Name: ニコチン誘導性カルシウムシグナリングおよび腹側海馬軸索に沿って神経伝達物質放出のライブイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: 学ぶニコチン誘導性カルシウムシグナリングと神経伝達物質放出のライブイメージング手法。腹側海馬―側坐核回路のシナプス可塑性機構を解析し、前シナプス性ニコチン受容体の機能を解明する。

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技術サポートを提供してくださったYehui QinさんとMallory Myersさんに感謝します。また、抗α4-ECD抗体を提供してくださったSigismund Huck博士にも感謝します。この研究は、国立衛生研究所の助成金NS22061によって支援されています。

全ての動物実験は、実験動物の管理と使用に関する健康ガイドの国立研究所に従って行った（NIH出版番号80から23は、2012年改訂）し、研究は施設内動物実験によって承認されたとストーニーの研究委員会のために使用しますブルック大学（＃1618と＃1792）。 1. vHipp-NACCシナプス共培養<ol><li>犠牲マウス（生後0日-野生型（WT）またはα7nAChR類トランスジェニックマウスラインから3）CO 2を。各子犬の首をはねると事後遺伝子型決定のための1.5ミリリットル遠心管に尾を保存します。滅菌フードで次の手順を実行します。 </li><li>脳全体を露出させるためにハサミやピンセットで頭蓋骨の上部を取り外します。互いに尾側からの大脳皮質の部分の接合部から開始して、解剖顕微鏡下vHipp 5,21を含む後部皮質が含まれている冠状断面を得ます。 </li><li> Vを分析発展途上のマウス脳アトラス22（ 図1A）によればCA1-海馬台領域を含むヒップ組織片。 （100ミクロンmicroslices×100ミクロン程度）の小さな薄いスライスにカット冷培地（4℃）を含む35mmの培養皿に移します。 </li><li> 37℃のインキュベーター内に少なくとも30分間、培地（〜500μl）を、24​​ウェル組織培養プレートの内側12ミリメートルポリ-D-リジン/ラミニン被覆カバーガラスをプレインキュベートします。 microslicesをメッキする前にメディアを取り出します。 </li><li>外植片の付着を容易にするために（microslicesの〜20個を含む〜50μL、）メディアの最小量でカバースリップの中央に火造りパスツールピペットでプレート。 1匹の動物に由来するプレートvHippのmicroslices（どちらか+ / +または - / - トランスジェニックα7ラインの​​遺伝子型）各カバースリップ上。 </li><li>外植片がカバースリップ上に沈降した後、静かに目によって追加メディア（〜100μl）を追加電子壁メディアのレベルは完全に周囲の外植片ではなく、カバースリップの中央にそれらをカバーするのに十分に高いようにします。 </li><li> 37℃でO / Nインキュベートした後、5％CO 2インキュベーター、生後1日目WTマウスに胚日18からNACCニューロンを分散させ、外植片に加えます。 <ol><li>発展途上のマウス脳アトラス20（ 図1B）に応じてNACC組織を解剖。 </li><li> （500ミクロンmicroslices×500ミクロン程度）を小片に切断し、15 mlチューブに移します。 </li><li> 37℃で15分間、0.25％トリプシン（2ml）で処理します。冷培地で1回洗浄（5 mlで4°C）、続いて冷洗浄培地（5 mlで4°C）での洗浄組織塊三回。サスペンションは、各洗浄工程における5分間の休憩、その後、上清を慎重に取り除くことを可能にします。 </li><li>軽くファイアーポリッシュパスツールピペットで培養培地2mlに優しい粉砕して細胞を解離します。 </li><li>トランス5分間、2,000 X rpmでさらに15 mlチューブと遠心分離機に細胞懸濁液FER。上清を除去し、6子犬ごとに1 mlの培養培地で細胞を再懸濁します。穏やかファイアーポリッシュパスツールピペットで培地で数回ピペッティングして細胞を分散。 </li><li> vHipp移植片と各カバースリップに分散NACC細胞の0.25ミリリットルを追加します。 </li><li>加湿37℃、5％CO 2インキュベーター内で培養を維持します。機械的にシナプス形成を促進する、湿度を安定して維持するために、湿らせた滅菌ガーゼパッド上に培養プレートを置きます。 </li></ol></li></ol> 2.免疫細胞化学<ol><li> 4％パラホルムアルデヒド/ 4％スクロース/ PBS（カバースリップあたり〜500μL、20分、RT）における- （in vitroで 7日5）文化を修正しました。 </li><li> 0.25％トリトンX-100 / PBSで透過処理培養（〜カバースリップあたり500μL、5分、RT）。 </li><li>不格好なやつの前に、PBS中の10％正常ロバ血清（カバースリップあたり〜500μL、30分、RT）でブロック文化Y染色。 