Name: マウス子宮頸部リンパ節の高周波超音波イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: 学ぶマウス子宮頸部リンパ節の高周波超音波イメージング法。麻酔下のマウスを加熱プラットフォームに固定し、40MHzトランスデューサーでリンパ節を可視化し、画像ガイド下に生検を行う手法です。形態と血流の定量化に有用です。

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この作品は、ウェストバージニア大学メアリーバブランドルフがんセンターのドロシーD.ラドフォード基金の資金によってサポートされていました。 （メアリーバブランドルフがんセンターおよびNIHの助成金のP20のRR16440、P30のRR032138 / GM103488とS10 RR026378でサポートされている）ウェストバージニア大学動物モデルおよびイメージング機能（AMIF）と顕微鏡イメージング機能（MIF）の使用は感謝して承諾されます。

このプロトコルで実証すべての動物の手順を見直し、プロトコル11から0412と14から0514の下でウェストバージニア大学動物実験委員会によって承認され、管理と使用のためのNIHガイドで概説した原理および手順に従って実施されてきました動物の。 1.動物の準備<ol><li> 1.5 L /分、100％の酸素を混合し、3％イソフルランを使用して誘導チャンバ内で単一のマウスを麻酔。 40℃に予熱し、37-42℃の（ 図2A）との間に維持イメージングプラットフォーム上で仰臥位で誘導チャンバーと場所から動物を削除します。つま先のピンチへの応答の欠如によって麻酔を確認します。 </li><li>麻酔システムに接続されたノーズコーン内でマウスの鼻の位置を調整します。定常状態の鎮静（1.5リットル/分、100％の酸素と混合した1.5​​％イソフルラン）を維持するために麻酔を適用します。 </li><li> dryin防ぐために目の潤滑剤をインクルードそれぞれの目を適用しますgです。電極に電極ゲルを適用し、対応する電極に4足のそれぞれを確保するためにテープを使用します。電極パッドは、心拍数と呼吸数のモニタリングを可能にするために、撮像システムに動物のECGを送信します。注油と体温を連続的に監視するための直腸温度プローブを挿入します。正常マウスの体温は36.9℃です。 1-2℃の変動は麻酔下にある間は正常です。 </li><li>マウスの首から毛を除去するために、脱毛クリームを使用してください。髪や過剰な脱毛クリームを除去するために水に浸したガーゼでネック領域をすすぎます。必要に応じて、残りの体毛（ 図2B）を除去するために、脱毛クリームの追加のアプリケーションを使用します。 </li></ol> 2.識別とHFUSを用いてマウス子宮頸部リンパ節の画像取得<ol><li>開始するには、毛皮を欠い首領域に加温し超音波ゲルの層を適用します。最適な画像のためのゲルのリベラルなアプリケーションを使用します品質（ 図2C）。超音波画像を妨害することができるアプリケーション、中にゲル内に気泡を導入することは避けてください。 </li><li>イメージングプラットフォームので、マウスをわずかに高いヘッドで配置されている20〜30度を調整します。この位置は、マウスに最適な呼吸速度を確保するために役立ちます。実装システムで横方向に40 MHzのトランスデューサーを配置し、トランスデューサスキャンヘッドの前を超音波ゲル（ 図2C）に浸漬されるまで、慎重にそれを下げます。 注：それは過度の呼吸困難を引き起こす可能性があるとして、マウスの首の上に過剰な圧力をかけないようにしてください。また、トランスデューサとマウス間のゲルのバッファを持って撮影に便利です。 </li></ol>リンパ節のBモード·イメージングおよび検出： <ol start="3"><li> HFUS取得ソフトウェアを制御するコンピュータを使用して、次のパラメータに明るさ（B-）モードの設定を変更する：ゲイン22デシベル、深さ10.00ミリ、幅14.0​​8ミリメートル。 注：これらの設定は、出発点を示唆しており、異なるアプリケーション間で最適な画像取得のための若干の調整が必要な場合があります。周囲高エコーフィールド内の皮膚表面に近い楕円形の低エコー構造として、通常の頸部リンパ節を観察します。罹患リンパ節の外観はモデル間で変化することができます。体系的にイメージがネック領域内のすべてのリンパ節は、次の手順を使用するには： <ol><li>胸部に向けての方法を尾側する頭蓋に首をスキャンするために、Y軸を使用してください。画像を中央にX軸を使用してください。 </li><li>主要なランドマークを特定します。口腔、舌、および甲状腺（ 図3A、BおよびC;それぞれ）。水平首の両側にも、Bモード画像で表示されながら、マウスの首の腹側表面を調整する撮影台を傾けます。チルトの量は、個々のマウスの生理機能に依存します。 </li></ol></lI&gt; <li>首全体にリンパ節および関連するランドマークをマッピングするために、甲状腺に口腔/舌領域から全体ネック領域の3次元スキャンを実施します。 <ol><li>舌/口腔領域（ 図3A）を見つけて、Yスケールの数値場所を確認します。 </li><li>甲状腺（ 図3C）を見つけて、Yスケールの数値場所を確認します。 </li><li> （2.4.1）において得られた値の間の差を計算し、（2.4.2）撮像さ頸部用mm単位の合計長さを決定します。 </li><li>決定された全長の中間点に変換器を中心にYノブを使用してください。 </li><li>を押して「3D」。全体の長さを入力します。 