Name: 乳癌細胞における腫瘍形成の阻害剤を同定するための軟寒天コロニー形成アッセイの活用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: 学ぶ軟寒天コロニー形成アッセイによる乳癌細胞の腫瘍形成評価法。PADI酵素阻害剤BB-Cl-amidineの効果を定量的に測定し、細胞の半固体マトリックス内増殖能力を解析する手法を解説します。

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技術的なアドバイスを提供してくださったコーネル大学のRichard Cerione博士、Marc Antonyak博士、Kelly Sullivan氏、そしてオリンパスの倒立顕微鏡を共有してくださったコーネル大学のGerlinde Van de Walle博士に感謝します。

3％の2-ヒドロキシエチルアガロースの調製<ol><li>清浄な乾燥した100mlのガラス瓶に、2-ヒドロキシエチル0.9gのアガロースを添加（アガロースVII）を蒸留水30mlに続きます。 </li><li>電子レンジ15秒間混合し、穏やかに渦巻きます。アガロース粉末が完全に溶解するまで、この手順を少なくとも3回繰り返します。 </li><li> 15分間この溶液を含むボトルをオートクレーブ。 </li><li>アガロース溶液は、さらに、使用前に室温まで冷却します。この溶液を室温で保管してください。 </li></ol>底層の調製：0.6％アガロースゲル<ol><li>取り扱いの際にピペットで固化からアガロースを防止するために、37℃のインキュベーターで事前に暖かい、いくつかの5ミリリットルと10ミリリットルピペット。 </li><li>部分的にボトルの蓋や電子レンジで15秒のための前作られた3％の2-ヒドロキシエチルアガロース溶液を緩めます。そして、静かに別の15秒のためのソリューション、電子レンジが渦巻きます。注意：agaroを旋回するときは注意してくださいSEソリューションソリューションは、空気にさらされると波及することができたときに上昇するためです。 </li><li>ボトル内の残留固体ゲル、さらに数秒間マイクロ波が存在する場合。 </li><li>途中で固化からアガロース溶液を防止するために、次のステップの間に45℃の水浴中でアガロース溶液の入ったボトルを保管してください。 </li><li> 37℃の水浴中で暖かいMCF10DCIS媒体。注：MCF10DCISメディアはDMEM / F12、5％ウマ血清、5％のペニシリンストレプトマイシンから成ります。 </li><li>転送滅菌50mlコニカルチューブに予め温めたピペットを用いて、3％アガロース溶液3ml。 </li><li>すぐに暖かいMCF10DCISメディアの12ミリリットルを加え、穏やかにメディアとアガロースを混合するためにコニカルチューブを反転。それは後にコロニー計数を妨害するように気泡を形成しないようにしてください。 </li><li>ゆっくりと気泡を形成することなく、6ウェル培養プレートの各ウェルにこの混合物を2mlを加えます。 </li><li> 6ウェル培養プレートのhorizo​​ntaをインキュベートLLY 1時間4℃で平らな面には、混合物が固化することを可能にします。 </li><li>混合物が固化した後、30分間37℃のインキュベーターにプレートを配置します。底層が使用できるようになりました。 </li></ol>細胞を含有する層の調製：0.3％アガロースゲル<ol><li>トリプシン処理MCF10DCIS細胞および4×10 4 / mlの細胞濃度になるように、それらを希釈します。 </li><li>予め温めたピペットを用いて、3％アガロースの2ミリリットルを取り、滅菌50mlコニカルチューブに移します。 </li><li>すぐにコニカルチューブにMCF10DCISメディアの8ミリリットルを加え、穏やかにメディアとアガロースを混合することが反転します。任意の気泡を形成することは避けてください。 </li><li> MCF10DCIS細胞（4×10 4 / ml）を2ミリリットルを取り、BB-CLA（0μM（DMSO）または1μM）で処理します。 </li><li> 1：1希釈、0.6％アガロースで細胞を混ぜます。 </li><li>細胞 - アガロース混合物の1ミリリットルを取り、静かに6ウェル培養pの底層の上に追加します後期（2×10 4細胞/ ml）。 </li><li>上層が固化することを可能にするために、少なくとも15分間、4℃で平坦な面に水平に6ウェル培養プレートに置き。 </li><li>混合物が固化した後、給電層を追加する前の週の37℃のインキュベーターにプレートを配置します。 </li></ol>フィーダー層の4製造：0.3％アガロースゲル<ol><li>電子レンジ15秒あらかじめ用意された3％の2-ヒドロキシエチルアガロース溶液。静かに別の15秒のためのソリューション、電子レンジが渦巻きます。 </li><li> 45℃の水浴中でアガロース溶液のボトルを平衡化します。 </li><li> 37℃の水浴中でMCF10DCIS媒体を温めます。 </li><li> 50mlコニカルチューブに暖かいMCF10DCISメディアの9ミリリットルで3％アガロース溶液1mlを混合し、穏やかにメディアとアガロースを混合するために反転します。気泡を形成することは避けてください。 </li><li> BB-CLA（0μM（DMSO）または1μM）との混合物を扱います。 </li><li>静か用なし（この混合物の1ミリリットルを追加明は、底部とソフト層を含む6ウェル培養プレートの各ウェルに）泡。 </li><li>混合物を固化することを可能にするために、少なくとも15分間、4℃で平坦な面に水平に6ウェル培養プレートに置き。 </li><li>フィーダー層が固化した後、37℃のインキュベーターにプレートを配置します。 </li><li>コロニー形成が観察されるまで、新しいメディアで細胞を補充するために、既存のフィーダー層の上に、0.3％アガロース/中/処理溶液の1ミリリットルを重ねることによって、この給紙手順を毎週繰り返します。注：柔らかくフィーダー層で寒天は非常に柔らかく、従って、フィーダー層からの追加の栄養素が容易に細胞に到達するために、細胞を含有する層中に拡散しています。 </li></ol> 5.データ収集<ol><li>軟寒天における細胞成長の2.5週間後、光学顕微鏡を用いて、各ウェル中のコロニーの数を数えます。定量化を容易にするために、透明性の上にグリッドを印刷しにグリッドを添付6ウェルプレートは、細胞がカウント中にある場所を特定するのに役立ちます。 （各コロニーの直径によって定量化されるように）、コロニーサイズが異なりますので、採点されるコロニーを判断するための基準コロニーサイズを事前に定義。例えば、70ミクロン以下のデータ分析が大きいのコロニーの大きさがあります。 </li><li>さらにコロニー形成を防止し、将来のカウントのために4℃でサンプルを保管してください。乾燥からゲルを防ぐためにパラフィルムで6ウェル培養プレートをシール。 </li></ol>

