Name: ウランの酸化銅ナノ粒子による微量元素の除去その場での回復ブリード水と細胞生存率への影響 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 学ぶ酸化銅ナノ粒子による産業廃水の浄化法とヒト腎臓・肝臓細胞を用いた細胞毒性評価の手法。この技術は環境修復と水質安全性向上に貢献します。

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サンプルの質量分析について、ロジャー・ホッパー博士とワイオミング州農務省分析サービスラボに感謝します。 ワイオミング大学薬学部の研究室でこのプロトコルをビデオに収めることを許可してくださったことに感謝いたします。 また、Theodore O. and Dorothy S. King Endowed Professorship AgreementのGraduate Assistantship(SC)、ワイオミング大学のGraduate Assistantshipサポート(JRS)、Science Posse(NSF GK-12 Project # 084129)のティーチングフェローシップ(JRS)に感謝します。 また、サンプルの入手を許可し、質問に協力してくれたUranium Oneにも感謝します。 この研究は、ワイオミング大学エネルギー資源学部の支援を受けました。

すべてのサンプルは、ワイオミング州のウランISR施設のウラン液処理建屋で収集しました。 1.生産ブリード水（PBW） <ol><li> ISRウラン施設から水サンプルの2種類を収集：PBWと浸透（RO）水を逆にします。イオン交換処理後の監視タップからではなく、逆浸透除染の前にPBWを収集します。 PBWは、逆浸透処理によって除染された後、ROのサンプルを収集します。 注：浸出剤は、それがカラムに回収し、イオン交換のために準備されたウランの液処理建物に複数のウェルのフィールドのパイプラインで輸送されます。イオン交換後の浸出剤の約1~3％が回路から除去され、生産ブリード水（PBW）と呼ばれます。 PBWマイニングプロセスで再使用されるか、またはRO濾過して脱塩/除染されます。 </li><li>高密度ポリエチレンゼロヘッドスペースと（HDPE）ボトル応じに水サンプルを収集環境品質のワイオミング州省（WYDEQ）23のサンプル収集と分析のための標準的な操作手順に。 </li><li>クールなそれらを保つためにオンサイト氷上および輸送試料温度およびpHを測定します。 </li><li> 4℃で保存PBW。以下のプロトコルに指示されるように、メディアの準備中に添加される濃縮されたイーグル最小必須培地（EMEM-10X）後までクールPBWソリューションをしてください。 注：PBWがフリーズすることができたり、室温に加温した場合に析出する酸化ソリューションです。希釈した後PBW溶液が十分に加熱されたとき、それが細胞に、インキュベーション中にアプリケーションの前に37℃に沈殿しないことを希薄です。 </li></ol>のCuOナノ粒子の調製（CuOを-NPS） <ol><li> 0.2 MのCuCl 2•2H 2 O 250mlの0.4 Mの水酸化ナトリウム（NaOH）、及び5gのポリエチレングリコール（P 250 mlを含有する純粋なエタノール溶液を合わせ6ミリメートルホウケイ酸ガラス球を備えた丸底フラスコ中のEG）。 </li><li>修正された電子レンジで溶液を配置し、それが20％の電力（上の6秒間隔、24秒オフ）で10分間、大気圧で還流下で反応させます。 </li><li>ガラス球を残し、その後50mlコニカルチューブにデカントし、室温（20℃）に溶液を冷却します。 </li><li>遠心分離機デカント30分間、1,000×gで50ミリリットルコニカルチューブ内の溶液、その後は300ミリリットルの熱水（60〜65℃）、エタノール100mlの配列とのCuO-のNPを洗浄し、アセトン100ml。 </li><li> 50mlコニカルチューブ中で室温（20℃）でのCuOを-NPを乾燥させます。 </li><li>乳鉢に、そのチューブのうちのCuO-NPをこすり。スズ箔でのCuO-のNPをカバーし、残りの液体を除去するためにオーブンで110℃までのCuO-NPを加熱します。 1バッチにCuOを-のNPを組み合わせ及びCuO-NPの重量を量ります。 注：のCuO-NPの準備とPBWのCuOを-NP処理は水QUALで実施されました生態系の科学と管理、ワイオミング大学の性研究所。のCuO-NP合成はマーティンソンとレディ（2009）11の手順に従いました。 </li></ol>のCuO-のNPとPBW 3.治療<ol><li> PBW 50mlを、続いて50mlコニカルチューブへのCuO-NPの50mgの（1mg / ml）を加えます。チューブを密封し、250rpmでベンチトップオービタルシェーカーで30分間反応させました。 </li><li>遠心分離試料管30分間250×gで、その後は、0.45μmのシリンジフィルターを用いて上清を濾過します。遠心分離速度を変化させ、時間のCuO-NPは遠心管中で小型化を保証するために、ナノ粒子に依存することができます。 </li></ol> 4.元素分析<ol><li>次のように元素分析のために未処理（対照）及びCuO-NP処理したPBWのサンプルを準備します。 </li><li> 2.0のpHに微量金属グレードの硝酸でのCuO-NP-処理および未処理PBWのアリコート（40ml）で酸性化します。誘導couplによって陽イオンのための酸性化PBWのアリコートを分析レディ及びロス（2012）13に記載されるようにプラズマ質量分析（ICP-MS）を編</li><li>のCuO-NP-処理および未処理PBWのunacidifiedアリコート（20ミリリットル）を準備し、レディとロス（2012）13に記載されているようにイオンクロマトグラフィー（IC）によりアニオンためunacidifiedアリコートを分析します。 注：アリコートをララミーWY 82070.は13（2012）、ICとICPMS手順の説明はレディとロスで見つけることができ、農業分析サービスのワイオミング州省で分析しました。 </li></ol> PBWを用いた細胞培養培地の5準備<ol><li> 2コントロール（EMEM-1XとRO +メディア）と8つのPBWテストメディアソリューション生存率研究において（各未処理PBW及びCuO-NP処理されたメディアの4つの濃度）を使用します。