3Dステップサイズについては、全体のネック領域の画像シリーズのスタックを取得するために0.076ミリメートルを使用しています。 </li></ol></li><li>スキャンが完了すると、次に4を上げ、首の右側または左側を選択して、関心の個々のリンパ節にトランスデューサを中心マウスオフ0 MHzのトランスデューサ。 40 MHzの変換器を取り外し、高解像度の画像を得るために（も横位置での）50 MHzのマイクロスキャン変換器を交換してください。マウスの首に超音波ゲルを補充し、超音波ゲルに50 MHzのトランスデューサを下げます。 </li></ol> 3Dパワードップラーイメージング<ol start="6"><li>以下のように個々の頸部リンパ節のロバのボリュームと血管分布にパワードップラーで3Dスキャンを実施します： <ol><li>プレスシステムキーボードの電源ボタンパワードプラを取得し、以下の省電力モードの設定を調整するには：PRF 4キロヘルツ、ドップラーが34デシベル、2D利得30デシベル、深さ5.00ミリメートル、幅4.73ミリメートルを得ます。注：前述のように、これらの設定が提案出発点であり、様々なモデルにおける最適な画像取得のために必要に応じて変更することができます。 </li><li>興味のあるリンパ節の頭蓋最もポイントを見つけて、Yスケール上の位置に注意してください。 </li><li>同じノードおよびノー​​トの最も尾側の点の位置を確認しますYスケール上の位置。 </li><li>リンパ節の全体の長さを決定するための距離差を計算する（ステップ2.4​​.3を参照）。 </li><li> Yスケールの場所を使用して、決定された全長の中間点に変換器を中央に配置します。 </li><li>を押して「3D」と総リンパ節の長さを入力します。ステップサイズの0.051ミリメートルを使用してください。 注：これにより胸部への変換器の近くに、50 MHzのトランスデューサは、通常の呼吸運動の検出に起因する不安定なドップラー画像になることがあります。これは、「生理​​」タブの下で入手可能な「呼吸ゲーティング」オプションを使用して除去することができます。 </li><li>パワードップラーにより分析し、画像を取得するための「3Dスキャン」を選択する領域を指定黄色のボックスで選択されたリンパ節を囲みます。マウスのオフ変換器を持ち上げ、首の反対側に移動します。マウスへの変換器を下げて、IMAに上記の手順を繰り返し首のこちら側のGEのリンパ節。 </li></ol></li><li>その後の分析のための画像セットを保存します。 </li></ol> 3.子宮頸部リンパ節生検<ol><li>生検のための所望のリンパ節を選択し、50 MHzのトランスデューサとHFUSイメージングを維持します。マウスの首の両側で最大の可視頸部リンパ節を選択しました。リンパ節腫脹は、典型的には、炎症反応を示し、したがって、そのようなノードは、生検のための理想的な候補です。 注：我々は、それが10mm 3未満の子宮頸部のノードの生検を行うことが非常に困難である発見しました。 </li><li>シリンジホルダーに取り付けられた27 G、0.5インチの針で1mlシリンジを配置することによって、生検用の針と注射器を準備します。マウスの首（ 図4A）に針90°を配向させるためにニードルホルダを調整します。 </li><li>針のレベルに全体のマウスのプラットフォームを上昇させることによって準備します。 3Dモーターを除去し、背の高いplatfに切り替えることでこれを達成しますORM、または提供される短いプラットフォームの下で適切な高さの立体物を配置することによって。この目的のためにプラスチック製のマイクロチューブのラックを使用してください。必要に応じて、針装置のネックと反対側に位置する生検ノードのためにプラットフォームを180°回転させます。 </li><li>その後、「マックス＆拡張バッファ」を選択して、「環境設定」を選択することで取得設定を調整します。 8.00ミリメートルと9.73ミリメートルの幅の深さまで視野を拡大します。キーは、ダイヤル画面を使用して、針ガイドをオンにします。針ガイドは、画面上の針の経路を予測し、ユーザーが、生検のための正しい位置に関心のあるリンパ節をラインアップすることができます。 </li><li>リンパ節は、途中でまたはわずか画面（ 図4B）の中央の左側にリンパ節を中心にして、ビューに常に残っていることを確認してください。手順の全体のシネループを得るためには、生検を開始する前に、システムのキーボード上のプリトリガーを押します。 </li><li>針の先端は、ビューと皮膚に接触（ 図4B）になるまで、ニードルホルダを調整します。高速皮膚を穿刺するためにプッシュする、しっかりと針を進めます。チップはまた、（ 図4C）カプセルを穿刺し、髄質（ 図4D）内に表示されるまで針を前進させるために続けています。 </li><li>針が適切にノード内に配置された後、静かに生検（ 図4Dおよび4E）を行うために戻って200〜300μlの境界設定との間にシリンジプランジャを引きます。生検材料は、シリンジ内に一般的に表示されていないことに注意してください。 </li><li>静かにマウス首から針を取り除きます。 1.5mlマイクロチューブに注射器の内容物を排出します。チューブに針を残して、注射器から針を外します。同じ注射器で（一定分量から、株式の供給源から分離）の生検培地1mlを採取し、目に針を維持しながら、シリンジに針を再接続電子管。 <ol><li>チューブに生検メディアを排出することにより、生検メディアと注射器と針をすすぎます。 注：針が生検後の任意の時点で接続されている間、プランジャーを後方に引いてはいけません。