Name: 神経変性疾患のショウジョウバエモデルにおけるクライミング欠陥の定量分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: 学ぶ神経変性疾患研究におけるショウジョウバエのクライミング欠陥定量分析法。Drosophila melanogasterを用いた負の走地性アッセイにより、軽微な運動障害を検出し、遺伝的相互作用や薬物標的のスクリーニングに活用できます。

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この作業は、カナダ健康研究所（CIHR）のチーム助成金によってボルデュック博士（共同PI）とガイ・ルーロー博士）に支援されています。このメソッドの開発と統計解析にご協力いただいたOksana Suchowersky博士、Kathryn Todd博士、アルバータ大学フライクラブのメンバー、Clayton Dickson博士に感謝いたします。

キイロショウジョウバエの研究は、アルバータ州の研究指針の大学を遵守していました。 1.フライコレクション<ol><li>食品を含む25ミリメートルX 95ミリメートルの回収バイアル中のCO 2（g）の麻酔と場所を使用して、20ハエを収集します。 </li><li>水平にハエを含むストアバイアルは、バイアル底に蓄積する可能性のある液体でハエをトラップ避けるために。 </li><li>約15時間、インキュベーター中で45％の湿度で22℃で少なくとも21時間、ハエをインキュベートします。暗サイクル：12時間の明とインキュベーターを設定します。 </li></ol> 2.クライミングアッセイ<ol><li>翌朝は、メスシリンダー250mlのガラスに単一バイアルから20ハエを転送します。それを一定の日常を維持するために、シリンダの位置をマークします。遺伝子型間の交差汚染を防止するために、遺伝子型ごとにガラスシリンダーを使用してください。各実験及びROの最後に洗います遺伝子型との間でそれらをテート。 <ol><li>温度22℃、湿度40％であった（視覚の潜在的な欠陥がある場合、または赤色光）は、周囲の光の中で実験を行います。概日リズムの交絡を回避するために、常に一日の同じ時間に実験を行います。 </li></ol></li><li>任意のハエ（ 図2）の漏れを防止するためのバリア膜（ワックスフィルム）とシリンダーの上部をシール。 </li><li>三脚にビデオカメラを設定します。 250ミリリットルの190ミリリットルライン上の焦点カメラは、シリンダ（17.5センチメートル）を卒業しました。 </li><li>シリンダーの底部に、食品バイアルに死んだハエの数をカウントします。死亡率としてこの番号を記録します。 </li><li>非常に軽く内側底面にハエを変位させるように十分な力で繰り返しクローズドセルフォームパッドに対してシリンダーをタップします。カメラの記録を押すようにもう一方の手を使用しながら10回 - 5をタップします。 </li><li>カメラの「録音」ボタンを押してください。 </li><li> VIDを開始EOカメラ記録とは別個の非リズミカルなパターンでシリンダーを6回タップします。 </li><li>ハエが最後のタップされた時点から2分間各試験を実施し、選択した各時点で17.5センチメートル（190ミリリットル）（10秒ごとに定量化）の高さを横切るハエの数を記録します。注：シリンダーのマーキングミリリットルを直径に応じて、1気筒モデルから別のものに変化します。エラーを回避するには、使用される各気筒の高さを測定します。 </li><li>裁判が終わった後、95％エタノールにハエを処分。 </li><li>すべての複製が新鮮なハエとするたびにテストされるまで繰り返して、2.9に2.1を繰り返します。 注：5の複製は、変異が運動に強い影響を持つ十分であるかもしれないが、20ハエ（200ハエ）の10の生物学的反復は、より小さな差を検出することをお勧めします。 </li><li>実験の完了後、再使用する実験用食器洗い機、乾燥O / Nでのシリンダを洗浄します。 </li></ol> 3.分析<ol><li> ANALY各フライ試験のZE動画。各10秒は、ターゲットラインを通過したハエの総数を記録します。 <ol><li>フライバックダウン登っまたは低下した場合、-1のように飛ぶし、レコードはバックダウン登ったり下ったハエと同じ数として目標ラインと交差するように、次のフライを数えます。 15 番目のフライが目標ラインを下回った場合、（16 番目が飛ぶ）ラインを通過する次のハエは、15 番目、16番目を飛行していないと考えられています。 </li></ol></li><li>裁判に残るハエの数を得るために、ハエ（20）の合計数から死亡を引きます。各時点で、ターゲット·ラインの上のハエの画分を得ました。 </li><li>各時点での各割合をプロットする（ 図3参照 ）。 </li><li> 120秒のデータポイントでパフォーマンスを分析し、2基が存在する場合、またはANOVAとボンフェローニ修正と多重比較のための事後テストは、（計画および計画外の共同のためのテューキーのためのスチューデントt検定を行いますmparisons）。コルモゴロフ-スミルノフ17はまた、正規と同等の分散を確認するために行われるだけでなく、コントロールに変異群の分布を比較するためにテストします。 </li><li> 、老化を介してデータを現在進行赤字（ 図4）があるかどうかを確認するために、異なる年齢のハエで120秒に（2日、1週間、2週間）を登るハエの割合をプロットします。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ショウジョウバエはすでにパーキンソン病14および他の神経変性条件1,2に優れたモデルであることが証明されました。 ショウジョウバエで利用可能な遺伝子ツールに加えて、そのゲノムは非常に神経疾患19に関与する遺伝子のために保存されています。 （全体exomeシーケンシングを含む）ゲノムワイド遺伝子スクリーニング法の出現は、人間の運動障害に関連する候補遺伝子の大きなリストを提供し続ける可能性が高いです。これらの条件のための治療法の開発は、神経変性の初期段階に関与する病理学の我々の理解を高めるために、動物モデルが必要になります。 ショウジョウバエの使用と負の走地性アッセイは、機関車の欠陥に関与する遺伝子を同定し、その後の表現型の救済のための候補薬剤をスクリーニングする、安価で信頼性の高い方法を提供します。これは、分子、電気生理学的に加算して、撮像証明T帽子は、同じ動物モデルで得ることができます。クライミングアッセイを使用して、他は正常人の運動を破壊遺伝子についてハエ突然変異体における運動欠陥を再現しています。それにもかかわら...

パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、および遺伝性痙性対麻痺のような壊滅的な神経変性疾患は、ますます認識されています。残念ながら、これらの神経変性疾患のほとんどは、治療せずに残っ​​ています。このような全体exomeシーケンシングなどのゲノムワイドな、公平な遺伝子検査の広範な臨床使用は、ヒト機関車の障害に関与している遺伝子の数の増加につながっています。この進歩にもかかわらず、初期後期への病理学的進行は、これらの疾患でとらえどころのないままになります。 ショウジョウバエは、制御された空間及び時間的に遺伝子の要件を研究するための遺伝的ツールとのうちの1つを提供します。また、 ショウジョウバエは、パーキンソン1、アルツハイマー2、知的障害3,4およびとりわけてんかん5,6などの神経学的状態のための薬剤のスクリーニングに有用であることが証明されました。私たちの目的は、効果的なコストを開発することでしたまだモータ性能の小さな変化を検出するのに十分な感度であろう、高スループット分析を可能にする信頼性の高いアッセイ。 ショウジョウバエクライミング挙動に関する遺伝子変異及び/又は環境条件の影響を定量化するために使用されるいくつかのアッセイがあります。アッセイのほとんどは負の走地性、またはクライミングアッセイとして知られて登るハエの自然な傾向を生かします。 Benzer 7は走光性の研究のために使用されるカウンター現在の装置はまた、重力走性を研究するために使用することができることを1967年に提案しました。それ以来、Ganetsky 8および他の多くの9 -12は最初のアッセイ上に構築されてきました。原理は、バイアルにハエの既知の数を配置し、ハエがバイアルの底に落下させ、硬い表面に対して強くバイアルをタップすることです。それは生得的行動であるように、ハエは、重力に反対し、バイアルの上部に登るしようとします。このアッセイは、定量的およびmeasuです割り当てられた時間期間の間に、バイアル上のマーカーを越えて上昇しているどのように多くのハエのres。代わりにハエクライミングの総数の速度の測定は、信頼性の高いパラメータとなり、ハエの基準の数は13に有意ではなかった場合の欠陥を示しています。 クライミングアッセイは、パーキンソン病14を含む多くの神経変性疾患の研究に有用であることが証明されました。しかし、我々は、機関車の欠陥は、神経変性が既に病理学的研究14に見られる時に検出されない場合があることに留意しました。したがって、従来のアッセイの使用は、疾患の発症の初期段階を研究するための能力を制限することができます。病理学の後の段階の間に機関車の欠陥の外観は、その進行の完全な救済のためのあまりに高度である疾患を反映することができます。 これは、従来のクライミングアッセイの感度を持つ潜在的な問題を提起します。 tradiの潜在的なことができないこと軽度の機関車の欠陥を検出するため的なクライミングアッセイはハエを登るために必要とされた高さに帰することができます。正常に10〜20秒で2〜5センチメートルの高さを乗り越えるために、従来のアッセイ15,16対策ハエの数。