<ol><li>Hamburger, A. W., Salmon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+bioassay+of+human+tumor+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Primary bioassay of human tumor stem cells.</a> Science. 197, 461-463 (1977).</li>
<li>Wang, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signaling+regulating+anchorage-independent+growth+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mt+Sinai+J+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular signaling regulating anchorage-independent growth of cancer cells.</a> Mt Sinai J Med. 71 (6), 361-367 (2004).</li>
<li>Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD%2C+a+growing+family+of+citrullinating+enzymes%3A+genes%2C+features+and+involvement+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease.</a> Bioessays. 25 (11), 1106-1118 (2003).</li>
<li>Horibata, S., Coonrod, S. A., Cherrington, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+peptidylarginine+deiminase+enzymes+in+disease+and+female+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Role for peptidylarginine deiminase enzymes in disease and female reproduction.</a> J Reprod Dev. 58 (3), 274-282 (2012).</li>
<li>Mohanan, S., Cherrington, B. D., Horibata, S., McElwee, J. L., Thompson, P. R., Coonrod, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+role+of+peptidylarginine+deiminase+enzymes+and+protein+citrullination+in+cancer+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Potential role of peptidylarginine deiminase enzymes and protein citrullination in cancer pathogenesis.</a> Biochem Res Int. , 895343(2012).</li>
<li>McElwee, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+PADI2+as+a+potential+breast+cancer+biomarker+and+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Identification of PADI2 as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target.</a> BMC Cancer. 12, 500(2012).</li>
<li>Knight, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidylarginine+deiminase+inhibition+disrupts+NET+formation+and+protects+against+kidney%2C+skin+and+vascular+disease+in+lupus-prone+MRL%2Flpr+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">Peptidylarginine deiminase inhibition disrupts NET formation and protects against kidney, skin and vascular disease in lupus-prone MRL/lpr mice.</a> Ann Rheum Dis. , 1-8 (2014).</li>
<li>Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MCF10DCIS.com+xenograft+model+of+human+comedo+ductal+carcinoma+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ.</a> J Natl cancer Inst. 92, 1185-1186 (2000).</li>
<li>Fan, D., Morgan, L. R., Schneider, C., Blank, H., Fan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+evaluation+of+human+tumor+chemosensitivity+in+the+soft-agar+assay+and+its+clinical+correlations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer+Res+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cooperative evaluation of human tumor chemosensitivity in the soft-agar assay and its clinical correlations.</a> J Cancer Res Clin Oncol. 109, 23-28 (2000).</li>
<li>Hamburger, A. W., White, C. P., Dunn, F. E., Citron, M. L., Hummel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+human+tumor+colony+growth+in+soft+agar+by+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cell+Cloning%22%5BJournal%5D)">Modulation of human tumor colony growth in soft agar by serum.</a> Int J Cell Cloning. 1 (4), 216-229 (1983).</li>
<li>Anderson, S. N., Towne, D. L., Burns, D. J., Warrior, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+soft+agar+assay+for+identification+of+anticancer+compound%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A high-throughput soft agar assay for identification of anticancer compound.</a> J Biomol Screen. 12, 938-945 (2007).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