これは、小さいサンプルサイズに生検材料を失う危険性を減少させます。 </li></ol></li><li>組織学的手段（ 図4F）によるリンパ節の内容を確認し、必要に応じて追加の方法（組織化学など 、フローサイトメトリー）によって分析します。 </li><li>生検が完了すると、麻酔をオフにして、直腸温度プローブを削除します。ガーゼでマウスから過剰な超音波ゲルを外し、各足からテープを削除します。 </li><li>イメージングプラットフォームからマウスを外し、ケージに戻します。生検部位からの最小限の出血が発生する可能性がありますが、これは介入せずに停止します。フル活動が再開されるまで回復中に、マウスを監視します。 </li></ol> 4.イメージ子宮頸部リンパ節の分析<ol><li&gt;は、超音波ソフトウェアでは、分析のための画像を選択し、「画像処理」タブに移動します。 「3Dにロード」を選択します。 </li><li> 「1つのペインを表示」ボタンをクリックし、左上隅にある「3D再構成画像」を選択します。必要に応じて、画像を拡大するズーム機能を使用してください。ビューからのパワードップラーオーバーレイを削除するだけで、Bモードで画像を表示するには、「表示レイアウト」、トグル。これは、簡単に、その後の3-D分析中のリンパ節のエッジを参照することができます。リンパ節の始まりを見つけるために画像シリーズをスクロールします。 </li><li>リンパ節に外接するには、「3D設定」タブに移動します。その後、「スタート」ボタンの横に「パラレル」の「ボリューム」を選択します。 </li><li>スクロールして、個々の画像内の関心領域の周りに輪郭を描きます。全体のリンパ節を包含した画像がマークされるまで続けます。に「完了」を選択してください分析を完了。 </li><li>画像の下部には、3Dボリュームおよび％血管分布が自動的に表示されます。 注：3Dボリュームは、リンパ節の容積に対応し、パーセント血管パワードップラーによる血流について陽性リンパ節の割合を表します。 </li><li> 「表示レイアウト」トグルB-モード画像上のオーバーレイとしてのパワードップラー画像を表示します。表面図に関心のあるボリューム領域のネットビューを観察します。さらなる使用のための映画（.AVI）としてタグ付けされた画像ファイル（TIF）形式または3Dスキャンで画像をエクスポートします。 </li></ol>

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説明されたプロトコルは、可視化のための非侵襲的なHFUSイメージングを使用して、マウスの子宮頸部リンパ節のその場評価に可能にします。頸部リンパ節の形態、量、およびリンパ節の血流を可視化するためにBモードとパワードップラー画像化の使用は、臨床診療における子宮頸部患者のノードの特徴付けのために使用されるものと同様の前臨床マウスモデル系の実験的な分析を提供します。細針生検を介しcervialリンパ節を監視する能力はまた、免疫細胞の変化およびマウスにおける口腔疾患誘発性リンパ節症の間の外来細胞型または細菌の存在を検出するために有用な技術を提供します。使いやすさとHFUSに関連する低コストは、動物モデルの多種多様な頸部リンパ節の状態の迅速なスクリーニングを可能にします。 このプロトコルにおける重要なステップは、HFUS画像内の頸部リンパ節の最初の成功の識別です。私たちの施設ではHFUS TRANの品揃えを持っています我々は、最高品質の画像を得るためにそれらを使用しているようsducersは、説明します。ここで説明トランスデューサが利用できない場合は、それは他のトランスデューサを用いた撮像を適合させることが可能です。この目的のために、適切な画像を得るために画像の深さと幅を調整する必要があるすべてです。このような画像の解像度が異なる場合があり、それはまだHFUSを使用して高品質の画像を得ることが可能であるべきです。口腔と甲状腺のイメージングランドマークが大きくリンパ節が局在している適切な領域にユーザーを向けるのに役立つでしょう。皮膚表面に近い特性楕円形、低エコー自然と表面的な場所は、適切なネック領域内の頸部リンパ節を迅速に確認同定を可能にします。すべての3つのノードが単一の結像面（ 図3B）で見えるかもしれないが、通常、1つまたは2つのノードは、撮像中に捕獲されます。トランスデューサ位置の微調整を引き裂くために実施することができます首の片面上のすべてのノードの可視化を可能にする可視異なる画像平面、えー。 我々は頸部リンパ節を同定するための信頼性のある記載された技術を発見しているが、イメージング、生検技術に固有の制限があります。わずかな圧力がトランスデューサヘッドを介して皮膚に適用した場合、マウスの子宮頸部リンパ節の表面的な性質は、過度の移動性を付与します。これにより、ランドマーク画像が特定されるまで、ゆっくりとマウスの頸部に超音波ゲルにトランスデューサヘッドを適用することによって相殺することができます。リンパ節モビリティは、より高い分解能（50 MHz）の範囲内の変換器を使用する場合は特に、細針生検を複雑にすることができます。生検のためのリンパ節の中心画像は、一般的に起因覆っている皮膚やカプセルを穿刺するために必要な生検針の力に視野の外に押し出されています。これは、針落ちの方向に向かってリンパ節のオフセンター位置によって改善することができますリンパ節は全体プッシュそれでも生検時に視野内に維持するための空間を提供します。我々の経験、リンパ節&gt;に10mm 3は、生検することが非常に困難であり、多くの場合、ニードル前進中に針によって押さなく貫通しています。