<table><tbody><tr><td>ショウジョウバエ株</td><td></td><td></td><td>株は実験に応じて選択されます。部屋とインキュベーター内の温度と湿度は、ハエが静まりすぎたり濡れすぎたりしないように制御し、一貫している必要があります。</td></tr><tr><td>ビデオカメラ</td><td></td><td></td><td>デジタルビデオカメラなら何でも構いません。近くにある被写体にピントを合わせることができることを確認してください。</td></tr><tr><td>メスシリンダー</td><td>キンブル</td><td>20028W</td><td>メスシリンダーのモデルが異なれば、直径も異なる場合があります。したがって、高さを測定することが重要です。</td></tr><tr><td>コンピュータ</td><td></td><td></td><td>はどんなモデルでもかまいません。私たちはコンピュータを使ってハエの登りを監視し、各時点でのハエの数を記録しました。</td></tr></tbody></table>

神経変性疾患のショウジョウバエモデルにおけるクライミング欠陥の定量分析

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

神経変性疾患に起因する機関車の欠陥は、無症候性変性の年後に、疾患の遅発性の症状であることができ、したがって、現在の治療の治療戦略は治癒的ではありません。全体exomeシーケンスを使用することにより、遺伝子の増加は、ヒトの移動において役割を果たすことが同定されています。これらの遺伝子の同定にもかかわらず、これらの遺伝子は、正常な機関車の機能に重要であるかは知られていません。そのため、治療目的の新規標的を同定するために、これらの遺伝子の役割を解明するためのモデル生物を利用し信頼性の高いアッセイは、これまで以上に必要とされています。我々は以前より穏やかな欠陥の検出を可能にし、時間をかけてこれらの欠陥を評価する能力を有する負の走地性アッセイの感作されたバージョンを設計しました。ガラス中で行われるアッセイは、ワックスバリアフィルムで封止されているシリンダー、メス。閾値距離を増加させることによって、17.5℃に上昇させます私たちは穏やかなモビリティ機能障害を検出するのに高い感度を観察している2分の実験期間をMと増加。アッセイは、費用対効果がされており、再現性の高い結果を得るために広範囲の訓練を必要としません。これは、運動欠陥のショウジョウバエの変異体では、候補薬剤をスクリーニングするための優れた手法になります。

登山は強く、再現可能な動作です。 （ - 30秒25）実際、1日齢の野生型ハエが急速に目標距離クライミング性能に達します。変異体ハエがターゲットに登ることができないことを完了するために、穏やかな（または遅延）からパフォーマンスの範囲を提示します。我々は2つ​​の異なる突然変異対立遺伝子とここにこれを説明します。最初のものはspastin遺伝子（温泉5.75）18の完全な欠失によって引き起こされる遺伝子spastinの深刻な対立遺伝子です。この行で（TM6bと温泉5.75）1日齢のハエも、2分後に、WTクライミングのパフォーマンスに到達しません。この変異体のラインは、バイアル法（ 図1A、B）を使用していても重度の欠陥を呈します。同じ遺伝子のためのが、同じグループ（スパTM3と17-7）18によって公開不完全な欠失を有する変異体を研究する際に、ここで提示された方法の利点は、より明白になります。その場合、8日間の性能アップが正常（ 図1C-Fであります</strong&gt;）。 8日目に、これらのハエは登...