次のようにソリューションの概要は以下のとおりです。 <ol><li> EMEM-1X制御のために、L-グルタミンおよび炭酸水素ナトリウムが既に追加でイーグル最小必須培地（EMEM-1X）を購入。ウシ胎児血清（FBSを追加）と製造者の指示に従って、抗生物質。 NOTE：EMEM-1Xは、細胞増殖のために適切な濃度に希釈し、L-グルタミンおよび重炭酸ナトリウムを含む購入します。 EMEM-1Xは、ウシ胎児血清（FBS）およびペニシリンおよびストレプトマイシンの抗生物質ミックス（50 IU / mlのペニシリンおよび50μg/ mlストレプトマイシン）を追加する必要があります。これは本研究で用いた両方の細胞タイプについて、製造業者の推奨する増殖培地であるため、EMEM-1Xは、制御媒体として使用されます。濃縮EMEM-10Xは、試験溶液を生成するために、施設または未処理またはCuOを-NP処置PBWからRO水で希釈します。濃縮されたEMEM-10X購入したとき、これらはウシ胎児血清（FBS）およびペニシリンおよびストレプトマイシンの抗生物質ミックスに加えて、追加されるように、L-グルタミン、または炭酸水素ナトリウムが含まれていません。 </li><li> ISR施設から収集RO対照溶液用RO水について。 PBWのテストメディアにのみ100％ROワットを置き換えると同じプロトコルを使用してくださいPBWの代わりにISR施設から小胞体。研究室からの未処理及びCuO-NP処理液の使用ROまたは超純水を希釈します。 </li><li>細胞培養培地の成分と混合する前に、4つの試験濃度に未処理のPBWを希釈します。以下の組み合わせで（実験室）からRO未処理PBWを混合することにより、未処理PBWソリューション4つの異なる濃度を準備します。100％（純粋PBW +なしRO水）、75％（PBW + 62.5ミリリットルのRO水187.5ミリリットル）、 50％または25％（PBWのRO水+ 187.5ミリリットルの62.5ミリリットル）（PBWのRO水+ 125ミリリットルの125ミリリットル）。 </li><li>細胞培養培地の成分と混合する前に、4つの試験濃度へのCuO-NP処置PBWを希釈します。以下の組み合わせでRO（実験室）を用いたPBW（30分間1 mg / mlのCuOを-NPで前処理）を混合することにより、CuOを-NP処理したPBWソリューション4つの異なる濃度を準備します。100％（純粋CuO- NP処理したPBW +なしRO水）+ 62.5ミリリットルRO水のCuO-NP処理したPBWの75％（187.5ミリリットル）、50％（125のCuO-NP処理したPBW + RO水の125​​ミリリットル）または25％（のCuO-NP処理したPBW + RO水の187.5ミリリットルの62.5ミリリットル）のミリリットル。 </li></ol></li><li> 100％ROの190ミリリットルと100％、75％、50％以上に濃縮されたEMEM-10Xの25ミリリットルを追加することにより、RO +メディア、未処理PBW +メディア及びCuO-NP処理したPBW +メディア濃度の250ミリリットルを準備ステップ6.1.3と6.1.4で作成された既成の未処理またはCuOを-NP処理したPBW濃度の25％。 </li><li> NaOHまたはHClを用いて7.4に各溶液のpHを調整します。 </li><li> 25ミリリットル（10％）ウシ胎児血清（FBS）、2.5ミリリットルのL-グルタミン、0.55グラムのNaHCO 3および1.25ミリリットルペン：以下の標準コンポーネントとそれぞれ未処理及びCuO-NP処理したPBWの濃度だけでなく、RO +メディアを補完/連鎖球菌（50 IU / mlのペニシリンおよび50μg/ mlストレプトマイシン）。 </li><li>未処理PBW +メディアの各濃度の浸透圧を調整し、RO水を追加し、メジャー浸透圧計を使用しては290〜310mOsm / kgのPBW +メディアとRO +メディアのCuO-NPは、処理しました。 </li><li>使用して各溶液を濾過0.22μmの真空フィルターユニット、および4℃で保存します。 注：未処理のPBW +メディア濃度56％、44％で、29％及び16.5％及びCuO-NP-で5％の範囲内の最終培地濃度を変化させる、浸透圧を調節するために使用されるRO水の量のわずかな変化に起因し53％、45％、30％および17％でPBW +媒体濃度で処理しました。 </li></ol> 6.細胞生存率注：腎臓および肝臓は、培養ヒト胎児腎臓（HEK293）細胞（HEK）およびヒト肝細胞癌細胞（HepG2）細胞（HEP）の試験方法を採用24-26、重金属毒性の標的臓器であることを考えます。 <ol><li> 2〜3日製造者の指示に従って実験に用いた96ウェルプレートをメッキする前に、HEKとHEP細胞の培養を準備します。 </li><li> 3- [4、5-ジメチルチアゾール-2-イル] -2、5-​​ジフェニルブロミド（MTT）アッセイを用いて細胞生存率を測定します。 注：MTTアッセイプロトコルはミーから変更されましたrloo ら。（2011）27。 <ol><li>粉末状でMTTを取得します。 50 mg / mlのストック濃度を補うために、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を追加します。 2時間溶液を撹拌した後、1.5ミリリットル冷凍庫安全チューブに0.45μmのシリンジフィルター、アリコートを使用してフィルタリング。 4℃で光とストアからチューブを保護します。 </li></ol></li><li> 、トリプシンを使用して培養皿からHEKとHEP細胞を除去し、5分間1,000×gで遠心分離し、トリプシンをデカント。 5mlのPBSを追加し、単一細胞溶液を得るために、細胞を混合します。その後、溶液1ミリリットル当たりの細胞数を得るために、血球計数器に単一細胞溶液20μlを加えます。 5分間1000×gで再び細胞を遠心し、PBSで細胞をリンスするために使用デカント。 500細胞への細胞の濃度を調整するEMEM-1Xの適切な量を追加/ 100μL（100μl/ウェル）。 </li><li>蒸発を制御するために、200μlのPBSでプレートの周囲の井戸を埋めます。 </li><li>種子細胞500細胞/ウェル（細胞でメッキされていない）周囲ウェル以外の各ウェルに100μlの添加の密度での。 