このように、生検が最良のサイズが子宮頸部領域内に十分なノード目標サイズと安定性を確保するために&gt; 10ミリメートル3であるリンパ節腫大のために予約されています。また、生検材料は、より大きな細胞数が必要な手順については、十分な細胞数を含めることはできません（ 例えば 、フローサイトメトリー）。 HFUS正常同所HNSCC腫瘍25を可視化するために使用され、口腔腫瘍24を有するマウスにおける子宮頸部リンパ節転移を監視する可能性を有するされています。超音波に加えて、生物発光イメージングは、また、生きたマウスに同所26,27口腔腫瘍形成および頸部リンパ節転移を可視化するために使用されています。 alternとしてativeアプローチは、生物発光イメージングは​​、直接、同じ動物において経時的腫瘍の進行および転移の負荷を定量化することができることにHFUSを超える明確な利点を有しています。紛れもなく有用ながら、生物発光イメージングは​​、リンパ節の形態、結節ボリュームまたは血流などのHFUSによって可視化パラメータの多くを測定することができません。生物発光イメージングは​​また、細針生検のための適応のための不適当なこの技術をレンダリング、撮像中にマウスを維持するために、特殊な暗いボックスを必要とします。 さらに、生物発光イメージングは​​、この技術は、免疫不全マウスにおけるルシフェラーゼトランスフェクト腫瘍細胞と、またはルシフェラーゼ発現を制限し、誘導性、組織特異的遺伝子導入システムにのみ同所性異種移植片の場合に使用されることを可能にする、安定ルシフェラーゼ酵素を発現する腫瘍細胞の産生を必要とします腫瘍由来の組織に特異的な時空間的な方法で。対照的に、HFUSをuとすることができ同様に、完全な免疫系28,29とマウスで発がん性物質により誘導される経口腫瘍のモデルで頸部リンパ節を画像化することができるものとして、これらのモデルにおける生物発光画像と一緒にsedの。 HFUSは口腔癌のほとんどのマウスモデルに、より適応可能であるかもしれないが、腫瘍細胞は、ルシフェラーゼを発現システムに生物発光とHFUS撮影から得ることができる合わせた情報だけでは画像化モダリティのいずれよりも子宮頸部リンパ節転移のより完全な画像を提供することができます。 リアルタイムでマウス頸部リンパ節を同定および検出する能力は、動物が短期麻酔下反転位置に維持することができる炎症性リンパ節症をもたらす口腔疾患の多くのモデルで使用されるこの技術を可能にします。リンパ節転移または細菌感染症と生きている動物におけるリンパ節の形態に付随する影響の検出は、従来の方法に比べて大きな利点を提供しますリンパ節の組織学的処理のために死んだ動物から除去する必要があります。細針生検と組み合わせHFUSは、口腔疾患の最新のマウスモデルにおける疾患の進行をモニタリングするための改善された方法を提供し、診療所で行われるものと同様の頸部リンパ節のルーチン病理学的分析を行うための手段を可能にします。

間質組織液のリンパドレナージは、口腔顎顔面領域1,2に発生する感染性微生物および癌のための普及の主な方法です。頸部リンパ節の臨床評価は、口腔に由来する疾患の存在または進行を決定するために使用される一般的な診断的です。これは、口腔疾患の診断の3のための貴重な解剖学的部位として収集頸部リンパ節の重要性を強調しています。いくつかの特殊なイメージング方法は、臨床的に罹患した頸部リンパ節を識別するために利用されます。これらは、陽電子放出断層撮影（PET）、コンピュータ断層撮影（CT）及び磁気共鳴イメージング（MR）が含まれます。非常に価値が、これらの方法は全て、有効またはイメージングプロセスを強化するために循環中に大規模な患者の準​​備、専門性の高い機器および/または化学的な注入を必要とします。 超音波検査イメージング（超音波;米国）がイムに使用される一般的に適用される技術でありますによる感染または転移性関与4-6にリンパ節腫脹を呈する年齢頸部リンパ節。 USは、多くの場合、外科的切除7について腫瘍病期および必要性を決定するのに役立つ、患者のリンパ節の状態の包括的な表現を提供するために、PET-CT及びMRイメージングと組み合わせられます。米国の非侵襲性の性質はまた、使いやすさ、低コスト、最小限の患者の不快感および調製を含む他の撮像モダリティを超える固有の利点を有しています。ほとんどの頸部リンパ節の表面皮下場所は、米国は診断精度を向上させる8、精度の向上と低侵襲性の穿刺吸引生検を誘導することを可能にします。 商業高周波（HF）米国は30ミクロン9の内部解剖学的構造の詳細な解像度を提供します。 22-70 MHzの範囲の振動子を使用して、HFUSを容易にインビボでの臓器のリアルタイムイメージングを可能にするために、実験的なげっ歯類の様々なシステムに適用されています。; HFUS一般と専門コントラスト強調agents9の数と同様に、従来の明るさ（B）モードにおける腫瘍形成の視覚化のために適合されています。 HFUSとパワードップラーを使用して、生きたマウス10,11に血管新生灌流の包括的評価を可能にする、マウス腫瘍内の血流を監視する能力を提供します。 HFUS臨床診療に、この技術の有用性を実証する並列、本体キャビティ内に罹患マウスのリンパ節を可視化するために使用されています。具体的には、炎症性および転移性の内臓のリンパ節の変化は、乳房12,13、膵臓14、大腸15と肺16の腫瘍、並びに繊維状histocytomas 17、取得した水腎症18の経年マウスモデルを保有する癌のマウスモデルにおいて観察されています。これらの例は、ROの多種多様な腫瘍誘発性リンパ節腫脹のための強力な調査ツールとしてHFUSの値を固めます凹みシステム。 細菌感染19,20および頭頸部扁平上皮癌（HNSCC）21,22のいくつかのモデルは、前臨床設定においてこれらの疾患を研究するために開発されてきました。