軟寒天におけるコロニー形成の速度は、細胞型9によって異なり。したがって、細胞の数を最適化し、それに応じて調整されるべきで開始します。提案さ始動範囲は6ウェルプレートを使用してあたり4×10 2〜1×10 5細胞の間です。また、コロニーの大きさは、各細胞の増殖速度に応じて変化します。そのため、コロニーの大きさのために事前に定義されたカットオフは、下流定量分析のための個々のコロニーに注釈を付けるために必要とされます。ここでは、70ミクロンは最初のプレーティング由来の非増殖細胞の混入を避けるために、定量化されたよりも大きなコロニー。 3Dアガロースゲルを製造する際に最適な成長のために、それは、通常、2次元細胞培養に使用される同一の細胞培養培地を使用することが望ましいです。しばしば回培地を交換することは、したがって、細胞が新しい培地に適応できるようにする追加の継代を必要とする、細胞の増殖速度を変化させるためです。例えば、MCF10DCIS細胞は、RPMI-1640、DMEM、またはDMEM / F12培地中で最適に増殖させることができます。 M...

非形質転換(正常)細胞と形質転換細胞の両方が、2D単層培養で容易に増殖することができます。この形態の接着性細胞増殖は、分裂促進刺激がない場合、細胞が微小環境内で急速に分裂しないことが多いin vivoで起こるものとはまったく異なります。一方、軟寒天アッセイは、半固体アガロースゲル1内の懸濁液中で細胞が増殖してコロニーを形成する能力を測定することにより、腫瘍原性を定量化するため、2D培養システムとは異なります。この設定では、形質転換されていない細胞は、細胞外マトリックス(ECM)への固定がないと急速に増殖することができず、アポトーシス(アノイキスとして知られるプロセス)を受けることができません。対照的に、悪性形質転換を受けた細胞は、ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ(PI3K)/AktやRac/Cdc42/PAKなどのシグナル伝達経路の活性化により、足場依存性を失います。したがって、これらの細胞は、半固体の軟寒天マトリックス2内で増殖し、コロニーを形成することができる。
軟寒天アッセイの一般的な使用法は、PADI阻害剤などの特定の化合物がin vitroで腫瘍の成長を抑制できるかどうかをテストすることです。一般に、コロニー数またはコロニーサイズは、アッセイからの定量的な読み出しであり、対照群と治療群の間で比較して、細胞腫瘍形成性の違いを評価できます。したがって、コロニー形成が薬物濃度の増加と逆相関していることがわかれば、その薬物はin vitroでの腫瘍原性の効果的な阻害剤であるという結論を導き出すことができます。一方、薬物がコロニー形成に影響を及ぼさない場合、その薬物は適切な投与量でないか、または有効な腫瘍形成阻害剤ではありません。このアッセイは、ソフト寒天アッセイを使用して薬物の抗腫瘍効果をテストするだけでなく、特定の遺伝子と腫瘍形成との関係を調べるためにも使用できます。例えば、PADI2の発現を抑制する腫瘍形成性への影響は、PADI2特異的なsiRNA処理によって対処することができます。
PADIsは、シトルリン化または脱イミン化として知られるプロセスで、正に帯電したアルギニン残基を中性に帯電したシトルリンに変換することにより、タンパク質を翻訳後修飾するカルシウム依存性酵素です3-5。私たちは最近、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ2(PADI2)が新規の乳がんバイオマーカーとして機能する可能性があること、およびPADI阻害剤が早期乳がんの候補となる治療法であることを発見しました6。例えば、我々は以前に、「pan-PADI」阻害剤であるCl-アミジンが2次元単分子膜を用いて乳がん細胞の増殖を抑制し、この阻害剤が3次元腫瘍スフェロイドの増殖を抑制することを実証した6。このレポートでは、これらの研究を拡張し、新しいPADI阻害剤であるBB-CLAがMCF10DCIS乳がんコロニーの増殖を抑制する有効性をテストすることにより、軟寒天アッセイの有用性を強調します7。この実験にMCF10DCIS細胞を使用したのは、それらが非形質転換ヒトMCF10A細胞の発がん性誘導体であり、PADI2タンパク質8の定常状態レベルが高いためです。私たちは、PADI2酵素活性がこの細胞株の腫瘍形成性に重要な役割を果たしており、BB-CLAを介したPADI2活性の阻害が癌の進行を抑制するという仮説を立てています。