注：HEKとHEP細胞のための播種密度は、成長のピークは日4-5の周囲に発生することを可能にする実験的な成長曲線に基づいています。全ての細胞株は、播種密度を推定するための成長曲線を準備します。 </li><li>それらは、細胞密度のベースラインMTTの読み取りを行う前に（プレートの形タイト癒着）を回収することができ、37℃で24時間、細胞をインキュベートします。 </li><li> （周囲を含まない）、最初の列からの播種培地を除去し、1時間、ウェルにMTT（培地中5mg / ml）の100μlを加えることにより、細胞密​​度のベースラインMTT読み取りを実行します。 </li><li> 1時間後、MTTを除去し、生存細胞（20分）によって産生されるMTTホルマザンを溶解するためにジメチルスルホキシド（DMSO）の100μLを加えます。 </li><li>塩基を得るために570nmでの吸収波長の第1列の光学密度（OD）を読みます。行の読み取り。 <ol><li>すべてのプレートが正しく播種し、細胞がプレートの間に一貫して増加していることを確認するために、ベースラインされた測定値を使用します。次の24時間のインキュベーションの前にテストされているカラムからDMSOを除去。 注：DMSOをプレートに残っている場合は、一晩、それがメディアボリュームの減少を引き起こし、隣接する列から水分を引きます。 </li></ol></li><li>試験溶液を温め（ すなわち 、EMEM-1X、RO、未処理のPBW及びCuO-NP処置PBWメディアソリューション）水浴中で37℃です。 </li><li>メディア、未処理PBW +メディア濃度またはCuOを-NP +（周囲またはベースラインの読み取りに使用された最初の列を含まない）、プレートの残りの部分から播種メディアを取り出して、EMEM-1X100μlで置き換え、RO - 処​​理PBW +メディア濃度（プレート当たり1溶液）。 7日（日2-8）の合計のために彼らの試験濃度や制御ソリューションで細胞をインキュベートします。 注：総あり10プレート：1 EMEM-1倍、1 RO +メディア、それぞれの未処理PBWの1 +メディア濃度（56％、44％、29％および16.5％）と、それぞれのCuO-NP処理したPBW +メディア濃度（53％、45％の一方のプレート、細胞株あたり1実験あたり30％＆17％）。 </li><li>ベースラインのMTT読み取り、次のそれぞれの日には、それぞれのプレートの次の列から（6.11の下にノートに記載された）対照および試験ソリューションを削除する（ 例えば、2日目試験および対照培地を、ウェルBG行3から削除され、3日目：行を4、ウェルBG 等 ）、上記の手順6.7から6.9に記載されているようにMTTプロトコルを繰り返します。 </li><li> 7日間毎日のプロトコルを繰り返します。各列（6ウェル）のためにOD結果を平均し、7日間の成長曲線を生成するために時間に対して報告しました。 </li><li>のCuO-NP処理したPBW +培地で細胞生存率に対する銅キレート化の効果を評価するには、それぞれのプレートにソリューションを追加する前に、ソリューションを制御し、テストするためにD-ペニシラミンの100μMを追加する以外は、上記と同じ手順に従ってください。データ肛門を行います科学的なグラフ作成ソフトウェアを使用してysis。 </li></ol> 7.地球化学モデル<ol><li>次のWebサイトからのVisual MINTEQバージョン3.0 / 3.1のフリーウェアをダウンロードしてください<a href="http://www2.lwr.kth.se/English/Oursoftware/vminteq/">http://www2.lwr.kth.se/English/Oursoftware/vminteq/</a> 。 注：Visual MINTEQは、金属分化、溶解度平衡、天然水のための収着などの計算のためのフリーウェアの化学平衡モデルです。加えて、イオン分化、イオン活性、イオン錯体及び要素の除去28の可能なメカニズムを調べるために、治療前後の元素の濃度（質量分析の結果）と比較される飽和指数を予測するために使用されます。 </li><li>プログラムに、pHは、アルカリ度と異なる元素の濃度を含む、ステップ4からプログラムと入力質量分析データを開きます。 注：地下水がその場 urani に中に酸化されていることを考えるとUM抽出プロセスは、入力のためにヒ素、バナジウム、及びウランの酸化種を使用しています。 </li></ol> 8.阻害濃度50（IC 50） <ol><li>最初の3つの別々の実験の5日目の生存率（ODの平均値）を平均化することにより、未処理及びCuO-NP処理したPBW +メディア濃度のIC 50を計算します。 </li><li> EMEM-1Xの5日目の生存率の平均値からの未処理及びCuO-NP処理したPBW +メディア濃度の減算5日目の生存率の平均値は、生存率の差を計算します。そしてEMEMで5日目の平均生存能力による生存率の差を分割し、阻害パーセントを取得するために100を掛けます。 </li><li>各未処理及びCuO-NP処理したPBW +メディアの集中のための生存率パーセントを取得するには100（EMEM-1Xの生存率）から阻害パーセントを引きます。 </li><li> 1の濃度と100の生存率パーセントでEMEM-1Xを設定することにより、科学的なグラフ作成ソフトに入力。ログにすべての濃度を変換しますスケール（X =ログ（X））と最小二乗適合分析を非線形回帰を行います。 </li></ol> 9.データ解析<ol><li>両側検定、対になった、スチューデントt検定を用いて、未処理及びCuO-NP処理したPBWにおける元素の濃度を比較します。 </li><li> 7日間にわたって収集成長曲線のデータを用いて、曲線（AUC）下の面積を計算し、反復測定分散分析（ANOVA）を用いて分散分析、全ての群の間でTukeyの事後比較に続いた（n = 3）。 </li><li> （上述の）未処理及びCuO-NP処置PBW +メディアソリューションの両方の成長曲線の5日目からのデータを使用してIC 50を計算する。&lt;0.05のP値は有意であると考えています。 注：統計分析の目的のために、半分検出限界の質量分析値はその制限値29を下回るイオン濃度レベルに割り当てられていました。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

