Name: 培養細胞および動物組織中のDNAの酸化バイオマーカー、8-オキソ-7,8-ジヒドロ-2-デオキシグアノシンのHPLC測定、 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 12 s
Description: 学ぶ DNA酸化バイオマーカー8-oxo-dGuoのHPLC-ED定量法。培養細胞や動物組織からのDNA抽出、消化、電気化学検出による高感度測定で酸化ストレス評価を実現します。

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この研究は、カナダ保健省ゲノミクス研究開発イニシアティブ（GRDI）とバイオテクノロジーのためのカナダの規制戦略（CRSB）によって資金を供給されました。著者らは、利害の競合を持っていません。

<ol><li>Helbock, H. J., Beckman, K. B., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+oxidation+matters%3A+The+HPLC-electrochemical+assay+of+8-oxo-deoxyguianosine+and+8-oxo-guanine%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical assay of 8-oxo-deoxyguianosine and 8-oxo-guanine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1), 288-293 (1998).</li>
<li>Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((8-hydroxy-2%27+-deoxyguanosine+%288-OHdG%29%3A+A+critical+biomarker+of+oxidative+stress+and+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Environ.+Sci+Health+C+Environ.+Carcinog.+Ecotoxicol.+Rev%22%5BJournal%5D)">8-hydroxy-2' -deoxyguanosine (8-OHdG): A critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis.</a> J. Environ. Sci Health C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 27 (2), 120-139 (2009).</li>
<li>Cadet, J., Bellon, S., Douki, T., Frelon, S., Gasparutto, D., Muller, E., Pouget, J. P., Ravanat, J. L., Romieu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+DNA+damage%3A+formation%2C+measurement%2C+and+biochemical+features%5BTitle%5D)+AND+%22J+Environ+Pathol+Toxicol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced DNA damage: formation, measurement, and biochemical features.</a> J Environ Pathol Toxicol Oncol. 23 (1), 23-23 (2004).</li>
<li>Weiss, J. M., Goode, E. L., Ladiges, W. C., Ulrich, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphic+variation+in+hOGG1+and+risk+of+cancer%3A+a+review+of+the+functional+and+epidemiologic+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Polymorphic variation in hOGG1 and risk of cancer: a review of the functional and epidemiologic literature.</a> Mol. Carcinog. 42 (3), 127-141 (2005).</li>
<li>Culp, S. J., Cho, B. P., Kadlubar, F. F., Evans, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+Conformational+Analyses+of+8-hydroxy-2%27-deoxyguanosine%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Structural and Conformational Analyses of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine.</a> Chem. Res. Toxicol. 2 (6), 416-422 (1989).</li>
<li>Cooke, M. S., Loft, S., Olinski, R., Evans, M. D., Bialkowski, K., Wagner, J. R., Dedon, P. C., Møller, P., Greenberg, M. M., Cadet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+standardized+description+of+and+nomenclature+concerning+oxidatively+damaged+nucleobases+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Recommendations for standardized description of and nomenclature concerning oxidatively damaged nucleobases in DNA.</a> Chem. Res. Toxicol. 23 (4), 705-707 (2010).</li>
<li>Jang, Y. H., Goddard, W. A. 3rd, Noyes, K. T., Sowers, L. C., Hwang, S., Chung, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+principles+calculations+of+the+tautomers+and+pKa+values+of+8-oxoguanine%3A+implications+for+mutagenicity+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">First principles calculations of the tautomers and pKa values of 8-oxoguanine: implications for mutagenicity and repair.</a> Chem. Res. Toxicol. 15 (8), 1023-1035 (2002).</li>