人間とは対照的に、マウスは、口腔組織（下顎、顎下顎および浅耳下腺23）からリンパ液を調査3頸部リンパ節が含まれています。最近、我々は、HNSCC 24の発癌物質誘発性マウスモデルにおけるリンパ節の量および血流の変化を監視し、これらのリンパ節の位置及び形態をマッピングするHFUSを使用することを報告しました。ここで、我々は、識別イメージングおよび生きたマウスで頸部リンパ節を分析するためのHFUSを使用するための詳細なプロトコルを提供します。このプロトコルはまた、T以上の頸部リンパ節の含有量の変化や病理組織学的モニタリングを可能にする、拡大マウス頸部リンパ節の画像 - 導かれた細針生検を実施するHFUSを使用することの実現可能性を実証します同じ動物でIME。このプロトコルは、マウスにおける任意の侵襲的口腔疾患から生じた頸部リンパ節病変の詳細な研究を可能にするために容易に適合可能です。

<table><tbody><tr><td>Vevo2100 高解像度マイクロ超音波イメージングシステム、統合ソフトウェア バージョン 1.6.0</td><td>VisualSonics、トロント、オンタリオ州、カナダ</td><td>VS-11945</td><td></td></tr><tr><td>パワー ドーッパー モードと 3D モード</td><td>VisualSonics、トロント、オンタリオ州、カナダ</td><td>VS-11952;VS-11484</td><td></td></tr><tr><td>Vevoコンパクト麻酔システム</td><td>VisualSonics、トロント、オンタリオ、カナダ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>注射用3Dモーターとマイクロマニピュレーターを含むVevo統合レールシステム</td><td>VisualSonics、トロント、オンタリオ、カナダ</td><td>SA-11983</td><td></td></tr><tr><td>サーマソニックジェルウォーマー</td><td>VisualSonics、トロント、オンタリオ、カナダ</td><td></td><td>オプション</td></tr><tr><td>トランスデューサー &ndash;MS-550D(ブロードバンド周波数:22 MHz - 55 MHz)</td><td>VisualSonics、トロント、オンタリオ州、カナダ</td><td>VS-11960</td><td>40 MHzトランスデューサ</td></tr>トランスデューサーと呼ばれます<tr><td>。MS-700 (広帯域周波数: 30 MHz - 70 MHz)</td> <td>VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada</td><td>VS-12026</td><td>50 MHz トランスデューサ</td></tr>ー <tr><td>眼科軟膏</td><td>パターソン 獣医</td><td>07-888-1663</td><td></td></tr><tr><td>電極ゲル</td><td>パーカー研究所</td><td>174-1525</td><td></td></tr><tr><td>テープ</td><td>メディカルアーツプレス</td><td>174-153000</td><td></td></tr><tr><td>脱毛クリーム</td><td>カーター製品</td><td></td><td></td></tr><tr><td>綿棒</td><td>一般供給</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガーゼ</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>22-037-907</td><td></td></tr><tr><td>水</td><td>一般供給</td><td></td><td></td></tr><tr><td>潤滑ゲル</td><td>パーカー研究所</td><td>57-05</td><td></td></tr><tr><td>超音波ゲル</td><td>パーカー研究所</td><td>01-50</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブラック</td><td>一般供給</td><td></td><td>最適な生検位置のためのマウスプラットフォームを上げるために使用されます</td></tr><tr><td>27 G &frac12; 1 mlシリンジ付きインチ針</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-826-87</td><td></td></tr><tr><td>ThinPrep PreservCyt ソリューション</td><td>Hologic</td><td>70097-002</td><td>生検培地として参照</td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ</td><td>一般供給</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thinprep 2000 プロセッサ</td><td>Cytyc、マールボロ、マサチューセッツ</td><td></td><td>州ブルーフィルター</td></tr><tr>オ<td>リンパスAX70プロビス顕微鏡</td><td>オリンパス、ペンシルバニア州</td><td></td><td></td>センターバレー</tr></tbody></table>

