、単一の筋細胞のレベルでの筋機能を評価することにより、強力な手段を提供しています。この記事では、製造するのに有効かつ信頼性の高い技術の概要を説明し、試験は、in vitroでの骨格筋線維を透過処理しました。

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

この手順の全体的な目的は、化学的に透過させた骨格筋サンプルの個々の筋線維における最大等尺性筋力発生能を測定することです。まず、筋線維膜を化学洗剤にさらすことで、細胞外液と細胞内液の間の障壁を取り除きます。次に、少数の筋線維束から個々の筋線維を抽出し、実験装置に取り付けます。次に、レーザー干渉パターンを用いて、個々の筋線維における最適なサルコメア長を設定します。最後に、カルシウムを投与し、最大等尺性収縮力を誘発します。最終的に、この透過単一筋線維法により、全筋の構造に伴う複雑さを排除して、骨格筋の収縮特性を評価することができます。本プロトコルの成功に不可欠な重要なステップを習得するのは困難な場合があるため、この手法を視覚的に的に示すことが有用です。まず、付属のテキストプロトコルに従って、解剖用、保存用、および試験用の溶液を準備します。次に、ピンセットを使用して、USP 10 ゼロのモノフィラメントナイロン縫合糸から縫合ループを作成します。ダブルオーバーハンドノットの手法を用い、テストするすべての繊維について4つのループを準備します。結び目を作製後、顕微鏡下で確認しながら、その大きさを直径約 750 µm まで縮小させます。その際、IPS GTIのマーキングをガイドとして使用してください。次に、余分な縫合糸を切り取り、ループ部分と両端に500 µmの短い末端のみを残します。オープンバイオプシーまたは針生検で採取した少量の筋肉組織を、冷却した解剖用溶液の入ったディッシュに移し、組織が完全に浸漬されるように解剖用溶液を追加します。顕微鏡下でサンプルを確認し、筋線維の長軸が操作者の右肩方向に向くように調整します。次に、左手のピンセットと右手のマイクロ解剖用ハサミでサンプルの四隅を固定し、ディッシュに固定します。繊維間の縦方向の縁に沿って、束を慎重に解剖し始めます。ピンセットやピンによって損傷した組織は取り除き、廃棄してください。解剖工程の後、束を解剖液から、非イオン性界面活性剤を添加した冷えた新鮮な解剖液 2.5 mL が入った 3 mL バイアルに移します。サンプルを氷上で 30 分間インキュベートし、時折穏やかに撹拌してください。その際、インキュベーションの間、束が常に液中に浸っていることを確認してください。その後、束を新鮮な解剖液が入ったバイアルに移し、軽く短時間撹拌して、残っている界面活性剤を除去します。すすぎが終わったら、束を冷やした保存液の入ったバイアルに移し、4 °Cで一晩インキュベートします。翌日、4 °Cの保存場所からバイアルを取り出し、すべての束を薬杯または解剖皿に移します。保存準備として、200 ～ 400 µLの新しい保存液を満たした個別にラベル付けしたクライオバイアルに束を移し、束がチューブの壁に張り付いていないか、または表面に浮いていないかを確認します。次にチューブにキャップをし、サンプルを-80 °Cで保存します。ここに示し、付属のテキストプロトコルに記載されているような実験装置を準備します。そして、1番目の実験チャンバーに弛緩溶液を、2番目のチャンバーに事前再活性化溶液を、3番目のチャンバーに活性化溶液を満たします。装置を弛緩液に浸した状態で、チャンバー内の温度を15 °Cで安定するまで調整します。準備した2つの縫合ループを、力変換器と長さ制御器の両方から伸びているステンレス製のアタッチメント表面に通します。次に、目的の繊維束を氷上で約15分間解凍し、新鮮で冷却された弛緩液を満たしたシリコンエラストマーコーティング済みのペトリ皿に移します。束の両端をピンで固定し、ピンセットを用いて完全に浸漬されていることを確認します。端にある1本の繊維をつかみ、長軸方向に沿ってスムーズに抽出します。繊維と細胞外マトリックスの間の癒着により過度な張力がかかり、結果として伸展による損傷を招く可能性があるため、束から繊維を抽出する際は注意が必要です。