<li>Park, J. -H., Gopishetty, S., Szewczuk, L. M., Troxel, A. B., Harvey, R. G., Penning, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+8-oxo-7%2C8-dihydro-2%27-deoxyguanosine+%288-oxo-dGuo%29+by+PAH+o-quinones%3A+involvement+of+reactive+oxygen+species+and+copper%28ii%29%2Fcopper%28i%29+redox+cycling%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by PAH o-quinones: involvement of reactive oxygen species and copper(ii)/copper(i) redox cycling.</a> Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1026-1037 (2005).</li>
<li>Mangal, D., Vudathala, D., Park, J. H., Lee, S. H., Penning, T. M., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+7%2C8-dihydro-8-oxo-2%27-deoxyguanosine+in+cellular+DNA+during+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2'-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress.</a> Chem. Res. Toxicol. 22 (5), 788-797 (2009).</li>
<li>Ravanat, J. L., Douki, T., Duez, P., Gremaud, E., Herbert, K., Hofer, T., Lasserre, L., Saint-Pierre, C., Favier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+background+level+of+8-oxo-7%2C8-dihydro-2%27-deoxyguanosine%3A+an+isotope+based+method+to+evaluate+artefactual+oxidation+of+DNA+during+its+extraction+and+subsequent+work-up%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Cellular background level of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine: an isotope based method to evaluate artefactual oxidation of DNA during its extraction and subsequent work-up.</a> Carcinogenesis. 23 (11), 1911-1918 (2002).</li>
<li>Gossen, J. A., De Leeuw, W. J. F., Tan, C. H. T., Zwarthoff, E. C., Berends, F., Lohman, P. H. M., Knook, D. L., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+rescue+of+integrated+shuttle+vectors+from+transgenic+mice%3A+A+model+for+studying+mutations+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice: A model for studying mutations in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (20), 7971-7975 (1989).</li>
<li>Test No. 488: Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays. , Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD). Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.oecd-ilibrary.org">http://www.oecd-ilibrary.org</a> (2015).</li>
<li>Van Campen, L. E., Murphy, W. J., Franks, J. R., Mathias, P. I., Toraason, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+DNA+damage+is+associated+with+intense+noise+exposure+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Oxidative DNA damage is associated with intense noise exposure in the rat.</a> Hear Res. 164 (1-2), 164-161 (2002).</li>
<li>European Standards Committee on Oxidative DNA Damage (ESCODD). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+DNA+oxidation+in+human+cells+by+chromatographic+and+enzymic+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Measurement of DNA oxidation in human cells by chromatographic and enzymic methods.</a> Free Radic. Biol. Med. 34 (8), 1089-1099 (2003).</li>
<li>Rebelo, I. A., Piedade, J. A., Oliveira-Brett, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+HPLC+method+with+electrochemical+detection+of+femtomoles+of+8-oxo-7%2C8-dihydroguanine+and+8-oxo-7%2C8-dihydro-2%27-deoxyguanosine+in+the+presence+of+uric+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Development of an HPLC method with electrochemical detection of femtomoles of 8-oxo-7,8-dihydroguanine and 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in the presence of uric acid.</a> Talanta. 63 (2), 323-331 (2004).</li>
<li>Ravanat, J. -L., Turesky, R. J., Gremaud, E., Trudel, L. J., Stadler, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+8-oxoguanine+in+DNA+by+gas+chromatography-mass+spectrometry+and+HPLC-electrochemical+detection%3A+overestimation+of+the+background+level+of+the+oxidized+base+by+the+gas+chromatography-mass+spectrometry+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Determination of 8-oxoguanine in DNA by gas chromatography-mass spectrometry and HPLC-electrochemical detection: overestimation of the background level of the oxidized base by the gas chromatography-mass spectrometry assay.</a> Chem. Res. Toxicol. 8 (8), 1039-1045 (1995).</li>