マウス子宮頸部リンパ節の高周波超音波イメージング

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

高周波超音波（HFUS）が広く、実験小動物系で内部の解剖学的構造を画像化するための非侵襲的方法として使用されます。 HFUSは30ミクロンほどの小さな構造物を検出する能力は、輝度（B）モードにげっ歯類における表在リンパ節を可視化するために利用されている特性を有しています。 Bモードイメージングと組み合わせるパワードップラーは、リンパ節および他の器官内の循環血流を測定することができます。 HFUSをマウスモデル系の数のリンパ節のイメージングのために利用されてきたが、マウスでHFUSイメージングおよび頸部リンパ節の特徴を説明する詳細なプロトコールは報告されていません。ここでは、HFUSマウスで頸部リンパ節を検出し、特徴づけるために適合させることができることを示しています。合わせたBモードとパワードップラーイメージングは​​、免疫学的に拡大した子宮頸部のノード内の血流の増加を検出することができます。また、全く頸部リンパの穿刺生検を実施するBモード画像の使用を記載していませんDESは、組織学的分析のためのリンパ組織を取得します。最後に、ソフトウェア支援ステップは、リンパ節の体積の変化を計算し、画像再構成次のリンパ節の形態の変化を視覚化するために記載されています。視覚的に時間をかけて頸部リンパ節生物学の変化を監視する能力は、口腔疾患の前臨床マウスモデルにおける頸部リンパ節の変化を非侵襲的にモニタリングするためのシンプルかつ強力な技術を提供します。

イメージング及び生検手順の全体的な概略図を図1に示されている。手順における重要なステップは、適切なイメージングのためのマウスの準備、頸部リンパ節の同定、正しい準備および針生検を行うと、Bの分析を含みます - モードとドップラー画像は、ボリューム及びコンピュータソフトウェアを使用して、各選択されたノード内の血管の量を測定します。 マウス頸部リンパ節のHFUSイメージングは、撮像期間（ 図2A）を通して適切な麻酔を適用し、維持する必要がありますだけでなく、全体の首の領域（ 図2B）を覆う毛を完全に除去します。脱毛の領域に超音波ゲルのリベラルなアプリケーションは、手順（ 図2C）の間に明確なHFUS信号を保証します。 ネック領域のHFUSイメージングは特性超音波診断画像を生成する子宮頸部の解剖学的ランドマークの可視化によって支援されている。 図図3は、キーの臓器（ 図3A-C）、Bモード（ 図3D）およびパワードップラーモード（ 図3E）で頸部リンパ節の例を示しています。 麻酔したマウスでのリアルタイムHFUSイメージングは​​、臨床現場で行われているものと同様の子宮頸ノードのガイド付き細針生検を可能にします。制御マイクロインジェクター装置に生検針及び添付収集シリンジの配置は、図4Aに示されています。その後のBモード超音波検査画像は、理想的な生検の前に針の配置（ 図4B）、生検（ 図4D）の間に頸部リンパ節（ 図4C）、および針位置へ針先エントリを表示しています。クローズアップ画像は、リンパ節（ 図4E）の髄質内針の先端を示しています。サイトスピンによる生検成分の処理が成功したリンパ節の検証、豊富なリンパ系細胞クラスターおよび関連する結合組織を明らかに生検（ 図4F）。 HFUS画像の計算に基づいた分析は、リンパ節のアーキテクチャは、ボリュームや血流に関する得られる詳細な情報が含まれます。パワードップラーモードと3D体積測定、パーセント血管（PV）を使用すると、全体のノード（ 図5A）を包含する画像系列から計算することができます。また、3次元画像化は、全体的なリンパ節トポグラフィ（ 図5B）を明らかにする、仮想リンパ節の再構築を可能にします。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52718/52718fig1.jpg" /> 図1：マウスにおける診断HFUS頸部リンパ節イメージングに必要な手順の概要回路図は重要なステップとしては、1：HFUSイメージングのためにマウスを準備し、3つのマウス頸部リンパ節を含むネック領域の40と50 MHzの解像度の画像を取得します。 2：頸部リンパ節の細針画像誘導生検およびその後の組織学的分析を<html>生検材料の。 3：コンピュータ支援画像解析及び血流の各リンパ節の量及びパーセント（％）を決定するためにBモードとドップラーで得られたリンパ節画像の3D再構成。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52718/52718fig2.jpg" /> 図2：頸部リンパ節評価とバイオプシーインビボマイクロイメージングシステムにおける高解像度の概要（A）HFUSシステムは、頸部リンパ節イメージングのために調製し、麻酔したマウスで示されています。また、マイクロインジェクター（MI）と3D-モータステージ（3D MS）付属設備が示されています。 （B）は、ネック領域において除去髪のHFUSイメージングのために用意し、麻酔したマウスのビューを閉じます。 （C）首の代わりに50 MHzのトランスデューサと同じマウス。ネック領域のイメージングを容易にするために使用される追加の超音波ゲルを注意してください。 718fig3.jpg &quot;/&gt; 図3：Bモードとパワードップラーで代表HFUS子宮頸部解剖学画像。 （A、B）鼻腔に最も近い画像化によって可視化口腔（BC）および舌（T）を示す口腔のBモード画像、。