4℃でO / N一次抗体でインキュベートします。 、抗小胞性グルタミン酸トランスポーター1（1：250）、抗GAD65（1：100）：;：抗nAChR類（抗α5サブユニット、1 500 500α4 -ECD 1：）以下の一次抗体を使用してください。 </li><li> PBSで一次抗体を洗浄（カバースリップあたり3回/〜500μL、5分間）した後、アレクサ488（カバースリップあたり〜500μlを、1：500）に結合した二次抗体で培養インキュベートまたはアレクサ594（カバースリップあたり〜500μLを、1：37℃で1時間、500）。 </li><li>標識前表面α7*のnAChRのための固定を37℃で45分間：（培地1,000〜カバースリップあたり500μlの、1）のAlexa 594にコンジュゲートαBgTxで培養をインキュベートします。 </li><li>マウントとシールカバースリップ。 </li><li>プランアポクロマート対物レンズ（NA 0.8または1.4 NAの63X油で20X）を備えた蛍光顕微鏡とCCDカメラで画像をキャプチャします。 </li></ol> 3. FM1-43ベースの水疱性の融合<ol><li>ディスク共焦点顕微鏡を紡糸上室マウント、撮像チャンバ内に- （in vitroで 7日、5）の文化を維持します。連続RTでHBSカクテル（1ml /分）灌流。 </li><li> 90秒間の56 mMのK + ACSF（〜500μL）（染色）で10μMのFM1-43で灌流し、負荷の文化を停止、のCa 2+ ADVASEP-7（0.1 mm）を含む無HBSで15分間離れて外部染料を洗います膜結合FM1-43を除去します。 </li><li> 、120秒（脱色）のためにFM1-43ずに56 mMのK + ACSF（〜500μL）と文化を刺激するのと同じ条件を用いて、FM1-43と文化を再ロード、およびCaで再び洗浄2+のためADVASEP-7を含む無HBS 15分。 </li><li> （1.4 NA、励起488 nmの発光530 nmのと60X水）プランアポクロマート対物レンズを搭載した回転ディスク共焦点顕微鏡でFM1-43の蛍光画像を取得し、CCDカメラで画像をキャプチャします。 </li><li> 1分間のベースラインFM1-43蛍光画像（2秒ごとに集めます）プリニコチンコントロールとして; 1分間の急速な灌流（2 ml /分）によってニコチン（1μM）を適用し、アウトHBSカクテルでニコチンを洗います。 5分ごとに2秒の間、およびニコチン適用後に、前にキャプチャタイムラプス画像を保管してください。 </li><li> （F 染色 ）の前に、各シナプスブートンにおける（F 脱色 ）ニコチン適用後FM1-43の蛍光強度を定量化します。 </li><li>ニコチンアプリケーション（ΔF= F 染色 -Fの脱色 ）の前と後のFM1-43蛍光強度の差を定量化することによってvHipp軸索に沿って解放可能FM1-43蛍光の総量を計算します。次式を有するニコチン後の蛍光強度の減少の割合を分析：F 減少 ％=ΔF/ F 染色 。 </li></ol> 4.カルシウムイメージング<ol><li>次に、（5μMのFluo-4のCa 2+指示薬と文化を読み込む、通常のHBSで迅速- （in vitroで 7日5）文化をすすぎますAMエステル）、37℃で30分間、5％CO 2のためにHBSで0.02％プルロニックF-127（2ml）中。 </li><li> HBSとのFluo-4溶液（3回/ 5分）洗い流します。 （37℃/ 5％CO 2）は、少なくとも30分間インキュベーターに文化を返します。 </li><li>同じ撮像チャンバーとFM1-43ベース小胞の融合の項に記載と同様の条件で培養を維持する（ステップ3.1を参照してください）​​。 </li><li>プランアポクロマート対物レンズ（1.4 NAの60X水、励起488 nmの発光530 nm）をCCDカメラでvHippマイクロスライスから軸索突起のフルオ4蛍光画像を収集します。 </li><li> 1分間の急速な灌流（2 ml /分）によってニコチン（1μM）を適用、事前ニコチンコントロールとして、ベースラインのFluo-4の蛍光画像（2分10秒ごと）を採取し、アウトHBSカクテルでニコチンを洗います。 30分ごとに10秒の間、およびニコチン適用後に、前にキャプチャタイムラプス画像を保管してください。 </li><li>一連の生のfluo-4の蛍光画像、輸出のすべてのフレームを保存さらなる分析のためのTIFF形式の画像。 </li><li>ニコチン適用前と後のvHipp軸索に沿ってFLUO-4の蛍光の積分強度を収集します。 </li><li> ΔF/ F F 0は、バックグラウンド補正前ニコチン積分蛍光強度であり、Fは、各時点におけるvHipp軸索に沿って統合された蛍光強度が0 =（FF 0）/ F 0、以下の式を有する集積蛍光強度を正規化ニコチン適用後。正規化された統合された蛍光強度を分析し、プロットします。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