以前の研究では、CuOを-NPは地下水11,13,30,31からヒ素を除去することを報告しました。本研究では、これらの以前の知見をサポートし、また、CuOを-NPはPBWから追加の汚染物質を除去することを報告しています。この研究はまた、他の汚染物質および潜在的な競合するイオン11の存在にもかかわらず、CuOを-NPは、ヒ素の除去に有効であることを以前のレポートを確認します。分化モデリングはCuOを-NPのへの吸着を可能にする、PBWにおけるバナジウム種の97％が負に帯電していることを予測して、バッチ処理は、バナジウムの92％が除去されました。 これはCuOの-NPを使用してPBWから特定の汚染物質を除去の影響を調査し、その後除去に関連細胞毒性の変化を評価した最初の研究です。結果は、in vitroアプローチを使用して複雑な混合物の細胞傷害性の変化を調査することが可能であることを実証するが、これらの方法には、制限がないわけではありません。 PBWがfを使用することができませんでした細胞のULL強度、生き残るためにあるため、...

米国電気供給の約20％は核エネルギーによって提供され、エネルギーの独立性を高めるために国のインセンティブに基づいている、米国の原子力容量が1増加すると予想されます。核エネルギーの世界的な成長は、米国外で発生した2成長の大部分で、継続することが予想されます。 2013年の時点で、米国のウランの83％は輸入されたが、埋蔵量の952544トン、米国3,4内に存在します。 2013年7新しい施設アプリケーションとワイオミング州、ニューメキシコ州、ネブラスカ5との間の14の再起動/拡張アプリケーションがありました。米国では、ウランは主に、その場の回復に （ISR）を介して抽出された6を処理します。 ISRは、より少ない土地の破壊を引き起こし、環境汚染物質7を解放することができテーリング杭の作成 ​​が回避されます。 ISRは、ウランを介して浸出液から抽出された後、地下の鉱体からウランを浸出する水ベー​​スの酸化·ソリューションを使用していますイオン交換法8。鉱体における負の水分バランスを維持するために、生産ブリード水（PBW）と呼ばれる浸出水の一部は、抜き取られます。 PBWの部分は、逆浸透（RO）を使用して、汚染除去およびマイニングプロセスに再導入されたが、毒性汚染物質が表面のための状態の規制機関によって決定される許容可能なレベルまで低減することができればPBWはまた、有益な工業または農業用途を有することができるし、地下水9。現在、ほとんどのISRウラン施設はPBWから汚染物質を除去するためにROを使用しています。しかし、RO処理は、エネルギー集約的であり、調整された処分を必要とする有害廃棄物の食塩水を生成します。 多くの水の浄化方法は吸着剤、膜およびイオン交換を含む、存在します。これらのうち、吸着は、最も一般的に使用され、ナノ粒子合成における最近の発展は、吸着剤ベースの水の汚染除去の機能10の処理を強化しました。銅オキシ以前に広くウランISR PBWに研究されていなかったデ·ナノ粒子（CuOを-NPS）が、地下水からの汚染物除去の最近の研究では、CuOを-のNPは、前または後の水処理工程を必要としないなどのユニークな特性を、（持っていることが判明しました例えば 、pHまたは酸化還元電位）を調整し、異なるpH、塩濃度、または競合イオン）11において、 例えば、（異なる水組成物でよく行います。また、CuOを、NPを、容易に再生のCuO-NPは再利用することができ、その後、水酸化ナトリウム（NaOH）を用いて浸出することにより再生されます。天然水からのCuO-NP微量金属フィルタリング機能の詳細は、先に11-14を公開されています。 水処理のために有用であるが、金属酸化物ナノ粒子は、生物に対して毒性であり得るが、毒性の程度は、ナノ粒子の特性および成分10,15,16に部分的に依存します。したがって、simultを勉強することが重要ですフィールドアプリケーション前aneous汚染物質除去とナノ粒子の毒性。現在の研究では（ヒ素、セレン、バナジウム及びウランを含む）PBW優先汚染物質を除去するためのCuO-NPの能力を決定し、PBW細胞毒性でのCuO-NPの治療の効果を評価しました。 PBWは、アクティブなISRウラン施設から収集し、優先度の汚染物質の除去にCuOを-NPの治療の有効性を決定するために利用されました。のCuO-NPの治療前後PBW細胞毒性も評価しました。 PBWは、複雑な地質（環境/産業用）の混合物であり、有害物質のための環境健康科学（NIEHS）と機関の研究所＆疾病登録（ASTDR）の両方が混合物を含め、環境に関連する混合物の毒性の研究に重点を置いています彼らは自然や産業環境に存在し、ならびにin vivoでのさらなる試験のための化学物質の優先順位を決定するためにin vitro試験で推進として17-19。低用量混合物への慢性暴露は、少なくともではない、ほとんどの実験室での研究の短い時間枠内で、明らかな効果を生じないため、慢性の研究は、低用量の混合物のエクスポージャーは、困難です。同様に、化学物質の混合物のインビトロ試験でほとんどが2以上の金属20,21の定義されたラボ製の混合物に細胞を公開します。これらの研究は、ベースライン情報を提供するが、簡略化された混合物は、混合物成分の全範囲が存在しているネイティブ、環境試料、で発生する可能性があり、複雑な拮抗との相乗的相互作用を複製しません。 本研究の目的は、PBWの代替汚染物除去プロセスを調べるために、培養ヒト細胞を用いた細胞毒性にPBW（のCuO-NP）の治療の効果を評価することでした。結果は、汚染物質を除去するための、より効率的で環境に優しい方法の開発を通じてウラン産業の利益を得ることができます。本研究では、提供します最初の証拠のCuO-NPSがPBWの重点汚染物質の削減は、哺乳動物細胞22に細胞毒性を減少させます。