私たちは、神経変性疾患のモデルとして、Drosophila melanogasterにおける最適化された安価で信頼性の高いネガティブジオタキシスアッセイを提示します。軽度の自発運動障害に対してより感受性が高いため、このアッセイは潜在的な遺伝的相互作用と薬物標的のスクリーニングに役立ちます。

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

この手順の全体的な目的は、野生型ショウジョウバエおよび運動に関与する遺伝子に変異を持つショウジョウバエの登攀能力を定量化することです。まず、ショウジョウバエをガラス製メスシリンダーに転送します。次に、シリンダーをフォームパッドの上で軽く叩くことで、ショウジョウバエをシリンダーの底へ移動させます。次に、標的線を越えるハエをビデオカメラで2分間記録します。最終ステップとして、ビデオを解析し、10秒ごとの標的線より上のハエの数をプロットします。最終的に、このクライミングアッセイを用いて、ショウジョウバエの変異系統における登攀能力の欠陥を特定します。本手法、またはワイルド法などの既存手法の主な利点は、登攀能力のわずかな差異を検出できる点にあります。この手法は、遺伝性痙性対麻痺における特定の遺伝子が進行性歩行障害に果たす役割など、神経変性疾患分野における重要な疑問の解明に寄与します。本手法の活用は、治療法の開発につながると考えられます。IP（クライミングアッセイ）は、薬物反応や神経変性疾患の候補遺伝子の変異体をテストするための簡便な定量アッセイを提供するため、神経疾患の研究に有用です。まず、二酸化炭素を用いてショウジョウバエ20匹を麻酔し、餌の入った25 mm × 95 mmの回収用バイアルにすべてのハエを入れます。次に、バイアル底に溜まった液体にハエが閉じ込められるのを防ぐため、ハエの入ったバイアルを段ボール製のトレイに水平に置いて保管します。ハエを12時間の明暗サイクル条件下で、少なくとも21時間インキュベーターに入れます。翌朝、ハエをバイアルから250 mLのガラス製メスシリンダーに移し、ハエの脱出を防ぐために上部をパラフィルムで密封して、クライミングアッセイの準備を整えます。実験は、周囲光の下、温度22 °C、湿度40%の条件下で行ってください。睡眠サイクルによる混同を避けるため、実験は常に一日のうち同じ時間帯に実施してください。また、シリンダーを毎日同じ位置に配置できるよう、ベンチトップ上に位置をマークしておいてください。シリンダーの底および餌入りのバイアル内にいる死んだハエの数を数え、この数を死亡数として記録します。次に、ビデオカメラを三脚に設置します。250 mLメスシリンダーの190 mLの線に、カメラのピントを非常に軽く合わせます。シリンダーを、閉細胞フォームパッドに5〜10回、ショウジョウバエが内側の底面に移動するのに十分な強さで叩きます。次に、もう一方の手でカメラの録画ボタンを押します。録画中に、シリンダーをリズムのない明確なパターンで6回叩きます。ハエを最後にタッピングした時点から2分間、各試行を実施します。最後に、ハエを95% ethanolで処理して廃棄します。1回の試行が完了したら、群間の運動能におけるわずかな差を検出するため、毎回20匹の新しいハエを用いて、この登攀アッセイを10回繰り返します。シリンダーを食器洗い機で洗浄し、一晩乾燥させて、実験完了後のハエのパフォーマンス分析に再利用してください。まず、各ハエの試験記録ビデオを視聴します。10秒ごとにターゲットラインを通過したハエの総数を記録します。ハエが再び降りてきたり落下したりした場合は、そのハエをマイナス1として記録し、次にターゲットラインを通過したハエを、降りてきたか落下したハエと同じ番号としてカウントしてください。例えば、15匹目のハエがターゲットラインを下回った場合、次にラインを越えたハエを16匹目ではなく15匹目とみなします。その後、ハエの総数から死亡数を差し引き、試験区に残っているハエの数を算出します。重篤な変異を扱う際、各時点でのターゲットラインより上のハエの割合を算出することで、異なるクライミングアッセイを用いて、さまざまな程度の登攀能欠損を確認することができます。ここでは、18秒後に空の餌 vial の上部まで登った8日齢のハエの数を記録しましたが、2つのグループ間で登攀行動に有意な差は見られませんでした。一方で、本プロトコルの登攀アッセイを用いると、Bastin 17-7/TM3 変異ハエはコントロールと比較してパフォーマンスの低下を示します。多くの運動機能障害は進行性であるため、ハエの経時的な変化を観察することが重要です。生後2日目において、ターゲットラインより上に登ったハエの数に有意な差が見られます（コントロール群と比較して）。この登攀能力は、変異体のハエが生後2日からさらに加齢するにつれて低下し続けます。習得後は、この実験と分析を3時間で完了することができます。このビデオを視聴することで、神経疾患のdola変異体モデルにおける運動機能不全の定量化方法について、十分に理解できるはずです。