<li>Kawanishi, S., Murata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+DNA+damage+induced+by+bromate+differs+from+general+types+of+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of DNA damage induced by bromate differs from general types of oxidative stress.</a> Toxicology. 221 (2-3), 172-178 (2006).</li>
<li>Tahara, S., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+of+mouse+splenic+cells+to+oxidative+DNA+damage+by+x-ray+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Pharm.+Bull%22%5BJournal%5D)">Susceptibility of mouse splenic cells to oxidative DNA damage by x-ray irradiation.</a> Biol. Pharm. Bull. 27 (1), 105-108 (2004).</li>
<li>Garratt, L. W., Mistry, V., Singh, R., Sandhu, J. K., Sheil, B., Cooke, M. S., Sly, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpretation+of+urinary+8-oxo-7%2C8-dihydro-2%27-deoxyguanosine+is+adversely+affected+by+methodological+inaccuracies+when+using+a+commercial+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Interpretation of urinary 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine is adversely affected by methodological inaccuracies when using a commercial ELISA.</a> Free Radic. Biol. Med. 48 (11), 1460-1464 (2012).</li>
<li>Cooke, M. S., Collins, A., Olinski, R., Rozalski, R., Loft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harmonising+measurements+of+8-oxo-7%2C8-dihydro-2%E2%80%B2-deoxyguanosine+in+cellular+DNA+and+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Res%22%5BJournal%5D)">Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine in cellular DNA and urine.</a> Free Radic. Res. 46 (4), 541-553 (2012).</li>
<li>Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+oxidatively+generated+base+damage+in+cellular+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Measurement of oxidatively generated base damage in cellular DNA.</a> Mutat Res. 711 (1-2), 3-12 (2011).</li>
<li>Chomczynski, P., Mackey, K., Drews, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNAzol%3A+a+reagent+for+the+rapid+isolation+of+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">DNAzol: a reagent for the rapid isolation of genomic DNA.</a> Biotechniques. 22 (3), 550-553 (1997).</li>
<li>Collins, A. R., Cadet, J., Möller, L., Poulsen, H. E., Viña, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+we+sure+we+know+how+to+measure+8-oxo-7%2C8-dihydroguanine+in+DNA+from+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Are we sure we know how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from human cells.</a> Arch Biochem Biophys. 423 (1), 57-65 (2004).</li>
<li>Badouard, C., Ménézo, Y., Panteix, G., Ravanat, J. L., Douki, T., Cadet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+new+types+of+DNA+lesions+in+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Zygote%22%5BJournal%5D)">Determination of new types of DNA lesions in human sperm.</a> Zygote. 16 (1), 9-13 (2008).</li>
<li>Cadet, J., Douki, T., Gasparutto, D., Ravanat, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+damage+to+DNA%3A+formation%2C+measurement+and+biochemical+features%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features.</a> Mutat Res. 531 (1-2), 1-2 (2003).</li>
<li>Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH), 2015 Mar 1, San Diego, CA, , Available at: <a target="_blank" href="http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1/Step4/Q2_R1__Guideline.pdf">http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1/Step4/Q2_R1__Guideline.pdf</a> (2015).</li>
</ol>