共培養の準備は、in vitroで前シナプスのnAChRの活性化が強化されたグルタミン酸作動性伝達5、21を誘発することにより、空間的および時間的プロファイルのこの準備を許可比較的簡単で信頼性の高い検査を再降伏し、腹側海馬側坐核回路を説明しました。 共培養は、インビボ様の機能を実証するために、インビトロでの生理学的条件を提供することができる一皿内の異なる特定の細胞型の増殖として定義されます。従来のニューロン - ニューロン共培養物は、異なる細胞型の間のシナプスの相互作用を研究するための神経科学の研究に導入されています。しかしながら、前及びこれらの共培養におけるシナプスの後の部位を同定することは困難です。このmicroslice解離ニューロンの共培養プロトコルは、シナプス前軸索とシナプス後の標的の容易に認識することができます。異なる脳領域からの使用microslices O異なる蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウス、Fラインが、このプロトコルは、軸索、軸索相互作用を研究するために使用することができ...

回路の興奮性のコリン作動性調節は、認知機能の基本的な側面に寄与し、変更されたコリン作動性の調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及び中毒1-4を含む神経変性及び精神神経疾患の特徴です。 CNSにおけるシナプス伝達のコリン作動性促進の確立メカニズムは、シナプス前部位に局在するのnAChRの直接の活性化を介してです。 、間接的に特定のnAChRサブタイプ、および比較的高いカルシウムコンダクタンスの両方に直接起因を介した細胞内シグナル伝達カスケード-これらのシナプス前受容体の活性化は細胞内Ca 2+（[Ca 2+] i） のシナプス前末端での増加につながります図5は 、それによって神経伝達物質の放出を増強します。実際には、シナプス前のnAChRの活性化は、グルタミン酸、GABA、アセチルコリンなどの神経伝達物質の多種多様の放出の変化と関連している、ANDドーパミン6-10。このプロセスは、様々なシナプスにおける電気生理学的方法を用いて、間接的に研究されてきたが、の光学記者の[Ca 2+] iとシナプス小胞のリサイクルは、前シナプス現象のより直接的かつ時間的に正確な測定を可能にします。 nAChR類の前シナプス局在は、電子顕微鏡（EM）レベル11,12でのnAChRの直接の免疫金標識で説得力が実証されています。いくつかの他の技術もまた、培養ニューロン13,14でのnAChR subunit-蛍光タンパク質キメラの位置を検出するなど、間接的のnAChR局在に対処するために使用されている、シナプス端子15,16でのnAChR電流の電気生理学的記録、[内のCaニコチン誘発変化を監視しますによるシナプスターミナルでのライブセルイメージング17、及び神経伝達物質の放出を間接的に監視することにより、シナプス神経終末における2+] i のスチリル両親媒性FM色素（FM1-43とFM4-64）お​​よび/またはsynapto-pHluorinによって、そのようなグルタミン酸のためのAChとiGluSnFrためCNiFERsなどの特定の神経伝達物質の蛍光の記者、によって見シナプス小胞のエキソサイトーシスを含む蛍光指示薬と生細胞イメージング技術、 18-20。全体的に、nAChR類の前シナプス局在を同定するため、これらの現在の手法は複雑であり、信頼性の高い同定とプレシナプス活性の生理学的モニタリングを可能にするために、特別なシステム及び技術を必要とします。 識別し、シナプス伝達のシナプス前および後の両方の成分を分析するための直接アクセスを提供し、側坐核（NACC）回路-ここでは、腹側海馬（vHipp） の in vitro共培養システムのためのプロトコルおよび装置が記載されています。我々は、シナプス前のnAChRの局在およびCa 2+シグナル伝達と神経伝達物質の放出ALO媒介のnAChRのライブセルイメージングの例を示しますNG vHipp軸索。ここで紹介するプロトコルの自然（と簡単な）拡張は、異なる遺伝子型からの神経細胞からなる前と後シナプスの接点の製造です。このように、変調の前および/または後シナプスメカニズムの特定の遺伝子産物の寄与を直接評価することができます。