抽出後、少量の弛緩液とともにファイバーを改造したピペットチップに入れ、ピンセットで慎重に誘導しながら、弛緩液が入った実験チャンバーに移動させます。ファイバーをピペットチップから取り出し、長さコントローラーに固定します。1つ目の縫合ループを使用して、ファイバーのもう一方の端を力トランスデューサー方向へ操作し、同様の手順でファイバーを固定します。マイクロ解剖用鋏を用いて、余分な縫合糸を取り除きます。次に、2回めのループを1回めのループに通し、長さ調節器の取り付け面端から0.2ミリメートル以内の位置でファイバーを固定します。ファイバーの力センサー端側でも、同様に2回めのループを作成して固定します。実験チャンバーの側壁とファイバーを平行にするため、Y軸方向に長さコントローラーの位置を調整します。次に、プリズムサイドビューでファイバーを確認し、ファイバーがチャンバーの底面と平行になるまで、Z軸方向に長さコントローラーの位置を調整します。ファイバーに何らかの損傷がある場合は、そのファイバーを廃棄し、新しいファイバーを取り付けてください。レーザーをオンにし、レーザーがファイバーの中心を通過するようにステージの位置を調整します。次に、ターゲットスクリーン上に目的の回折光の間隔が観察されるまで、長さコントローラーのX軸マイクロメータドライバーを用いてファイバーの張力を増減させ、サルコメア長を設定します。最適なサルコメア長が設定されたら、最も内側にある2つの縫合糸間の距離を測定します。接眼レンズの垂直十字線が内側の縫合線の最も内側の境界に合うようにチャンバーを配置し、ゼロ点に設定します。マイクロメータードライブのデジタル読み取り値を用いて、接眼レンズの垂直十字線が最も内側の縫合線と一致するまで、顕微鏡に対してステージをx軸方向に移動させます。デジタルディスプレイに表示される繊維の長さを確認し、その長さを維持した状態で、顕微鏡搭載カメラを用いて繊維中央部の上面および側面からの高倍率画像を撮影します。これらの画像を用いて、繊維の断面積を算出します。チャンバー制御ソフトウェアを使用して、繊維を事前再活性化溶液を含むチャンバーに移動させ、そこで3分間インキュベートします。繊維を不活性化溶液に浸している間に受動張力を測定し、その後、繊維を活性化溶液を含むチャンバーに移動させて、急速な上昇に続き張力がプラトーに達したことで示される最大等尺性筋力を発生させます。次に、長さコントローラーを使用して、ファイバーの固定点間の距離を急激かつ短時間で大きく短縮させ、その後、迅速に元の長さに戻すことで、ゼロに対応する力変換器の出力を特定します。ここに示している力は、楕円形のファイバーを上からおよび横から見たビューです。断面積は、ファイバーの長さに沿って5点の直径を測定し、得られた5つの面積の平均値を算出することで決定しました。このビデオで示している手法を用いて、ヒトの緩徐型および速筋線維から得られた力トレースを測定したところ、速筋線維は緩徐型線維よりも高い速度で力を発生することが示されました。ここでは、ヒト、マウス、およびラットの筋線維の代表的な特性を測定し、提示しています。示されている範囲は第25〜75四分位数を表し、Nはテストした線維数を示します。種によって比力が大きく異なることに注意してください。ここに概説する手順により、単一の骨格筋線維の最大固有の力生成能を評価でき、さらに、長さ-力関係、力-速度関係、および力-カルシウム関係など、骨格筋生理学における重要な側面を含む追加の介入を加えることが可能です。

measurement-maximum-isometric-force-generated-permeabilized-skeletal

Research

JoVE Journal

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学ぶ透過性骨格筋線維の最大等尺性力測定法。化学的透過化した単一線維から収縮特性を評価し、レーザー干渉パターンで最適サルコメア長を設定する技術を解説。筋生理学の研究に有用です。

透過性に骨格筋線維によって生成される最大等尺性力の測定

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