利益相反または競合する金銭的利益は宣言されていません。

8-オキソdGuoがDNA酸化の有用なバイオマーカーとして報告されているが、その信頼性の定量化は、チャレンジを提起することができます。いくつか公開された方法が存在するが、それらの研究室での方法を展開する研究者を可能にするプロトコルの包括的、説明的な概要が必要とされています。ここでは、8オキソdGuoの検出および定量化のための効果的な方法を確立するために新しいユーザーを可能にするHPLCベースのプロトコルの詳細な概要を提示します。 8-オキソdGuoの定量のために記載されている三つの主要な方法。これらには、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）は、本明細書に記載されるような9の他の場所に記載し、HPLC-EDの方法、クロマトグラフィー/質量分析（MS）法（ 例えば、液体の市販キット19を 、ベース含む。ELISA法は、干渉を受ける可能性が生物学的試料19中の特定の化合物と、一般に、結果がchromatogr用いて得られましたaphic技術は、ELISAに基づく方法20と比較し...

その定常状態レベルの酸化的DNA損傷の頻度の増加に寄与し、多くの病的状態とxenotoxic代謝中に増加させることができる反応性酸素種（ROS）。いくつかの可能な核酸塩基の酸化物の中でも、酸化的DNA損傷を容易に &#39;2の酸化形態の一つである安定したマーカー8-オキソ-7,8-ジヒドロ-2&#39;-デオキシグアノシン（8-オキソdGuo）を用いて測定することができます-deoxyguanosine（dGuo）1。 8-オキソdGuoは最も豊富なDNA損傷2であり、したがって、複数のDNAの酸化生成物3の存在にもかかわらず、DNA酸化のバイオマーカーとして、より詳細に検討されています。ヒトでは、この損傷は8-オキソグアニングリコシラーゼ1（hOGG1）4によって塩基除去修復を経て修復することができます。未修復のままにすると、8-オキソdGuoが塩基対置換変異の形成（ すなわち 、Gは転換をTに）に貢献することができる4。重要なことは、8-オキソdGuoは、確立されたマーカーのFOです開始と発癌2の促進に関連するr個のDNA損傷。したがって、8-オキソdGuoの正確な定量は、酸化的DNA損傷5の有用なバイオマーカーであると望ましいです。 さらに広まっ2デオキシグアノシンの酸化的損傷を受けた形態のための正しい名前に関する文献における混乱と、日常的に酸化的DNA損傷6のバイオマーカーとして測定した化合物（複数可）の正しい名前があります。 8-オキソdGuo（ 図1に示す）の6,8-ジケトおよび6エノール、8-ケト互変異性型は、文献5,7で説明した2つの最も顕著な互変異性体です。 6,8-ジケトフォーム7.4の生理的pHで最も顕著な形態であり、そして最も顕著なDNAの酸化生成物7です。したがって、8-オキソdGuoはなく8-ヒドロキシdGuoこの酸化生成物6のための最も適切な名前です。むしろnucleobより、2 - デオキシグアノシン（dGuo）ことに注意することも重要ですアーゼのグアニン（グア）またはリボグアノシン（郭）が、それぞれ、最も方法6により検出されます。 DNAサンプルの消化i）においてばらつき、試料調製中に発生する可能性がある8-オキソdGuoにdGuoのii）の不定酸化、 およびiii）必要性：8-オキソdGuoの正確な検出および定量化が原因に困難です分析HPLC-ED法8の効果的な検証のため。 III）を部分的にのみを含めることによって対処している間にこのプロトコルでは、封入金属キレート剤とキレート剤処理されたソリューションと特殊なDNA単離試薬によって、我々は完全なDNA消化のための有利な条件を提供することにより、）私を達成することを目的とし、II）ポジティブコントロールは、したがって、本方法は、生物学的試料中の8-オキソdGuoを検出することができることを提供します。さらなる検証はこの論文の範囲を超えています。しかし、このプロトコルは将来のを助けると確信していますユーザーは、彼らが正式にその目的に応じて、プロトコルを検証する必要がどの程度を決定します。メソッドの仮の検証に必要な手順のリストがさらに提供されます。 8-オキソdGuo検出のための方法の開発と展開の間に、公表された方法を検討し、併合されました。したがって、この方法は、8-オキソdGuoの検出および定量のための方法がうまく採用されている場合にも、検査の迅速かつ簡単な手段を提供しながら、多くの場合、重要な実験の詳細を欠いている、いくつかの公開されたソースから情報を収集する必要がなくなります。この適応方法は、正常培養細胞およびマウス組織からDNAサンプルを分析するために使用しました。このビデオの記事は、HPLC-EDによる8-オキソdGuoを確実に検出および定量化のための効果的な方法を確立する他のグループを支援します。