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. 培養培地 (50 ml)</td></tr><tr><td>神経基礎&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>10888022</td><td>48 ml</td></tr><tr><td>B-27 サプリメント</td><td>GIBCO</td><td>0080085-SA</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>GIBCO</td><td>10908-010</td><td>0.5 ml</td></tr><tr><td>GlutaMAX サプリメント</td><td>GIBCO</td><td>35050-061</td><td>0.5 ml</td></tr><tr><td>脳由来神経栄養因子 (BDNF)</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td colspan="4">2. 洗浄培地 (HBSS, 100 ml)</td></tr><tr><td>HBSS、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドなし&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>14175-095</td><td>99 ml</td></tr><tr><td>HEPES ( 1M)</td><td>GIBCO</td><td>15630-130</td><td>1 ml</td></tr><tr><td colspan="4">3.HEPES緩衝生理食塩水&nbsp;(HBS)&nbsp;&nbsp;pH=7.3</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888&nbsp;</td><td>135 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333&nbsp;</td><td>5メートルメートル</td></tr><tr><td>MgCl<サブ >2</サブ>シ</td><td>グマ</td><td>M8266&;</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>CaCl2,Sigma</td><td></td> <td>C1016&nbsp;</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>シグマ</td><td>H3375&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>シグマ</td><td>G0350500&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td colspan="4">4. HBSライブイメージング用カクテル pH=7.3</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888&nbsp;</td><td>135 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333&nbsp;</td><td>5メートルメートル</td></tr><tr><td>MgCl<サブ >2</サブ>シ</td><td>グマ</td><td>M8266&;</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>CaCl2,Sigma</td><td></td> <td>C1016&nbsp;</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>シグマ</td><td>H3375&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>シグマ</td><td>G0350500&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>テトロドトキシン&nbsp;</td><td>トクリス</td><td>1078</td><td>2 & マイクロ;M</td></tr><tr><td>bicuculline</td><td>Tocris</td><td>131</td><td>10 &micro;M</td></tr><tr><td>D-AP-5</td><td>トクリス</td><td>105</td><td>50 & マイクロ;M</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>トクリス</td><td>1045</td><td>20 & マイクロ;M</td></tr><tr><td>LY341495</td><td>Tocris</td><td>1209</td><td>10 & マイクロ;M</td></tr><tr><td colspan="4">5.カルシウムフリー&nbsp;HBSの&nbsp;&nbsp;pH=7.3</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888&nbsp;</td><td>135 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333&nbsp;</td><td>5メートルメートル</td></tr><tr><td>MgCl<サブ >2</サブ>シ</td><td>グマ</td><td>M8266&;</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>シグマ</td><td>H3375&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>シグマ</td><td>G0350500&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td colspan="4">6. 56 mM カリウム ACSF pH=7.4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Σ</td><td>S9888</td><td>119 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Σ</td><td>P9333</td><td>56 mM</td></tr><tr><td>MgSO4.7H</td><td>Σ</td><td>M1880</td><td>1.3 mM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>σC1016</td><td>2.5 mM</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Σ</td><td>S8282</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td></td><td>σS5761</td><td>26.2 mM</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>シグマ</td><td>G0350500&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr></tbody></table>