首の各側面上に見出される3頸部リンパ節は、（M、下顎標識; SM、顎下、SP、表在性耳下腺）は（B）に示すように、単一の撮像平面内の低エコー構造群として現れます。 （C）甲状腺（TH）の上部胸部で可視化されるように、固体、エコー源性バタフライ状の構造体として現れます。 （AC）は、40 MHzのトランスデューサーで可視化しました。スケールバー= 1ミリメートル。 （D、E）は、通常の（D）の代表的な画像とBモードとパワードップラー（赤）との拡大（E）、頸部リンパ節。点線は、個々のリンパ節の概要を説明します。スケールバー= 0.5ミリメートル。 <img alt="図4" sRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 52718 / 52718fig4.jpg&quot; /&gt; 図4：頸部リンパ節生検のセットアップ、イメージング、生検材料のサイトスピン分析（A）マウスの首に近いマイクロインジェクター、針の配置を示すイメージングプラットフォーム。広いマイクロチューブラック（オレンジ色のブロック）は、わずかにまだ3D-モータステージのためのスペースを可能にしながら、適切な針の配置を可能にする、プラットフォームを上昇させるために使用されます。この配置は、各マウスについてモータステージを削除かかる時間を最小限に抑えることができます。 （B - D）50 MHzのトランスデューサを使用して、頸部リンパ節生検のビデオから採取した全ネックHFUSイメージ。 （B）生検の前に首の側に位置する針を示すHFUS Bモード画像を表示します。針の先端はちょうど針の軌跡を示すために撮像中に重畳されたニードルガイドの位置（緑の点線）以下の高エコー構造です。リンパ節は、中央にあります画像。スケールバー= 1ミリメートル。リンパ節へ（C）針エントリ。頸部リンパ節の（D）生検。頸部リンパ節の（E）にズーム生検。スケールバー= 0.5ミリメートル。成功した生検を確認する代表的な生検リンパ材料の（F）サイトスピン分析。スケールバー=100μmです。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52718/52718fig5.jpg" /> 図5：リンパ節の3D頸部リンパ節画像のコンピューター分析（A）代表的なスクリーンショットは、コンピュータソフトウェアを用いて解析しました。ノードは青で外接します。示されるように、解析結果は、3Dボリュームとパーセント血管分布（PV）を示します。 （B）は、3D解析後の同じノードの表面ビュー画像。 Aで行われた測定に基づいて、リンパ節のボリューム全体をレンダリングします。

このプロトコルは、イメージングマウス頸部リンパ節のための高周波超音波（HFUS）の適用を説明しています。この技術は、頸部リンパ節の形態、量および血流の可視化及び定量化を最適化します。頸部リンパ節および組織学的評価のためのリンパ組織の処理の画像誘導生検も実証されています。

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

この手順の全体的な目的は、高周波超音波を用いてマウスの頸部リンパ節を可視化し、画像誘導下超音波を用いてリンパ節生検を行うことです。まず、麻酔をかけたマウスを加熱イメージングプラットフォーム上に仰臥位で配置し、イメージングに向けた動物固有の必要な準備ステップをすべて行います。次に、マウスの頸部領域の高周波超音波イメージングを行い、頸部リンパ節を特定および可視化します。次に、目的とする頸部リンパ節に対して画像誘導下生検を行います。最終的に、高周波超音波イメージングを用いてマウスの頸部リンパ節を解析し、さまざまなマウスモデルでの経時的なモニタリングを通じて、正常および病理学的な変化を同定・定量化します。マウスのセットアップと生検の手順には、適切に遂行するためにかなりの詳細さと精度が求められるため、本手法を視覚的に提示することが極めて重要です。私たちは、マウスの舌腫瘍の形成をモニタリングするために高周波超音波を用いた際に、初めてこの手法を考案しました。その後、この手法を応用すれば、関連する頸部リンパ節の変化を同時にモニタリングできることに気づきました。この手法は、マウスの頸部リンパ節におけるがんに関連した変化についての知見を提供することが可能です。本手法は、細菌感染や自己免疫疾患などの他のマウスモデルシステムにおける頸部リンパ節腫大のモニタリングにも利用可能です。準備として、イメージングプラットフォームを40°Cに予熱し、そこから数度以内の範囲で維持するように計画してください。マウスを麻酔後、イメージングプラットフォームの上に仰臥位で配置します。次に、定常状態の鎮静を維持するためにノーズコーンを装着します。その後、足指へのピンチテストで麻酔状態を確認し、眼に眼軟膏を塗布します。続いて、テープとゲルを用いて、足をECGに固定します。次のステップとして、潤滑剤を塗布した直腸温度プローブを挿入し、マウスの体温を36.9 °Cから2度以内の範囲に維持します。最後に、除毛クリームを使用して、頸部およびその他の部位の被毛を除去します。その後、水に浸したガーゼでクリームと被毛を洗い流します。まず、気泡が入らないように注意しながら、頸部に温めた超音波ジェルをたっぷりと塗布します。超音波ジェルを十分に塗布することで、トランスデューサが皮膚を引っ張るのを防ぎ、画像精度を高めることができます。次に、イメージングプラットフォームに角度をつけてマウスの頭部をわずかに高くします。これにより、マウスの呼吸数が改善されます。その後、40 MHzのトランスデューサーをマウンティングシステムに横方向に配置し、スキャンヘッドの前面がゲルに接するまで慎重に下げます。ソフトウェア制御を用いて操作し、呼吸を妨げるような過度な圧力をかけないようにしてください。