<table><tbody><tr><td>CuCl2</td><td>Sigma</td><td>203149</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス球</td><td>VWR</td><td>26396-639</td><td>6 mm</td></tr><tr><td>硝酸</td><td>フィッシャー</td><td>A509-P500</td><td>微量金属グレード</td></tr><tr><td>0.45 &#956;m シリンジフィルター</td><td></td><td>Fisher SLHA 033S S</td><td></td></tr><tr><td>10x EMEM</td><td>Fisher</td><td>BW12-684F</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td></td><td>Fisher BP379-100</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ATCC</td><td>30-2300</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &#956;m 真空フィルターユニット</td><td>フィッシャー</td><td>09-740-28C</td><td></td></tr><tr><td>HEK293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>HEPG2</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>シグ</td><td>マ SV3003101</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>シグマ</td><td>M2128</td><td></td></tr><tr><td>D-ペニシラミン</td><td>フィッシャー</td><td>ICN15180680</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェルプレート</td><td>フィッシャー</td><td>07-200-92</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher</td><td>D12814</td><td></td></tr><tr><td>Spectra Max 190</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visual MINTEQ version 3.0</td><td>KTH Royal Institute of Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ICP-MS</td><td>Agilent</td><td></td><td>装置、モデル、検出限界の詳細は、Reddy et al., 2013に掲載されました。</td></tr><tr><td>IC DIONEX DX 500</td><td>Dionex</td><td></td><td>装置、モデル、検出限界の詳細は、Reddy et al., 2013に掲載されました。</td></tr><tr><td>VWRインキュベーター</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ウランの酸化銅ナノ粒子による微量元素の除去<em&gt;その場での</em&gt;回復ブリード水と細胞生存率への影響

Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability

その場で回収 （ISR） では 、米国におけるウラン抽出の主な方法です。 ISRの間に、ウランが鉱体から浸出され、イオン交換により抽出しました。得られた生産ブリード水（PBW）は、ヒ素や他の重金属などの汚染物質が含まれています。アクティブISRウラン施設からPBWのサンプルを第二銅酸化物ナノ粒子（CuOを、NPS）で処理しました。 PBWのCuOを-NP処置はヒ素、セレン、ウラン、バナジウムを含む、優先汚染物質を減少させました。 PBWは、細胞増殖培地の液成分として使用し、生存率の変化はMTT（3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド）によって決定された処理された未処理及びCuO-NPアッセイヒト胎児腎臓（HEK 293）およびヒト肝細胞癌（Hep細胞のG2）細胞です。のCuO-NP処理が改善されたHEKおよびHEP細胞生存率と関連していました。この方法の制限は、増殖培地成分によって、およびオスモル中PBWの希釈を含みますality調整だけでなく、必要に応じてpH調整。この方法は、希釈による効果とが伝統的にわずかに酸性であるPBWのpHの変化へのより広い文脈に限定されています。この方法は、より中立的な海域でのCuO-NPの治療を評価する広範な用途を持つことができます。

未処理及びCuO-NP処理したPBWでPBWの成分濃度、pHを表1に報告されている。マーティンとレディ（2009）は、CuOを-NPのゼロ電荷点が9.4±0.4と推定されていることを報告しました。これらの条件では、PBWのpHは7.2〜7.4であったことを考えると、水がナノ粒子表面が負に帯電した種の吸着を可能に課金させる、のCuO-のNPにプロトンを寄付しています。ヒ素、セレン、ウラン、バナジウム（ 表1）を含むPBWからのCuO-NP治療除去優先汚染物質。平均ヒ素濃度は[0.002 mg / Lで（両側検定対応のあるt検定、P &lt;0.0001）に0.0175から] 87％減少しました。のCuO-NPの治療も著しく低減セレン（30％）、ウラニウム（78％）、バナジウム（92％）、およびリン酸（85％）（p &lt;0.05）。 スペシエーションモデリングの結果、 表2に報告、分析結果をサポートしていますの99％PBWにヒ素を溶解TALはHA...

Production bleed water(PBW)を酸化銅ナノ粒子(CuO-NPs)で処理し、培養ヒト細胞の細胞毒性を評価しました。このプロトコールの目標は、CuO-NP処理による毒性の変化を評価するために、天然の環境サンプルを細胞培養フォーマットに統合することでした。

In situ recovery (ISR) is the predominant method of uranium extraction in the United States. During ISR, uranium is leached from an ore body and extracted ...