ニコチン誘導性カルシウムシグナリングおよび腹側海馬軸索に沿って神経伝達物質放出のライブイメージング

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

シナプス前ニコチン性アセチルコリン受容体（nAChR）の活性化による軸索シグナル伝達の持続的な増強と神経伝達物質の放出の増加は、アセチルコリン（ACh）による神経調節の重要なメカニズムです。インタクトな軸索内および神経終末におけるシグナル伝達機構をin vitroおよびin vivoで調べることが困難であるため、シナプス可塑性のシナプス前成分の研究は限定的に進んでいます。ここでは、in vitroでシナプス前ニューロンとシナプス後ニューロンの遺伝的プロファイルを選択的に変化させながら、伝達のシナプス前とシナプス後の両方の成分を直接ライブイメージングで分析できる、腹側海馬(vHipp)-側坐(nAcc)回路の遺伝子キメラ調製物を紹介します。シナプス前軸索入力としてのvHippマイクロスライスからの投影が、シナプス後ターゲットであるnAccからの分散ニューロンと複数の信頼性の高いグルタミン酸作動性シナプスを形成することを実証します。nAChRのさまざまなサブタイプのシナプス前局在が検出され、シナプス前ニコチンシグナル伝達を介したシナプス伝達が、電気生理学的記録と生細胞イメージングの同時実行によって監視されます。この調製物は、グルタミン酸作動性シナプス可塑性のシナプス前およびシナプス後メカニズムをin vitroで研究するための有益なアプローチも提供します。

採用製剤は、 インビトロで vHipp-NACC回路の遺伝子キメラ共培養物から構成されています。 vHippのmicroslicesから発せられる投影は、前シナプスの軸索の入力として、シナプス後の目標、NACCから分散ニューロンとシナプス接触を行うことができます。ニコチンはvHipp軸索21とシナプス前α7を介しvHipp軸索5に沿ってシグナリング長期化カルシウム*のnAChRにより神経支配NACCニューロンからのグルタミン酸伝達の持続（≥30分）円滑化を誘導しました。 図1は、vHippマイクロスライスから突起がグルタミン酸（VGLUT1正）であることを直接示し、接点がNACC（GAD正、 図1C、D）から分散GABA作動性中型有棘ニューロンで作られています。 α7*と（α4及びα5サブユニットを含む）非α7* nAChR類はvHipp軸索（ 図1E-G）に沿って、具体的に現場で発見された両方ここvHippの突起がN...

私たちは、ニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)を介したシナプス伝達のシナプス前メカニズムを直接ライブイメージングで分析するための、腹側海馬-側坐回路の遺伝子キメラ製剤をin vitroで開発しました。この調製は、シナプス可塑性のシナプス前およびシナプス後のメカニズムを研究するための有益なアプローチも提供します。