<table><tbody><tr><td>ツァイス Axiopot</td><td>カール ツァイス 顕微鏡</td><td>1021859251</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>ロンザ BioWhittaker</td><td>12-719F</td><td></td></tr><tr><td>HyClone ドナー 馬血清</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>SH30074.03</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン</td><td>ライフ テクノロジー</td><td>ズ 15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2-ヒドロキシエチルアガロース:タイプVII、低ゲル化温度</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39346-81-1</td><td></td></tr></tbody></table>

乳癌細胞における腫瘍形成の阻害剤を同定するための軟寒天コロニー形成アッセイの活用

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

>jove_content<生体内での腫瘍進行のメカニズムを調査することの本質的な困難さを考えると、半固体マトリックス中で細胞が増殖する能力を測定する軟寒天コロニー形成アッセイ(以下、軟寒天アッセイと呼ぶ)のような細胞ベースのアッセイは、依然として癌研究の特徴です。この手法が従来の2D単層または3Dスフェロイド細胞培養アッセイと比較した場合の主な利点は、3D細胞環境がin vivoで見られる環境とほぼ同じであることです。重要なことに、軟寒天アッセイは、新規化合物や治療条件が細胞の増殖と遊走に及ぼす影響を厳密に試験するための理想的なツールも提供します。さらに、このアッセイは、遺伝的摂動の文脈における細胞形質転換の可能性を定量的に評価することを可能にします。私たちは最近、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ2(PADI2)を潜在的な乳がんバイオマーカーおよび治療標的として特定しました。ここでは、PADI阻害剤であるBB-Cl-アミジン(BB-CLA)がヒト上皮内がん(MCF10DCIS)細胞の腫瘍原性に及ぼす影響を試験することにより、前臨床の抗がん研究における軟寒天アッセイの有用性を強調します。

軟寒天コロニー形成アッセイは、癌細胞の腫瘍形成能を記録幅広い用途に使用することができます。この手法の主な利点は、半固体マトリックスが選択的足場に依存しない方法で増殖できる細胞の増殖に有利に働くということです。この特性は、主に癌細胞によってではなく、正常細胞によって示されます。我々は、主に薬剤による腫瘍増殖阻害の有効性を試験するために、この技術を使用して、乳癌細胞の腫瘍形成能にPADI遺伝子を含む目的の我々の遺伝子の過剰発現または枯渇の効果を試験します。ここでは、PADI2過剰発現MCF10DCIS細胞（図1及び2）の腫瘍形成阻害に対するBB-CLAの効果を評価しました。 結果は、BB-CLAが有意MCF10DCIS細胞由来のコロニーの形成を阻害することを実証する。3図は 、そのPADI阻害剤の存在下で、T<html> DMSO対照と比較した場合、ここで両方のコロニー形成及びコロニーサイズの減少がありました。 [注：BB-CLA DMSOに溶解し、従って、DMSOを対照として使用した。】BB-CLAはDMSOためのコ...

ここでは、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ(PADI)酵素阻害剤であるBB-Cl-アミジンがin vitroで乳がんの腫瘍形成性に及ぼす影響をテストするための軟寒天コロニー形成アッセイの使用を文書化しています。

