透過性に骨格筋線維によって生成される最大等尺性力の測定
June 16th, 2015
化学的に皮を剥がれ、または透過化、骨格筋線維の収縮特性の分析は、単一の筋細胞のレベルでの筋機能を評価することにより、強力な手段を提供しています。この記事では、製造するのに有効かつ信頼性の高い技術の概要を説明し、試験は、in vitroでの骨格筋線維を透過処理しました。
この手順の全体的な目標は、化学的に透過する骨格筋サンプルから個々の繊維の最大等尺性力生成能力を測定することです。これは、最初に筋線維膜を化学界面活性剤にさらし、それによって細胞外内容物と細胞内内容物の間の障壁を取り除くことによって達成されます。2番目のステップは、繊維の小さな束から個々の繊維を抽出し、それを実験装置に取り付けることです。
次に、レーザー干渉パターンを使用して、個々のファイバーに最適なサルコメアの長さを設定します。最後に、カルシウムを投与して、最大の等尺性収縮力を引き出します。最終的に、パーミー単繊維技術は、全筋構造に関連する複雑さなしに、骨格筋の収縮特性の評価を提供します。
この手法の視覚的なデモンストレーションは、プロトコルを正常に実行するための主要なステップを学ぶのが難しい場合があるため、有用です。まず、付属のテキストプロトコルに記載されている解剖、保存、および試験溶液を準備します。次に、鉗子を使用して、USP 10ゼロモノフィラメントナイロン縫合糸のストランドから縫合ループを準備します。
ダブルオーバーハンドノット技術を使用して、テストする繊維ごとに4つのループを準備します。形成されたら、結び目を顕微鏡下に置き、そのサイズを直径約750マイクロメートルに縮小します。IPS GTI マーキングをガイドとして使用します。
次に、余分な縫合糸をトリミングし、ループと小さな500マイクロメートルのテールを両側に残します。開腹生検または針生検によって得られた筋肉組織の小さな塊を、冷やした解剖液が入った皿に移し、さらに解剖液を追加して、組織が水没したままになるようにします。顕微鏡でサンプルを検査し、ファイバーの縦軸を研究者の右肩に向けて整列するように操作します。
次に、左手に鉗子、右手にマイクロ解剖ハサミでサンプルを角に固定して、サンプルを皿に固定します。繊維間の縦方向の縁に沿って束を静かに解剖し始めます。鉗子やピンによって損傷した組織をすべて取り除いて廃棄します。
解剖プロセスの結果として、解剖溶液からのバンドルを、非イオン性界面活性剤を添加した2.5ミリリットルの新鮮な冷解剖液を含む3ミリリットルのバイアルに移します。サンプルを氷上で30分間インキュベートし、時折穏やかに攪拌しながら、インキュベーション中、バンドルが水没したままになるようにします。次に、束を新鮮な解剖液が入ったバイアルに移し、穏やかに短時間攪拌して残っている洗剤を取り除きます。
すすぎたら、バンドルを冷やした保存溶液が入ったバイアルに移し、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、バイアルを摂氏4度で保管庫から取り出し、すべての束を薬カップまたは解剖皿に移します。保存の準備として、バンドルを個々にラベル付けしたクライオバイアルに移し、200〜400マイクロリットルの新鮮な保存溶液を充填し、バンドルがチューブの側面に付着したり、表面に浮いたりしないようにします。
次に、チューブにキャップをし、サンプルを摂氏マイナス80度で保管します。ここに示されているような実験装置をセットアップし、付属のテキストプロトコルに記述されています。次に、最初の実験チャンバーをリラックス溶液で満たし、2番目のチャンバーを事前再活性化溶液で、3番目のチャンバーを活性化溶液で満たします。
チャンバー内の温度が摂氏15度で安定するまで調整し、装置をリラックス溶液に入れます。準備した縫合糸ループのうち2つを、力変換器と長さコントローラーの両方から伸びるステンレス鋼の取り付け面に通します。次に、関心のある繊維束を氷上で約15分間解凍し、次に、新鮮で冷やしたリラックス溶液で満たされたシリコーンエラストマーメッキのペトリ皿に移します。
バンドルを両端のピンで所定の位置に固定し、鉗子を使用してバンドルが水没していることを確認します。繊維の一方の端をつかみ、その長手方向の軸に沿ってスムーズに抽出し始めます。束から繊維を抽出する際には、繊維と細胞外マトリックスとの間の付着が過度の張力を引き起こし、最終的に伸張による損傷につながる可能性があるため、注意が必要です。
抽出したら、繊維を少量のリラックス溶液とともに改質したピペットチップに導入し、鉗子で優しく導くリラックス溶液を含む実験チャンバーに移します。ピペットチップからファイバーを取り外し、長さコントローラーに固定します。最初の縫合ループを使用して、ファイバーのもう一方の端を力変換器に向けて操作し、同じ手順でファイバーを固定します。
マイクロ解剖ハサミを使用して余分な縫合糸を取り除きます。次に、2 番目のループを 1 番目のループに通し、長さコントローラーの取り付け面の端から 0.2 mm 以内の点にファイバーを固定します。ファイバーの力トランスデューサーの端にある2番目のループで繰り返します。
長さコントローラーの位置をY軸の方向に調整して、ファイバーを実験チャンバーの側壁に平行に整列させます。次に、プリズムの側面図を使用してファイバーを調査し、ファイバーがチャンバーの床と平行になるまで、長さコントローラーの位置をZ軸の方向に調整します。ファイバーが何らかの形で損傷している場合は、ファイバーを廃棄して新しいファイバーを接続する必要があります。
レーザーをオンにし、レーザーがファイバーの中心を通過するようにステージの位置を調整します。次に、長さコントローラーのX軸マイクロメータドライバーを使用してファイバーの張力を増減することにより、回折光の所望の間隔がターゲットスクリーンに観察されるまで、サルコメアの長さを設定します。最適なサルコメアの長さを設定したら、最も内側の 2 つの縫合糸の間の距離を測定します。