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

本手順の全体的な目的は、腹側海馬・側坐核回路の遺伝子キメラ調製物をin vitroで作成し、シナプス伝達の前および後シナプス成分の両方を同定・解析するための直接的なライブイメージングを可能にすることである。これは、まずCA1領域を含む腹側海馬組織のストリップを切り出すことで達成される。次のステップでは、腹側海馬ストリップを小さく薄いスライスに切り分け、それらのマイクロスライスを24ウェル組織培養プレート内のカバースリップの中央に播種し、一晩静置する。次に、脳組織から側坐核を切り出します。最終ステップとして、トリプシンを用いて側坐核の切片を個々のニューロンに分散させ、腹側海馬インプラントを塗布したカバーガラスに側坐核ニューロンを添加し、5〜7日間インキュベートします。最終的に、ニコチン性アセチルコリン受容体のシナプス前終末への局在、およびニコチン性アセチルコリン受容体介在性のカルシウムシグナリングと神経伝達物質の放出を解析します。腹側海馬軸索に沿った経路は、回転円盤共焦点ライブセルイメージングによって同定およびモニタリングすることが可能です。この手法の主な利点は、このマイクロスライス解離ニューロン共培養調製物を用いることで、シナプス前軸索およびシナプス後ターゲットを容易に認識できることです。この共培養調製物は、腹側海馬から側坐核への回路をin vitroで再現します。これにより、シナプス前終末およびシナプス後部のいずれか、あるいは両方のダイレクトなライブイメージングが可能になります。このin vitroシナプス標本を用いることで、シナプス前受容体の活性化がグルタミン酸作動性シナプス伝達に及ぼす空間的および時間的影響を高解像度でイメージングできます。その結果、組織採取前に、グルタミン酸作動性シナプス可塑性に寄与するシナプス前およびシナプス後の両方のメカニズムに関する情報を得ることができます。12 mmのポリリジンコーティング済みガラスカバースリップを24ウェル組織培養プレートに入れ、500 µLの培地とともに37 °Cで少なくとも30分間プレインキュベートします。その後、培養用の組織を回収するために、マイクロスライスを播種する前に培地を除去します。解剖顕微鏡下で、犠牲にした各幼仔の頭蓋骨上部を取り除き、脳全体を露出させます。大脳皮質が分かれる接合部から、腹側海馬を含む後方皮質を含む冠状断を採取します。次に、CA1領域を含む腹側海馬組織を切り出します。その後、組織を冷たい培養液が入った35mm培養皿に移します。続いて、組織をさらに小さく薄い切片に切り分けます。火炎研磨したパストゥールピペットを用いて、カバーの中央に切片を配置します。x外植片の付着を促進するため、50 µLの培地を滴下します。次に、腹側海馬のマイクロスライスをカバーガラス上に播種します。X個の外植片がカバーガラス上に定着した後、追加の培地100 µLを壁沿いに緩やかに加え、周辺部の外植片が完全に浸る十分な液量にします。ただし、カバーガラス中央の外植片まで浸らないようにしてください。その後、側坐核ニューロンを分散させる前に、外植片を37 °C、5% CO2条件下で一晩インキュベートします。次に、胚齢18日から生後1日目の野生型マウスから側坐核組織を採取し、細かく裁断した後、15 mLチューブに移します。組織を0.25%トリプシン2 mLで37 °Cで15分間処理します。続いて、4 °Cの洗浄用培地5 mLで組織を3回洗浄し、各洗浄ステップで懸濁液を5分間静置します。その後、4 °Cの培養液5 mLで組織を洗浄します。次に、火炎滅菌したパスツールピペットを用いて、2 mLの培地中で細胞を穏やかに撹拌し、解離させます。その後、細胞懸濁液を別の15 mLチューブに移し、2000 RPMで5分間遠心分離します。5分後、上清を除去し、細胞を培地で再懸濁します（6個のパピーあたり1 mL）。その後、火炎滅菌したパスツールピペットで培地を数回穏やかにピペッティングし、細胞を分散させます。最後に、分散させた核周囲細胞 25 milliliters を、腹側海馬外植片が配置された各カバースリップに添加します。シナプス形成を促進するため、培養プレートを湿らせた滅菌ガーゼパッドの上に置き、機械的に固定して湿度を維持します。