この手順の全体的な目的は、製造排水における汚染物質除去プロセスとして酸化銅ナノ粒子処理を検討し、培養ヒト細胞を用いてその細胞毒性を評価することです。まず、製造排水を酸化銅ナノ粒子で処理し、処理前後の個々の元素の濃度変化を評価することでこれを達成します。次に、濃縮した細胞培養培地を、未処理の製造ブリード水または酸化銅ナノ粒子で処理した製造ブリード水のいずれかで希釈します。標準的な細胞培養サプリメントに加え、ナノ粒子処理した製造ブリード水を用いて、試験用培地である「未処理製造ブリード水培地」および「酸化銅ナノ粒子処理製造ブリード水培地」を調製します。その後、これらの培地をヒト腎細胞および肝細胞に適用して培養し、7日間にわたって生存率を測定します。最終的に、M-T-T-S-Aは、製造工程からのヒ素、セレン、バナジウム、およびウランの除去を実証しています。酸化銅ナノ粒子によるブリード水の処理は、ヒト腎細胞および肝細胞の生存率の向上に関連しています。本研究は、細胞培養形式で除去に伴う細胞毒性の変化を評価しながら、酸化銅ナノ粒子を用いて特定の汚染物質の除去を調査した初めての研究です。この手法の既存の手法に対する主な利点は、自然界に存在するままの環境試料を、安価なハイドロプット形式でナノ粒子と共にテストできることです。本研究で検証した酸化銅ナノ粒子は、小規模コミュニティに関連する家庭用地下水などの他の地下水系にも適用可能です。酸化銅ナノ粒子の再生により、廃棄物の発生が抑制され、廃棄処理の問題を最小限に抑えることができます。この手順を開始するには、テキストプロトコルに従って酸化銅ナノ粒子を調製し、製造排水（PBW）を回収します。PBWを酸化銅ナノ粒子で処理するため、調製したナノ粒子 50 mgを 50 mLコニカルチューブに入れ、続いて PBW 50 mLを加えます。チューブを密閉し、ベンチトップオービタルシェーカーを用いて 250 RPMで 30 分間反応させます。サンプルチューブを 250 ×g で 30 分間遠心分離します。ナノ粒子が遠心管内で確実に凝集するように、ナノ粒子に応じて遠心速度と時間を調整してください。遠心分離後、0.45 µmのシリンジフィルターを用いて上澄み液をろ過します。ろ過後のサンプルは元素分析に回します。細胞培養培地を調製するには、まずラボのRO水を使用します。これらには、100%、75%、50%、および25%の未処理PBW、またはCIC酸化ナノ粒子処理PBWが含まれます。次に、190 mLの蒸留水に25 mLの10X-E-M-E-M濃縮液を加え、さらに処理済みおよび未処理の各濃度のPBWを加えます。各溶液のpHを、水酸化ナトリウムまたは塩酸を用いて7.4に調整します。次に、未処理および処理済みPBWに培地を加えた各濃度の溶液、ならびにRO制御培地に、テキストプロトコルに記載されている標準成分を添加します。未処理、未処理PBWに培地を加えた各濃度、およびRO制御水に培地を加えた溶液を調製した後、浸透圧を調整します。各溶液を溶質フリーのペーパーディスクに一滴滴下し、そのディスクを蒸気圧浸透圧計に設置します。次に、RO水を加えて浸透圧を290から310 mOsm/kgに調整します。最後に、各溶液を0.22 µmの真空フィルターユニットでろ過し、4°Cで保存します。ヒト胚性腎細胞およびヒト肝細胞癌細胞の培養は、播種する2〜3日前に準備しておきます。培養皿から細胞を回収し、トリプシンを用いて、1000 ×g で5分間遠心分離した後、トリプシンをデカントします。5 mL のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を加え、細胞を混合して単一細胞懸濁液を得ます。次に、単一細胞懸濁液を20 µL、ヘモサイトメーターに注入し、遠心分離後の溶液1 mLあたりの細胞数を算出します。前述のデカンテーションと同様に、細胞の洗浄に使用したPBSを、1X EMEMで適切に希釈し、ウェルあたり100 µLにつき500個の細胞濃度になるように調整します。続いて、蒸発を制御するため、プレートの外周ウェルにPBSを200 µLずつ満たします。1ウェルあたり500個の密度で細胞を播種し、外周のウェルを除いた各ウェルに100 µLずつ添加します。細胞を37 °Cで24時間インキュベートし、ベースラインのMTT測定による細胞密度の測定を行う前に回復させます。第1列から播種培地を除去し、100 µLのMTTをウェルに添加して1時間置き、細胞密度のベースラインMTT測定を行います。1時間後、MTTを除去し、生存細胞によって生成されたMTTホルマザンを溶解させるために100 µLのジメチルスルホキシドを添加します。次に、吸収波長570ナノメートルで最初の列の光学密度を測定します。ベースラインの測定値を得るため、プレートあたり1つの溶液を添加します。播種培地を、100マイクロリットルの1X-E-M-E-M ROコントロール培地、および処理済みおよび未処理の各PPW濃度を含む培地で置換します。細胞を、それぞれの試験濃度または対照溶液中で、計7日間、毎日インキュベートします。ベースラインのMTT測定後、それぞれのプレートの次列から対照溶液および試験溶液を除去し、MTTプロトコルを繰り返します。このプロトコルを7日間、毎日繰り返します。ODの結果をそれぞれ行ごとにまとめ、時間に対するグラフとしてプロットし、7日間の増殖曲線を作成することで、銅キレート化が細胞生存率および酸化銅ナノ粒子処理したPBWおよび培地に及ぼす影響を評価しました。コントロールおよび試験溶液をそれぞれのプレートに添加する前に、100 µMのペニシリンを添加する点を除き、同様の手順に従いました。最終ステップとして、科学用グラフ作成ソフトウェアを用いてデータ解析を行い、酸化銅ナノ粒子処理によって、PBW中の形態別分画からヒ素、セレン、ウラン、およびバナジウムが除去されたことを確認しました。モデリング結果は分析結果を支持しており、PBW中ではヒ素の99%、セレンの94%、バナジウムの99%が、酸化銅ナノ粒子に吸着可能な陰イオン種として存在していることが示されました。しかし、溶解したウラン種で負に帯電しているものはわずか35.5%であり、これが酸化銅へのウランの吸着を制限すると考えられます。未処理のPBWを含む培地で培養した細胞では、ナノ粒子の生存能が濃度依存的に低下しましたが、酸化銅ナノ粒子による処理は、両方の細胞株において細胞生存能を向上させました。コントロール培地で5日間にわたり培養したHeLaおよびHep細胞は、合流し、良好に接着した健康的で良好な外観を示しています。対照的に、未処理のPBWプラス培地で培養したHeLaおよびHep細胞は、合流度が低く、剥離が見られ、円形化または不健康な外観を呈しています。さらに、酸化セリウムナノ粒子で処理したPBWおよび培地で培養した細胞は、未処理のPBWおよび培地で培養した細胞と比較して、共蛍光、接着性、および生存状態の改善を示しました。この手順に続き、フローサイトメトリーなどの他の毒性試験法を用いて、メカニズム的な変化や、処理前後の混合物の細胞毒性に関するさらなる疑問を検討することが可能です。このビデオを視聴することで、水中の汚染物質を除去する際における銅およびナノ粒子の有効性の試験方法と、それが細胞培養に及ぼす影響について十分に理解できるはずです。ただし、処理水中の銅濃度をモニタリングすることが重要であることに留意してください。