quantitative-analysis-climbing-defects-drosophila-model

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

測定運動機能、学習、およびメモリ能力のための行動アッセイ...

でアッセイする運動、学習、記憶障害ショウジョウバエ</em神経変性の>モデル

このビデオでは、ハエの移動を定量化する簡単な方法と、実施されたクライミングアッセイを示しています。フライクライミングアッセイは、ジオタクシスの負の反応に依存する運動機能の一般的なテストです。...

フライクライミングアッセイ:Drosophila melanogasterの一般的な移動をテストする方法

ここでは、ドーパミン作動性に（DA）ニューロンの年齢依存性神経変性を研究するために設立されている2つのアッセイを記述する...

神経変性表現型を評価する<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;クライミングアッセイによりドーパミン作動性ニューロンと脳全体の免疫染色

ショウジョウバエは広く神経変性を研究するためのモデル系として使用されます。このプロトコルは、脳内の空胞の形成によって決定されるように、定量化可能な変性方法を記載しています。それはまた、一つのサンプルとして処理し、切片化対照および実験ハエによる実験手順に影響を最小限に抑えることができます。...

に神経変性を定量化するために、マス組織学<em&gt;ショウジョウバエ</em

このステップ バイ ステップのプロトコルは、ハエの数百をホストし、電気モーターで彼らの行動を同期自動マルチ シリンダー システムを用いたショウジョウバエ負の走動作を分析します。試金飛ぶ負走動作同期、デジタル記録および自己設計されていた RflyDetection...

神経変性のショウジョウバエモデル アダルト登山行動を分析するための自動化された迅速な反復負走アッセイ

このプロトコルは当てて神経細胞樹状パターン形成の複雑さ (NDAC)...

ショウジョウバエのニューロン樹状分枝複雑さの定量解析

蛋白質の集合とのショウジョウバエモデルの中枢神経系におけるオートファジーのフラックスの蛍光イメージングによる細胞生物学的研究から定量的なデータを抽出する単純なと適応のワークフローを開発しました。神経変性疾患。...

ImageJ を用いた蛍光タグ付きタンパク質の公平な分析によるショウジョウバエの神経変性の定量細胞生物学

神経変性と関連した成人 ショウジョウバエ におけるシナプス変性の可視化

本プロトコルは、オープンソースソフトウェアフィジーを使用して手作りのアリーナでのハエの動きを追跡および分析することにより、ショ ウジョウバエ...

ショウジョウバエの自発運動活性をアッセイする簡単な技術

このプロトコルはパーキンソン病のアルファ シヌクレインによって基づくショウ ジョウバエ モデルの模倣の便秘のための試金を示す。...

パーキンソン病のショウ ジョウバエ モデルにおける便秘の測定

このプロトコルは、従来の哺乳類モデルに代わるものとして、自発運動機能障害の定量化を通じてショウジョウバエの神経毒性を評価するためのハイスループットで費用対効果の高い方法を提供します。これは、高感度で再現性があり、倫理的に有利なモデルを使用して、医薬品化合物、環境剤、または遺伝子組み換えの神経毒性効果を評価することを目的としています。...

神経毒性のリードアウトとしての Drosophila melanogaster の自発運動機能障害の行動解析

学ぶ神経変性疾患研究におけるショウジョウバエのクライミング欠陥定量分析法。Drosophila melanogasterを用いた負の走地性アッセイにより、軽微な運動障害を検出し、遺伝的相互作用や薬物標的のスクリーニングに活用できます。

神経変性疾患のショウジョウバエモデルにおけるクライミング欠陥の定量分析

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