接眼レンズの垂直十字線が1つの内側縫合糸とゼロの最も内側の境界に揃うようにチャンバーを配置します。マイクロメータドライブのデジタル読み出しは、接眼レンズの垂直十字線が最も内側の縫合糸と整列するまで、顕微鏡に対してx軸に沿ってステージを平行移動します。デジタルディスプレイは、ファイバーの長さを表示し、ファイバーを測定された長さに維持し、顕微鏡に取り付けられたカメラを使用して、上部と側面の両方のビューからファイバーの中央部分の高倍率画像をキャプチャします。
これらの画像を使用して、ファイバーの断面積を計算します。チャンバー制御ソフトウェアを使用して、ファイバーを再活性化前の溶液を含むチャンバーに移動し、そこで3分間インキュベートします。繊維が不活性化溶液である間に、その受動的張力を測定し、次に繊維を活性化溶液を含むチャンバーに移動し、急速な上昇が先行する力のプラトーによって証明されるように、最大の等尺性力が発生するのを待ちます。
次に、長さコントローラーを使用して、ファイバーの取り付けポイント間の距離を大幅に急速かつ短時間短縮し、その後、元の長さにすばやく戻して、ゼロに対応する力変換器の出力を特定します。ここに示されている力は、これらのビューから楕円形のファイバーの上面図と側面図の両方を示しています。断面積は、繊維の長さに沿って5点の直径を測定し、その結果得られた5つの面積の平均を計算することによって決定されました。
このビデオで示されている手法を使用して、人間の遅筋線維と速筋線維の力の痕跡は、高速線維が遅筋線維よりも高い速度で力を生成することを示しています。ヒトマウスとラットの筋線維の典型的な特性を測定し、ここに示します。示されている範囲は 25 番目から 75 番目の四分位数を示し、N はテストされた繊維の数です。
異なる種間で比力の大きな違いがあることに注意してください。ここで概説する手順は、長さの力、力の速度、力など、骨格筋生理学の重要な側面である追加の介入を追加することにより、単一の骨格筋線維の最大固有の力生成能力の評価につながります。カルシウムの関係を明らかにすることができます。
概要
この記事では、in vitroでパーミアビライズされた骨格筋繊維の収縮特性を評価するための信頼性の高い技術を紹介します。この方法により、単一繊維レベルでの最大等尺性力発生を測定することができ、筋機能に関する洞察を提供します。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 筋肉生理学
- 細胞生物学
背景
- 細胞レベルでの筋機能を理解することは、様々な生物学的研究にとって重要です。
- 化学的にスキンドされた繊維により、収縮特性を直接測定することができます。
- この技術は全体の筋構造に関連する複雑さを簡素化します。
- 視覚的な実演により、このプロトコルの学習が促進されます。
研究の目的
- 個々の筋繊維の最大等尺性力生成能力を測定すること。
- パーミアビライズされた骨格筋繊維の準備とテストのための詳細なプロトコルを提供すること。
- パーミアビライズされた繊維技術の有効性を実証すること。
使用された方法
- 化学的洗剤を使用した筋繊維サンプルの準備。
- 筋束からの個別繊維の抽出。
- レーザー干渉パターンを使用した最適なサルコメア長の設定。
- 最大収縮力を誘発するためのカルシウムの投与。
主要な結果
- この技術は個々の繊維の収縮特性を正常に測定します。
- 筋機能の評価において信頼性と妥当性が実証されました。
- 視覚的な補助が大幅にプロトコルの理解を向上させます。
結論
- パーミアビライズされた繊維技術は筋収縮性の研究に効果的です。
- この方法は全体の筋研究の複雑さなしに貴重な洞察を提供します。
- 将来の応用は筋生理学の理解を深める可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Assessing single-fiber contractility enables mechanistic de-risking of therapeutic targets in neuromuscular and metabolic disease programs. By isolating force generation from whole-tissue confounders, this approach improves target validation confidence and supports early go/no-go decisions in preclinical portfolios. The method provides quantitative, reproducible outputs that bridge basic muscle biology with translational screening efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring intrinsic force capacity at the single-cell level.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity in target pathways affecting muscle contractility.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying targets with dose-responsive effects on fiber-specific force.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates normalized, quantitative force readouts suitable for compound library screening.