removal-trace-elements-cupric-oxide-nanoparticles-from-uranium-situ

Research

JoVE Journal

Environment

環境

肝臓マクロファージは、Kupffer細胞と名付けられ、循環するナノ粒子の捕捉に関与しています。ここでは、Kupffer細胞単離のための高い細胞純度と高収率の方法について説明します。ここでは、修飾LDHアッセイを使用して、Kupffer細胞のカーボンナノチューブによって誘発される毒性を測定します。...

ナノ粒子の毒性試験のためのクッパー細胞の単離

そのため、パラジウム、金とコバルトの重要性と広範な使用の ハイテク機器における金属は、その回収・リサイクルは重要な産業の課題となっています。本明細書に記載の金属回収装置は、簡単​​、低コストで効果的な検出、除去、都市鉱山からこれらの金属を回収するための手段です。...

検出とパラジウムの回収は、都市鉱山からの金やコバルト金属は、ナノスケールワゴンホイール形の細孔を有する指定小説センサ/吸着剤を使用しました

薄膜における拡散勾配（DGT）の技術は、プルトニウムの分化の研究のために提案されています。このプロトコルは、有機物の存在下でのPu（IV）とPu（V）の動作をプロービング拡散実験について説明します。カルスト春に配備DGTSはプルトニウムの生物学的利用能の評価を可能にします。...

薄膜における拡散を用いた環境プルトニウムのスペシエーションと生物学的利用能の測定

我々 は元素存在原体外数量化と同様に、人間の細胞を検出するための手順について説明します。メソッドは、任意のセル型に適してし、単一細胞の in...

その場で検出および核マイクロ プローブ分析法を用いた金属酸化物ナノ粒子の単一細胞定量

ウランは、骨代謝に影響を与える知られています。ここでは、担当骨細胞破骨細胞の機能や分化、生存率に及ぼす天然ウランの影響の調査を目的としたプロトコルを提案する.

培養破骨細胞形成に天然ウランの影響を分析するための方法

このプロトコルは、超高真空下で U2O5得られた薄膜の場で準備を提示します。プロセスは、それぞれ酸化と...

U2O5膜を介して直流スパッタリングと連続酸化による UO2成膜と酸素原子と水素原子の還元

このプロトコルは、230Th-U二分衡年代測定のためのFe共沈降および抽出クロマトグラフィーを用いて海底熱水硫化物試料中のあなたとTh核種を精製および分離する方法について説明する。...

海底熱水硫化物の230Th-U年代測定のためのウランとトリウムの分離

本研究では、地下水からヒ素を吸着するカチオン性N、N-ジメチルアミノプロピラクリラアミドメチル塩化メチル塩化メチル(DMAPAAQ)ポリマーゲルと水酸化鉄からなる吸着剤を用意した。ゲルは、その構造内の鉄粒子の最大含有量を確保するように設計された新しい方法を介して調製されました。...

水酸化鉄を含浸させたカチオン性ポリマーゲルを用いたヒ素の除去

カーボンナノチューブとチタン酸ナノワイヤーからなる二重機能電気活性フィルタの合理的な設計のためのプロトコルが報告され、Sb(III)酸化と隔離に向けた環境応用が提示される。...

Sb(III) 酸化と隔離を同時に行う二重機能電気活性フィルタ

本稿では、赤色土からFe2O3/ファウジャサイト(FAU)型ゼオライト複合材料を合成するための斬新で便利なルートを紹介します。詳細な合成パラメータは微調整されています。得られた複合材料は、重金属汚染水処理の効率化に利用でき、環境工学への応用が期待されています。...

重金属除去用Fe2O3/FAU型ゼオライト複合材料合成のための赤土の資源循環

学ぶ酸化銅ナノ粒子による産業廃水の浄化法とヒト腎臓・肝臓細胞を用いた細胞毒性評価の手法。この技術は環境修復と水質安全性向上に貢献します。

ウランの酸化銅ナノ粒子による微量元素の除去

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