輝度モードの設定を次のように調整します。ゲインを22 decibelsに設定します。深度を10.00 millimetersに、幅を14.08 millimetersに設定します。ここを出発点とします。Bモード画像において頸部の両側が均等に見えるように、イメージングプラットフォームの傾斜を調整してください。次に、リンパ節をイメージングするために、Y軸を使用して、頸部を頭側から尾側に向かって胸部領域へとスキャンします。x軸を使用して画像を中央に配置します。口腔、舌、甲状腺などの主要なランドマークを特定します。次に、甲状腺から口腔・舌領域に至る首全体の3D皮膚を用いて、リンパ節のマッピングを行います。Y軸に沿って確認します。舌、口腔、および甲状腺の数値上の位置に注目し、その差を求めることで頸部の長さを算出してください。その後、算出した頸部の中点にトランスデューサーを配置します。中心を合わせた後、「3D」を押し、計算した頸部の長さをスキャン距離として入力します。3Dステップサイズを0.076 millimetersに設定します。次に「scan」を押し、頸部領域全体の画像シリーズスタックを取得します。マウスの高さを上げるには、より高いプラットフォームを使用するか、プラスチック製のマイクロ遠心チューブラックを用いてプラットフォームを高くしてください。まず、生検に用いるために視認できる最大サイズのリンパ節を選択し、50 MHzトランスデューサを用いてその高周波超音波画像を維持します。選択したリンパ節は10 mm³以上である必要があります。それ以下の場合、生検の実施または採取が非常に困難になります。次に、1 mLシリンジに27ゲージの1/2インチ針を取り付け、シリンジホルダーにセットします。針を頸部に対して垂直に配置し、テキストプロトコルに従って生検用の画像を調整します。次に、針の先端が見え、皮膚に接触するまでニードルホルダーを調整します。その後、針をしっかりと素早く押し込んで皮膚を穿刺し、先端が被膜を貫通して生検中のmagula内に見えるまで針をさらに進めます。皮膚を穿刺するためには、針を素早く刺入することが重要です。その後、一度短く停止し、再び素早く刺入してリンパ節被膜を穿刺します。針がリンパ節に入ったら、プランジャーをゆっくりと引き、200から300 µLの目盛りの間まで戻します。生検検体は通常、針の中に留まっているため、シリンダー内では確認できません。そこで、マウスからゆっくりと針を抜き、内容物を1.5 milliliterのマイクロ遠心チューブに排出します。シリンダーから針を外し、それもチューブに入れます。次に、1 mLの生検用培地をシリンジに充填します。針を再装着し、処置後に生検検体をチューブ内に排出してください。超音波ソフトウェア上でマウスが完全に活動状態になるまで、必ず観察してください。解析する画像を選択し、画像処理タブに移動するために「load into 3D」を選択します。次に、左上にある「3D reconstructed image」を選択し、「display single pane」をクリックします。必要に応じて、ズーム機能を使用して画像を拡大してください。次に、表示レイアウトボタンを切り替えて画像をBモードで表示し、パワードプラのオーバーレイ表示を解除します。これにより、後続の3D解析においてリンパ節の輪郭が確認しやすくなります。画像シリーズをスクロールしてリンパ節の始点を探し、リンパ節を囲んで指定します。3D設定タブに移動し、「volume」を選択します。次に、「parallel」の隣にあるスタートボタンを選択し、スクロールしながら、個々の画像内の関心領域を囲む輪郭線を描きます。リンパ節全体がマークされるまで、十分な数の画像に対してこの操作を繰り返します。次に [finish] を選択して解析を完了します。画像の下部に、3Dボリュームと血管密度（percent vascularity）が自動的に表示されます。続いて、表示レイアウトボタンを切り替えて、表面上のパワードップラー画像のオーバーレイを確認します。関心領域のボリュームエリアをネットビューで観察します。最終的に、画像はTIF形式でエクスポートするか、記述されたプロトコルに従って3DスキャンをVIムービーとしてエクスポートします。リアルタイム高周波超音波イメージングにより、臨床現場で行われているものと同様に、頸部リンパ節のガイド下細針生検が可能となりました。BMO超音波ガイド下グラフトにより、生検前の理想的な針の配置が示されました。超音波画像を用いて針先を頸部リンパ節内に導入し、生検Cの間も超音波画像で針の位置を誘導しました。生検検体はシトシンを用いて処理されました。豊富なリンパ球クラスターと関連する結合組織が認められ、リンパ節生検が成功したことが確認されました。高周波超音波画像のコンピュータ解析により、パワードップラーモードおよび3Dボリューム測定を用いて、リンパ節の構造、体積、および血流に関する情報を得ました。また、血管分布率を算出しました。さらに、3Dイメージングによりリンパ節の仮想的な再構築が可能となり、習熟すればリンパ節全体のトポグラフィーを明らかにすることができます。この手法は適切に行えば、マウス1匹あたり約15分で完了します。このビデオを視聴することで、高周波超音波を用いてマウスの頸部リンパ節を特定する方法を十分に理解し、画像ガイド下超音波を用いてリンパ節生検を行う方法についての知識を習得できるはずです。

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マウス子宮頸部リンパ節の高周波超音波イメージング

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