- Operational Value: Standardizes assay conditions via sarcomere length control and calcium activation protocols.
- Scalability: Supports reuse across species and fiber types for cross-model target assessment.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links genetic or pharmacological interventions to functional outcomes in disease-relevant muscle models.
- Operational Value: Provides continuity from discovery through preclinical validation using consistent force metrics.
- Risk Mitigation: Informs advancement decisions by revealing contractile liabilities early in the pipeline.
Pipeline & Workflow Integration
The technique fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting hypothesis testing in early discovery, assay readiness in screening, and mechanistic follow-up in translational research.
- Discovery Biology: Tests target effects on fundamental contractile mechanisms independent of tissue architecture.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative force measurements for hit validation and lead optimization.
- Analytics: Outputs normalized force and cross-sectional area data enabling inter-condition comparisons.
- Translational Research: Connects molecular changes to functional phenotypes in preclinical muscle models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized platform for cross-project assessment of muscle-targeting modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by isolating muscle-specific contractility.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized fiber preparation and activation protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing late-stage failures due to unidentified contractile effects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on dose-response in single-fiber force assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in muscle dissection, fiber isolation, and force transducer operation.
- Dependent on calibrated instrumentation including length controllers, force transducers, and laser interference systems.
- Necessitates cross-team standardization of solution preparation, storage, and activation protocols.
- Adaptation across model systems (e.g., human, rodent) requires validation of species-specific contractile norms.
- Practical limitations include fiber fragility during extraction and variability in permeabilization efficiency.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:29
Pre-sample Preparation
2:25
Skeletal Muscle Bundle Dissection, Permeabilization, and Storage
4:48
Preparation for Single Fiber Testing
7:41
Single Fiber Testing
9:51
Results: Activation Rate of Slow and Fast Fibers During Stimulation
10:56
Conclusion