その後、プレートを 5%CO2、37 degrees Celsius でインキュベートします。本手順では、培養物を1つずつイメージングチャンバーに移動させます。チャンバーを回転円盤共焦点顕微鏡に設置してください。室温にて、HBSカクテルを1 mL/minでサンプルに連続灌流させます。次に、灌流を停止し、56 mMカリウム含有 A CSF中の10 µM FM 1-43で培養物を90秒間染色します。その後、0.1 mM ADVASE-7を含むカルシウムフリーHBSを用いて、外側の色素を15分間洗浄します。その後、FM 1-43を含まない56 mMカリウム含有 A CSFで培養物を120秒間脱刺激します。染色のために。同様の条件下でFM 1-43を用いて培養液を再充填し、A-D-V-A-S-E-P sevenを含むカルシウムフリーHBSでさらに15分間洗浄します。次に、プランアポクロマート対物レンズを備えた回転ディスク共焦点顕微鏡を用いてFM 1-43の蛍光画像を取得し、CCDカメラで画像をキャプチャします。ニコチンの事前コントロールとして、ベースラインのFM 1 43蛍光画像を2秒ごとに1分間収集します。次に、1 µMのニコチンを2 mL/minの速度で急速灌流により1分間投与し、その後HBSカクテルでニコチンを洗い流します。ニコチン投与の前、最中、および後のタイムラプス画像を、2秒ごとに5分間キャプチャし続けます。このステップでは、培養物を通常のHBSで素早く洗浄します。次に、5 µMのFluo-4カルシウム指示薬と0.02%のPluronic F-127を含む2 mLのHBSを培養物に添加し、37 °C、5% CO2条件下で30分間インキュベートします。その後、HBSを用いてFluo-4溶液を3回洗浄し、各洗浄に5分間かけます。培養物をインキュベーターに戻し、30分以上静置します。その後、培養物を1つずつイメージングチャンバーに移します。条件は、FM 1-43を用いた小胞融合の手順で記載されているものと同様とします。ニコチンの投与前コントロールとして、腹側海馬マイクロスライスの軸索投射から、ベースラインのflu oh four蛍光画像を収集します。次に、1 µMのニコチンを2 mL/minの速度で1分間迅速に灌流させ、その後HBSカクテルでニコチンを洗浄します。ニコチン投与前、投与中、および投与後のタイムラプス画像を、10秒ごとに30分間キャプチャし続けます。この図は、腹側海馬マイクロスライスの投射がグルタミン酸作動性であり、側坐核の分散したGABA作動性中型有棘ニューロンとの間に接触が形成されていることを直接的に示しています。腹側海馬軸索に沿って、特に腹側海馬投射が側坐核ニューロンと接触する部位において、α7および非α7ニコチン性アセチルコリン受容体の両方が認められました。側坐核の分散したニューロンはα7ニコチン性アセチルコリン受容を発現していないため、接触部位における受容体クラスターは厳密にシナプス前膜に存在することが注目されます。腹側海馬軸索に沿ったFluo-4カルシウム蛍光のタイムラプス画像は、回転円盤共焦点顕微鏡を用い、60倍の水浸対物レンズで10秒ごとに30分間撮影されました。取得した画像には擬似カラースケールを表示し、1秒あたり2フレームのビデオとして再生しました。このビデオは、生きた野生型腹側海馬軸索において、ニコチンの添加によって誘発された持続的なFluo-4カルシウム蛍光活性を示しています。本手順を実施する際は、腹側海馬マイクロ組織を最小限の量の培地で播種し、培養プレートを湿らせたステレオ成長パッド上に保持することが重要です。これらのステップは、マイクロ組織の接着、投射の伸展、およびシナプス形成において極めて重要です。したがって、この共培養系を用いることで、シナプス前入力のジェノタイプを、シナプス後標的とは独立して変更することが可能になります。さらに、これにより、いずれかのコンパートメントにおいて外来遺伝子を選択的に、かつ独立して発現させることが可能になります。これは、シナプス可塑性のシナプス前メカニズムとシナプス後メカニズムを解析する上で非常に大きな潜在性を秘めています。このビデオを視聴することで、腹側海馬から側坐核への回路を再現した遺伝子キメラシナプス共培養系を作成する方法を理解できるはずです。これにより、ライブイメージング技術を用いて、シナプス前および後ニューロンの両方を解析することが可能になります。

