乳癌細胞における腫瘍形成の阻害剤を同定するための軟寒天コロニー形成アッセイの活用

ここでは、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ(PADI)酵素阻害剤であるBB-Cl-アミジンがin vitroで乳がんの腫瘍形成性に及ぼす影響をテストするための軟寒天コロニー形成アッセイの使用を文書化しています。

この手順の全体的な目標は、半固体マトリックス内で増殖する細胞の能力に対する治療の影響を定量的に決定することです。これは、強化された能力が細胞腫瘍の遺伝子性の特徴であるため、ソフト寒天アッセイを使用して腫瘍の遺伝子性は、半固体のAROSゲル内でコロニーを形成する細胞の能力を通じて測定されます。この環境では、形質転換されていない細胞は急速に増殖できないため、まず0.6%AROS最下層を作ることで半固体のAROSゲルを構築します。次に、0.3%AROSゲル層を含むセルを最下層の上に加えます。

このアッセイでは、実験細胞をDr.Subramanianが開発したペプチジル、アルギニン、ダーゼ、またはパッド酵素の阻害剤で処理します。毎週、追加の供給層が追加されますが、これは処理の有無にかかわらず0.3%アロスゲルです。最後のステップは、分析のために70マイクロメートルを超えるコロニーの数を数えることです。

最終的に、倒立顕微鏡法を使用して、対照群と治療群の間のコロニー数の違いを示します。こんにちは、私の名前はAchi Hutaです。私は、ベーカー動物衛生研究所のスコット・クロス博士研究室の大学院生です。

コーネル大学では、ソフトタイガーコロニー形成アッセイは、薬物、ホルモン、およびその他の多数の治療条件に対する感受性に関して、広範囲のがん細胞の腫瘍性を評価するなど、がん生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手順は、清潔で乾燥した100ミリリットルのガラス瓶に3%2のヒドロキシエチルアロスを準備することから始めます。0.9グラムの2つのヒドロキシエチルアロスを加え、続いて30ミリリットルの蒸留水を加えます。

混合物を15秒間電子レンジで加熱し、静かに渦巻きます。アロスパウダーが完全に溶解するまで、この手順を繰り返します。次に、ボトルを含む溶液を15分間オートクレーブします。

アグロス溶液を室温まで冷まします。さらに、摂氏37度のインキュベーターで5ミリリットルと10ミリリットルのピペットを数個プレウォームして、ピペット内でアロスが固まるのを防ぎます。部分的に取り扱う場合は、ボトルの蓋を緩め、既製の3%2ヒドロキシエチルaro溶液を15秒間電子レンジで加熱します。

次に、溶液を静かに渦巻き、さらに15秒間電子レンジで加熱します。ARO溶液を渦巻くときは、空気にさらされると溶液が浮き上がり、ボトルマイクロ波に固体ゲルが残っているとこぼれる可能性があるため、注意してください。さらに数秒間、次のステップでARO溶液が入ったボトルを摂氏45度の水浴に保管して、アグロ溶液が早期に固まるのを防ぎます。

次に、Prewarmピペットを使用して12ミリリットルの温めた培地を滅菌済みの50ミリリットルの円錐管に移します。すぐに3ミリリットルの3%アロス溶液を加え、円錐形のチューブを静かに反転させてアロスを培地と混合します。次に、この混合物の2ミリリットルを、気泡を形成せずに6ウェル培養プレートの各ウェルに静かに加えます。

6ウェル培養プレートを4°Cの平らな面に水平に1時間インキュベートし、混合物が固化します。混合物が固まったら、プレートを摂氏37度のインキュベーターに30分間入れます。これで、最下層を使用する準備が整いました。