<table><tbody><tr><td>8-oxo-dGuo standard</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>89320</td><td>不適切に「8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシン」と呼ばれています。詳細についてはFig. 1およびテキストを参照してください。</td></tr><tr><td>アルカリホスファターゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5931</td><td>E. coli</td></tr><tr><td>Chelex 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7901</td><td>キレート重金属</td></tr><tr><td>デスフェロキサミンメシル酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9533</td><td></td></tr><tr><td>dGuo 標準</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7145</td><td></td></tr><tr><td>二塩基性リン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>サケ精子由来DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td>ナトリウム塩</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td>TypeII, ウシ膵臓由来</td></tr><tr><td>DNAzol</td><td>Invitrogen</td><td>10503-27</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物 (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td>溶液のpHを8.0に調整するまで、化合物は完全には溶解しません (例えば with NaOH)</td></tr><tr><td>F12-K 担体</td><td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>ガードカラム</td><td>クロマトグラフィースペシャリティ</td><td>YBA 99S03 0204GC</td><td>コーラムを汚染から保護し、圧力上昇にもつながる可能性がある</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>一塩基性リン酸</td><td>ナトリウムSigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Invitrogen</td><td>15190-250</td><td></td></tr><tr><td>ホスホジエステラーゼI酵素&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3243</td><td>Type II from Crotalus adamaneus venom</td></tr><tr><td>テフロンホモジナイザー</td><td>トーマス・サイエンティフィ</td>ック <td>7724T-1 または 7724T-5 それぞれ 1 mL または 5 mL</td><td>容量 (保持能力) は、処理するサンプルの量によって異なります。</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Invitrogen</td><td>15050-065</td><td></td></tr><tr><td>YMC-BASICカラム、球状シリカ</td>結合 <td>Chromatographic Specialties</td><td>YBA 99S03 1546WT</td><td></td></tr></tbody></table>

培養細胞および動物組織中のdnaの酸化バイオマーカー、8-オキソ-7,8-ジヒドロ-2&#39;-デオキシグアノシンのhplc測定、

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

酸化ストレスは、DNAなどの生体高分子の酸化につながる、多くの生理学的および病理学的プロセス、ならびに生体異物代謝に関連しています。そのため、DNAの酸化の効率的な検出は、医学と毒物学などの研究分野、各種のために重要です。酸化的損傷を受けたDNAの一般的なバイオマーカーは、8-オキソ-7,8-ジヒドロ-2&#39;-デオキシグアノシン（8-オキソdGuoあるしばしば誤っと称される8-ヒドロキシ-2&#39;-デオキシグアノシン（8-OH-dGuoまたは8 - オキソ - dGの））。電気化学検出（HPLC-ED）と、高圧液体クロマトグラフィーにより8-オキソdGuo測定するためのいくつかのプロトコルが記載されています。しかし、これらは主に酸化促進剤で処理された精製されたDNAに適用しました。また、原因の研究室間の方法論の違いに、主に分析機器の違いによる、HPLC-EDによる8-オキソdGuoの検出のための公表された方法の採用は、各研究室によって慎重な最適化を必要とします。 Aこのような最適化処理を説明する包括的なプロトコルは、不足しています。ここでは、詳細なプロトコールは、培養細胞または動物組織からのDNAにおいて、HPLC-EDによって8-オキソdGuoの検出のために記載されています。これは、DNA試料の調製を容易かつ迅速に試料調製の間に発生することが望ましくないDNAの酸化を最小にするように最適化することができる方法を示します。このプロトコルは、酸化剤KBrO 3で処理した培養ヒト歯槽腺癌細胞（ すなわち 、A549細胞）における、および多環式芳香族炭化水素ジベンゾ（DEF、P）クリセンに曝露されたマウスの脾臓から8-オキソdGuoを検出する方法を示しています（DBC、旧ジベンゾとして知られている（L）ピレン、DalP）。全体的に、この作品は、HPLC-EDの方法論は容易に生物学的サンプル中の8-オキソdGuoの検出のために最適化することができる方法を示しています。