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

この手順の全体的な目的は、半固形マトリックス中での細胞増殖能に対する処理の影響を定量的に決定することです。増殖能の向上は細胞の腫瘍原性の特徴であり、ソフトアガーアッセイを用いて測定されます。腫瘍原性は、半固形AROSゲル内でのコロニー形成能を通じて評価されます。非形質転換細胞はこの環境で急速に増殖できないため、半固形AROSゲルは、まず0.6% AROSの下層を作成し、次にその上層に細胞を含む0.3% AROSゲル層を追加して構築します。このアッセイでは、実験用細胞をSubramanian博士が開発したペプチジルアルギニンアミダーゼ（PAD）酵素の阻害剤で処理します。毎週、処理ありまたはなしの0.3%アガロースゲルによる追加のフィーディングレイヤーを添加します。最終ステップとして、解析のために70 µmより大きいコロニー数をカウントします。最終的に、倒立顕微鏡を用いて、コントロール群と処理群の間でのコロニー数の違いを示します。こんにちは、Achi Hutaです。私はBaker Institute for Animal HealthのDr.Scott Krosの研究室に所属する大学院生です。コーネル大学では、ソフトタイガーコロニー形成アッセイを用いて、薬剤やホルモン、およびその他多数の治療条件に対する感受性に関する広範ながん細胞の腫瘍形成能の評価など、がん生物学分野における重要な疑問の解明に役立てることができます。まず、清潔で乾燥した100 milliliterのガラス瓶に3% 2-hydroxyethyl agaroseを調製することからこの手順を開始します。0.9 gramsの2-hydroxyethyl agaroseを加え、続いて30 millilitersの蒸留水を加えます。混合物を電子レンジで15秒間加熱し、静かに撹拌します。AROS粉末が完全に溶解するまでこの操作を繰り返します。次に、溶液が入ったボトルを15分間オートクレーブで滅菌します。アガロース溶液を室温まで冷却させます。次に、アガロースがピペット内で凝固するのを防ぐため、5 mLおよび10 mLのピペットを数本、37 °Cのインキュベーターで予熱しておきます。使用する際は、ボトルの蓋を緩め、あらかじめ調製した3% 2-HYDROXYETHYL アガロース溶液を電子レンジで15秒間加熱します。次に、溶液を静かに回し混ぜ、さらに15秒間電子レンジで加熱します。ARO溶液を回し混ぜる際は、空気に触れると溶液が上昇し、ボトル内に未溶解のゲルが残っていると溢れ出す可能性があるため注意してください。また、次のステップに進む間、ARO溶液を入れたボトルを45 °Cのウォーターバスに数秒間保持し、溶液が早すぎるタイミングで凝固するのを防ぎます。次に、プレウォームしたピペットを使用して、加温した培地 12 milliliters を滅菌済みの 50 milliliter コニカルチューブに移します。直ちに 3%aros 溶液 3 milliliters を加え、コニカルチューブを静かに転倒混和して aros と培地を混ぜ合わせます。その後、この混合液 2 milliliters を、気泡が入らないように 6 ウェル培養プレートの各ウェルに静かに分注します。混合物を凝固させるため、6ウェル培養プレートを平らな表面に水平に置き、4 °Cで1時間インキュベートします。混合物の凝固後、プレートを37 °Cのインキュベーターに30分間入れます。これで下層の準備が完了しました。この手順における困難な点は、すべての細胞が均等に分散していることを確認すること、および溶融したagar shellが各ウェルへの添加前に凝固しないようにし、液体agri gelを加える前にseltzが培地中で混合されるようにすることです。さらに、操作中に溶液が凝固するのを防ぐため、ピペットはあらかじめ予熱しておきます。細胞含有層を調製するには、まずMCF 10 DCIS細胞をトリプシン処理し、細胞濃度を40,000 cells/mLに希釈します。次に、予熱したピペットを用いて培地を8 mL分取り、滅菌済みの50 mLコニカルチューブに移します。3% aros 2 mLを速やかにコニカルチューブに加え、緩やかに転倒混和してarosと培地を混ぜ合わせます。この際、気泡が入らないように注意してください。次に、細胞懸濁液 2 mLを分取し、2 µM BB chloramine (DMSO溶液) またはコントロールとしてDMSOのみで処理します。処理後、細胞を0.6% arosと1:1の比率で希釈し、BB chloramineの最終濃度を1 µMにします。次に、細胞とアガロースの混合液を1 mL取り、6ウェル培養プレートの下層に静かに加えます。上層を凝固させるため、6ウェル培養プレートを4 °Cの平らな面に水平に置き、少なくとも15分間静置します。混合液が凝固した後、プレートを37 °Cのインキュベーターに入れ、1週間置いてからフィーダー層を加えます。あらかじめ調製しておいた3% 2-ヒドロキシエチルアグロ溶液を従来通り電子レンジで加熱し、アグロ溶液のボトルを45 °Cのウォーターバスで平衡化させてから、フィーディング層の調製を開始します。3%アグロ溶液 1 mLを温めた培地 9 mLと共に50 mLコニカルチューブに入れ、静かに転倒混和してアグロ溶液と培地を混ぜ合わせます。この際、気泡が形成されないように注意してください。混合物をBBクロラミンで処理した後、ボトム層とソフト層を含む6ウェル培養プレートの各ウェルに、混合物を1 mLずつ静かに加えます。次に、混合物を凝固させるため、6ウェル培養プレートを4 °Cの平らな面に水平に置き、少なくとも15分間保持します。フィーダー層が凝固した後、プレートを37 °Cのインキュベーターに入れます。その後、コロニー形成が観察されるまで、既存のフィーダー層の上に0.3%agros培地処理溶液を1 mL重層して細胞に新しい培地を補充し、このフィーディング手順を毎週繰り返します。ソフトアガー中での2週間半の細胞培養後、各ウェルのコロニー数をカウントします。定量化を容易にするため、光学顕微鏡を使用し、透明フィルムに印刷したグリッドを6ウェルプレートに取り付け、カウント時に細胞の位置を特定しやすくします。コロニーサイズは各コロニーの直径によって定量化されますが、サイズは変動するため、あらかじめ基準となるコロニーサイズを定義し、どのコロニーをカウント対象とするかを決定します。例えば、ここでは70 µm以上のコロニーサイズをデータ解析に含めています。カウント後、ゲルの乾燥を防ぐために、6ウェル培養プレートをパラフィルムで密閉します。さらなるコロニー形成を防ぎ、後でカウントを行うために、サンプルを4 °Cで保存してください。結果から、パッド阻害剤の存在下において、BBクロラミンがMCF 10 DCIS細胞由来のコロニー形成を有意に抑制することが示されました。DMSOコントロールと比較して、コロニー形成数およびコロニーサイズの両方が減少しました。BBクロラミンで処理したMCF 10 DCIS細胞のコロニーサイズは、主に20から100 micrometersの範囲内でした。DMSOコントロールのコロニーサイズは、2週間半の培養後に70から150 µmという広い範囲を示しましたが、70 µm以上のコロニーをカウントして解析しました。DMSOコントロールでは平均して約3,500個のコロニーが認められたのに対し、BBクロラミン処理群では約2,000個のコロニーしか認められませんでした。2週間半の軟寒天培養後、1 µMのBBクロラミンの存在下で平均コロニー形成数が44%減少したことは、このPAD阻害剤が乳がん細胞に対して有意な腫瘍形成抑制作用を持つことを示しています。この手順を行う際は、溶液が取り扱い中に凝固するのを避けるため、あらかじめすべての試薬と器具を予熱しておくことが重要です。ご視聴ありがとうございました。