live-imaging-nicotine-induced-calcium-signaling-neurotransmitter

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

私たちはより良いアプローチノックインおよびスペクトルを用いた受容体の蛍光タンパク質タグを含むアプローチの組み合わせを使用して、ニコチン中毒のメカニズムを理解するCNSニューロンの特定のサブタイプの細胞内領域内のニコチン性アセチルコリン受容体の変化を定量化する新しい技術を開発しました共焦点イメージング。...

慢性ニコチン投与によるマウスノックインで蛍光標識ニコチン性受容体のスペクトル共焦点イメージング

このビデオは、マウスの脳から腹側海馬組織と側坐核組織を共培養用に準備するプロセスを示しています。ニューロンは突起を伸ばして、腹側海馬組織と側坐核組織との間にシナプス接続を形成します。この方法により、これら2つの脳領域間のニューロンの相互作用を研究することができ、認知、行動、および神経障害に関する洞察が得られます。...

腹側海馬と側坐核の共培養

このビデオは、マウス腹側海馬におけるニコチン性アセチルコリン受容体のニコチン媒介活性化が、軸索に沿った持続的なカルシウムシグナル伝達をもたらす方法を示しています。...

シナプス共培養における腹側海馬軸索に沿ったニコチン誘発性カルシウムシグナル伝達のイメージング

Source: バンクロフト、E. A., et al.自発的なCa style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'2+ &gt; Fluxes and their downstream effects in Primary Mouse Midbrain Neurons. J. Vis. Exp. (2020)...

マウス胚由来の腹側中脳ニューロンにおけるカルシウム流入の可視化

Source：&lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/53705/in-vivo-functional-brain-imaging-approach-based-on-bioluminescent'&gt;ラーク、A. R.、 et. al., 生物発光カルシウム指標GFP-aequorinに基づく生体内機能脳イメージングアプローチ。 J. Vis. Exp. (2016)このビデオは、緑色蛍光タンパク質-イクオリン生物発光を使用したカルシウムダイナミクスのリアルタイムイメージングを示しています。 ショウジョウバエの...

ショウジョウバエの脳構造におけるカルシウム過渡現象の研究のための生物発光イメージング

この記事は、ニコチンの調査によるマウス脳切片でニコチン性アセチルコリン受容体 (nAChRs) を研究するための方法を示します。同時パッチ ・...

活性型のニコチンのレーザー フラッシュ ・ フォトリシス法によるマウス脳切片でのニコチン性アセチルコリン受容体の機能を探る

この方法は、生きているマウスの海馬への光学的アクセスを可能にする慢性的な調製を記述する。この調製は、数週間の期間にわたって神経構造可塑性および活性誘発細胞可塑性の縦方向光学イメージングを行うために使用することができる。...

生きたマウスにおける後部海馬CA1の縦方向2光子イメージング

ここでは、ショウジョウバエの学習と記憶の文脈で、前および/または後のカルシウムを視覚化できるプロトコルを提示する。シナプス的に局在するカルシウムセンサを用いた生体内カルシウムイメージングでは、この種の連想学習の根底にあるシナプス可塑性が決定され得るように、古典的な嗅覚調節パラダイムと組み合わされる。...

ショウジョウバエメラメラノガスターにおける学習誘発シナプス可塑性の生体内光学カルシウムイメージング

現在のプロトコルは、海馬への腹側テグメンタル領域(VTA)グルタミン酸突起をトレースするための簡単な方法を示しています。VTAグルタミン酸ニューロンの光刺激をCA1記録と組み合わせて、VTAグルタミン酸末端が生体内での推定ピラミッド発火率を調節する方法を示した。...

海馬の腹側テグメンタル領域グルタミン酸末端のインビボ解剖学的および機能的なトレース

この記事では、注入カニューレを補ったカスタムメイドのイメージングウィンドウの準備と、マウスの海馬のCA1領域への移植を示す。...

マウスの振る舞いの海馬における神経活動を可視化するための頭蓋骨管制法

このプロトコルは、無傷の三叉神経節(TG)ニューロンの in vivoGCaMPカルシウムイメージングを記述します。この説明には、TG 曝露手術、TG ニューロンの in vivo 共焦点顕微鏡イメージング、TG ニューロン顕微鏡イメージング中の体細胞刺激の適用、および in vivo GCaMP カルシウム イメージング...

インビボ 無傷の三叉神経節における一次感覚ニューロンのネットワークにおけるニューロンアンサンブルのカルシウムイメージング

学ぶニコチン誘導性カルシウムシグナリングと神経伝達物質放出のライブイメージング手法。腹側海馬―側坐核回路のシナプス可塑性機構を解析し、前シナプス性ニコチン受容体の機能を解明する。

ニコチン誘導性カルシウムシグナリングおよび腹側海馬軸索に沿って神経伝達物質放出のライブイメージング

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