dGuoは8-オキソdGuoが約6.4分（ 図2AおよびB）の保持時間を有していたのに対し、4.7分の保持時間を有することが観察されました。 図2Cに見られるように、2つの分析物のピーク高さの約1000倍の差が存在します。 8-オキソdGuoとdGuoためボルタモグラムは8-オキソdGuoのための最適な作動電位が+ 0.5Vであることが決定された0.2から1.1 Vの範囲で作動電位で基準を実行することによって得られ、0.9ましたdGuoのためのV（ 図3）。これらの電位は、文献14,15に記載されている他のガラス状炭素電極と一致しています。検出および8-オキソdGuoとdGuo電気化学的検出のダイナミックレンジの限界は、それぞれ8,9、フェムトモルとナノモル範囲であることが報告されています。 dGuoと8-オキソdGuoのための標準曲線は、適切な濃度範囲にわたって線形検出を確実にするために、毎日実行し、適切な実行する必要があります楽器のンス（ <strong...

このプロトコルの目的は、培養細胞または動物組織からのDNAにおけるHPLC-EDによるDNA酸化のマーカー、8-オキソ-7,8-ジヒドロ-2&#39;-デオキシグアノシン（8-オキソdGuo）の検出です。

培養細胞および動物組織中のDNAの酸化バイオマーカー、8-オキソ-7,8-ジヒドロ-2&#39;-デオキシグアノシンのHPLC測定、

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of ...

本手順の目的は、電気化学検出器付き高速液体クロマトグラフィー（H-P-L-C-E-D）を用いて、生物学的試料中のDNA酸化産物である8-oxo-dGを検出および定量することである。これは、生物学的試料からDNAサンプルを単離し、その後、金属キレート剤と特殊なDNA単離試薬を加えることで、サンプル調製中に起こり得る不必要なDNA酸化を最小限に抑えながらDNAを完全に消化させることで達成される。次に、H-P-L-C-E-Dの分析条件を最適化し、8-oxo-dGおよび2-primed dioxazineの標準曲線を作成する。最終ステップとして、消化後のDNAを、純粋な8-OD-DGおよび2'-デオキシグアニシンと同時にHPLCで分析し、調査対象の消化済みDNAサンプルにおける8-OD-DG対2'-デオキシグアニシンの比率を算出します。最終的に、HPLC-ECDによる8-OD-DGの検出と定量により、生物学的サンプルにおけるDNA酸化の程度を定量化します。本手法の既存手法に対する主な利点は、複数の既報文献から得られたすべての関連情報を統合していることに加え、新しい研究室環境における本手法の導入成功を迅速かつ簡便に検証する手段を提供している点にあります。この手法は、酸化ストレス、より具体的にはDNA酸化が、どのようにメカニズム的に有害影響と結びついているかなど、生物医学および毒性学研究における重要な疑問への回答に役立ちます。また、培養細胞を実験動物として利用することも可能です。一般的に、この技術に慣れていない人は、新しい研究室の環境で新しい手法が正しく機能することを確認するために最適化すべきパラメータが多く存在するため、習得に苦労します。最適化が必要なパラメータが数多くあり、習得が困難な実験ステップが含まれているため、この手法の視覚的な実演が極めて重要となります。Nikolai博士、そしてオタワ大学からの元共同教育プログラム学生であるKennedy学部長が、この手順を実演します。培養細胞からDNAを抽出することが可能です。そのためには、DNA抽出に十分な細胞数があることを確認してください。通常、細胞密度が約70%の10 centimeterプレートが少なくとも2〜3枚必要です。細胞培養培地を廃棄し、PBSで細胞を洗浄します。プレートから細胞をスクレイパーで回収するか、トリプシンを用いて剥離させ、50 milliliterの円錐型ポリスチレン遠心チューブに移します。遠心分離により回収し、チューブの底に細胞ペレットを形成させます。DN AzoなどのDNA分離剤1 mLとともに、50 mLの円錐形ポリスチレン遠心チューブ内で細胞をホモジナイズします。1000 µLのピペットチップを用いて、溶液が均一になるまで細胞ペレットを分散させます。ホモジネートを新しい1.5 mLマイク

hplc-measurement-dna-oxidation-biomarker-8-oxo-78-dihydro-2

Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

ラディカルベースの​​生体模倣化学、バイオマーカー開発のために必要な建物のアップライブラリに適用されています。...