この手順の難しい側面は、すべての細胞が均等に分布し、溶けたアグラシェルが各ウェルに添加する前に固まらないようにして、液体アグリゲルを追加する前にセルツが培地で混合されていることを確認することです。さらに、パイプは、取り扱い中に溶液が固まるのを避けるために、事前に予温されています。層を最初にトリプシン目MCF 10 DCIS細胞を含み、それらを40、000細胞/ミリリットルの細胞濃度に希釈し、次に予熱ピペットを使用して8ミリリットルの培地を取り、滅菌済みの50ミリリットルの円錐管に移すために調製します。

すぐに2ミリリットルの3%アロスを円錐形のチューブに加え、穏やかに反転させてアロを培地と混合します。気泡の形成は避けてください。次に、細胞の2ミリリットルを取り、それらをDMSOまたはDMSO単独の2マイクロモルBBクロラミンで処理し、処理後のコントロールとして、細胞を0.6%arosと1対1の希釈で混合して、最終濃度を1マイクロモルBBクロラミンにします。

次に、1ミリリットルの細胞アロス混合物を取り、6ウェル培養プレートの最下層に静かに加えます。6ウェル培養プレートを4°Cの平らな面に水平に少なくとも15分間置き、最上層が固化するまで待ちます。混合物が固まったら、プレートを摂氏37度のインキュベーターに1週間入れてから、供給層を追加します。

前と同じように既製の3%twoヒドロキシエチルaro溶液を電子レンジで加熱し、摂氏45度の水浴でアグロ溶液ボトルを平衡化することにより、供給層の準備を開始します。3%アグロ溶液1ミリリットルと9ミリリットルの温かい媒体を50ミリリットルの円錐管に混合し、穏やかに反転させてarosを培地と混合します。気泡の形成を避けてください。混合物をBBクロラミンで処理した後、底部と軟層を含む6ウェル培養プレートの各ウェルに1ミリリットルの混合物を穏やかに加えます。

次に、6ウェル培養プレートを摂氏4度の平らな面に水平に少なくとも15分間置き、混合物が固化するまで待ちます。フィーダー層が固まったら、プレートを摂氏37度のインキュベーターに入れます。Baderは、コロニー形成が観察されるまで、既存のフィーダー層に1ミリリットルの0.3%agros培地処理溶液を重ねて、細胞に新しい培地を補充することにより、この給餌手順を毎週繰り返します。

軟寒天培地での細胞増殖の2週間半後、各ウェルのコロニー数をカウントします。光学顕微鏡を使用して定量を容易にし、グリッドを透明体に印刷し、グリッドを6ウェルプレートに取り付けて、カウント中に細胞がどこにあるかを特定するのに役立ちます。コロニーサイズは、各コロニーの直径によって定量化され、どのコロニーがスコアリングされるかを決定するための参照コロニーサイズを事前に定義します。

例えば、ここでは、70マイクロメートル以上のコロニーサイズがデータ解析に含まれています。カウント後、6ウェル培養プレートをパラフォームで密封し、ゲルの乾燥を防ぎます。サンプルは摂氏4度で保存して、さらなるコロニー形成を防ぎ、将来のカウントに備えます。

この結果は、BBクロラミンがパッド阻害剤の存在下でMC10 DCIS細胞由来コロニーの形成を有意に阻害することを示しています。DMSOコントロールと比較すると、コロニー形成とコロニーサイズの両方に縮小が見られました。BBクロラミン処理MCF 10 DCIS細胞のコロニーサイズは、主に20〜100マイクロメートルの範囲でした。

DMSOコントロールのコロニーのサイズは70〜150マイクロメートルの広い範囲を示しましたが、2週間半の成長後、70マイクロメートルを超えるコロニーをカウントして分析しました。DMSOコントロールには平均約3,500コロニーがありましたが、BBクロラミン処理グループには約2,000コロニーしか見られませんでした。2週間半の軟農療法の後、これは1マイクロモルのBBクロラミンの存在下での平均コロニー形成の44%の減少を表し、パッド阻害剤による乳がん細胞の腫瘍形成の有意な阻害を示しています。

この手順を試みるときは、取り扱い時に溶液が固まらないように、すべての試薬と機器を事前に温めることに留意することが重要です。