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インビトロ細胞侵入アッセイは、タンパク質マトリックスを含む細胞培養インサートを用いて細胞侵入および移動の細胞電位を定量化することにより、癌転移の可能性を測定するために使用される。細胞は、タンパク質マトリックスと多孔質膜を通って、化学集化剤に向かって移動し、光顕微鏡で定量化することに挑戦される。...

腫瘍性細胞行動の尺度としてのインビトロ侵血アッセイにおけるマウス乳腺腫瘍細胞の使用

このプロトコルは、ヒト乳腺細胞の形質転換を評価するための実験的なインビトロツールを提供する。細胞増殖率、アンカレッジ非依存性増殖能、基基膜マトリックスを用いた3D培養における細胞系統の分布をフォローアップするための詳細なステップについて説明する。...

ヒト乳腺上皮細胞における発癌性転換のインビトロ評価

本プロトコルは、初代がん細胞から3D腫瘍培養モデルを生成し、細胞生存率アッセイおよび顕微鏡検査を使用して薬物に対するそれらの感受性を評価することを記載しています。...

患者由来の腫瘍サンプルから3次元スフェロイドを樹立し、薬物に対する感受性を評価

この実験プロトコルは、lncRNAのノックダウンとコロニー形成アッセイを組み合わせ、lncRNAが骨肉腫細胞増殖に与える影響を定量化する、安定的でコスト効率が高く効率的な方法を提供します。...

LncRNAノックダウン骨肉腫細胞の増殖能力を検出するコロニー形成アッセイ

学ぶ軟寒天コロニー形成アッセイによる乳癌細胞の腫瘍形成評価法。PADI酵素阻害剤BB-Cl-amidineの効果を定量的に測定し、細胞の半固体マトリックス内増殖能力を解析する手法を解説します。

乳癌細胞における腫瘍形成の阻害剤を同定するための軟寒天コロニー形成アッセイの活用

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