ケミカルバイオロジーのフリーラジカル：化学的挙動からバイオマーカー探索·開発へ

ここでは、病変の高感度かつ正確な定量のための方法 8-オキソ-7, 8-ジヒドロ-2'-デオキシグアノシン (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-デオキシアデノシン (1,n6-茶道) および 1,n2-etheno-2'-デオキシグアノシン (1,N2-dGuo) DNA で.この方法は、曝露された A/J マウスの組織 (肺、肝臓および腎臓) における周囲微細粒子状物質 (PM2.5)...

質量分析による3つの DNA 病変の定量化と、周囲の微細粒子状物質に曝露したマウスの組織におけるそのレベルの評価

このプロトコールは、ELISA技術によってMCF-7細胞のDNA酸化的損傷を定量的に検出するための効率的な方法を説明しています。...

ELISAアッセイを用いた8-oxo-dGレベルの定量化によるMCF-7細胞の酸化的DNA損傷の評価

8  - オキソグアニンDNAグリコシラーゼのグリコシラーゼ活性のための時間のコースには、製品の形成と線形定常段階のバーストを示す二相性である。クエンチフロー法を利用して、バースト定常状態速度は、それぞれ、製品のDNAグリコシラーゼからの8  -...

DNAグリコシラーゼ活性の定常状態、プレ定常状態、およびシングルターンオーバー速度論的測定

DNAオリガミは、DNA分子の自己組織化をプログラムすることにより、精密なナノスケールの物体を製造するための強力な方法です。ここでは、DNAオリガミからの生体応答型ロボットのフォールディング、その精製、および透過型電子顕微鏡イメージング(TEM)のためのネガティブ染色のプロトコルについて説明します。...

DNA折り紙からバイオ応答ロボットの折りたたみとキャラクタリゼーション

&gt;jove_content&lt;ここで説明するプロトコールは、異なる条件下で培養された慢性リンパ性白血病(CLL)細胞のプリン代謝を測定するために、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)を使用する簡単で再現性のある方法を表しています。...

HPLCベースのアッセイは、ヒト慢性リンパ球性白血病細胞における細胞外ヌクレオチド/ヌクレオシド代謝を監視します

阻害された酸性溶液からX線光電子分光計へのサンプル移動中の金属基板の酸化を回避するためのプロトコルが提示されます。...

XPSで腐食防止剤/金属界面の化学組成を決定する：最小化後のイマージョン酸化

フォトニック温度計のテストと作製プロセスについて述べる。...

光温度計の作製と試験

本手法は複数基板の UHPLC MS 解析によるヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC) HeLa 細胞でのアイソ フォーム特異阻害剤を識別するために提供しています。これは生活 HDAC1 と HDAC6 の活動を反映するように開発された抗体無料メソッド セル環境、単一アイソ...

HDAC1 と HDAC6 hela 細胞活性の同時測定セルを用いたクロマト MS

このプロトコルでは、磁性粒子の合成と DNA 結合の動的・電気泳動光散乱法による評価について説明します。粒子サイズ、彼らの多分散性の変化の監視に焦点を当てこのメソッドとを担う粒子表面のゼータ電位の主要な DNA...

バインドの動的・電気泳動光散乱による解析 DNA 磁性粒子

学ぶ DNA酸化バイオマーカー8-oxo-dGuoのHPLC-ED定量法。培養細胞や動物組織からのDNA抽出、消化、電気化学検出による高感度測定で酸化ストレス評価を実現します。

培養細胞および動物組織中のDNAの酸化バイオマーカー、8-オキソ-7,8-ジヒドロ-2'-デオキシグアノシンのHPLC測定、

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