神経変性疾患のショウジョウバエモデルにおけるクライミング欠陥の定量分析
June 13th, 2015
私たちは、神経変性疾患のモデルとして、Drosophila melanogasterにおける最適化された安価で信頼性の高いネガティブジオタキシスアッセイを提示します。軽度の自発運動障害に対してより感受性が高いため、このアッセイは潜在的な遺伝的相互作用と薬物標的のスクリーニングに役立ちます。
この手順の全体的な目標は、野生型のハエと移動に関与する遺伝子の突然変異体であるハエの登坂能力を定量化することです。これは、最初にハエをガラス製のメスシリンダーに移すことによって達成されます。2番目のステップは、フォームパッドの上でシリンダーを軽くたたくことにより、ハエをシリンダーの底に移動させることです。
次に目標線を越えるハエは、ビデオカメラを使用して2分間記録されます。最後のステップは、ビデオを分析し、10秒ごとにターゲットラインより上のハエの数をプロットすることです。最終的に、クライミングアッセイは、ショウジョウバエの変異系統のクライミング能力の欠陥を特定するために使用されます。
この技術、またはワイルド法などの既存の技術の主な利点は、登山能力のわずかな違いを検出する能力を持っていることです。この方法は、進行性歩行障害に対する遺伝性痙性対麻痺に対する特定の遺伝子の役割など、神経変性疾患の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の意味は、治療法の発展に向かう傾向があります。
それは候補神経変性遺伝子のための薬物応答と突然変異体をテストするための簡単な定量的アッセイを提供するため、神経障害のためのIPは、二酸化炭素を使用して20ハエを麻酔することから始め、すべてのハエを食物を含む25ミリメートル×95ミリメートルのコレクションバイアルに入れます。次に、ハエが入ったバイアルを段ボールのトレイに水平に保管して、バイアルの底にハエが溜まる可能性のある液体にハエが閉じ込められないようにします。翌朝、ハエをインキュベーターに少なくとも21時間置き、12時間の明るい暗いサイクルで、バイアルからハエを250ミリリットルのガラスメスシリンダーに移してクライミングアッセイを設定し、ハエの脱出を防ぐために上部をワックスフィルムで密封します。
摂氏22度、湿度40%の周囲光で実験を行います。睡眠サイクルとの混乱を避けるために、常に同じ時間に実験を行ってください。また、ベンチトップ上のシリンダーの位置をマークして、毎日一定に保ちます。
シリンダーの底と食品バイアルで死んだハエの数を数え、この数を死亡率として記録します。次に、ビデオカメラを三脚にセットします。190ミリリットルのメスシリンダーの250ミリリットルラインにカメラの焦点を合わせます。
独立気泡フォームパッドに対してシリンダーを5〜10回軽くたたいて、フライを内側の底面に移動するのに十分な力で叩きます。次に、もう一方の手を使用してカメラの録画を押します。次に、カメラが録画している間、シリンダーを明確な非リズミカルなパターンで6回タップします。
各試行は、ハエが最後にタップされた時点から2分間実施します。最後に、ハエを95%エタノールで処分します。試験が完了したら、グループ間の移動運動のわずかな違いを検出するために、毎回20匹の新鮮なハエを使用してこのクライミングアッセイを10回繰り返します。
シリンダーを食器洗い機で洗い、一晩乾かして、実験が完了したらフライのパフォーマンスを分析して再利用し、各フライトライアルレコードのビデオを見ることから始めます。10 秒ごとに目標ラインを通過するハエの総数。ハエが再び下降または落下した場合は、そのフライをマイナス 1 として記録し、次にターゲットラインを越えるフライを、再び降下または落下したフライと同じ数としてカウントします。
たとえば、15 番目のフライがターゲット ラインを下回った場合、次にラインを越えるフライは 16 番目のフライではなく 15 番目のフライと見なされます。次に、ハエの総数から死亡率を差し引いて、試行プロットに残っているハエの数を求めます。重篤な突然変異を扱う場合の各時点での目標線より上のハエの割合は、異なるクライミングアッセイを使用して異なる程度のクライミング欠陥を確認することができます。
ここでは、18秒後に空のフードバイアルの上部に登った生後8日のハエの数が記録され、2つのグループ間で登る行動に有意差がないことが示されました。一方、このプロトコルからのクライミングアッセイを使用することにより、Bastin 17 dash seven over TM three 変異型ハエは、対照と比較して性能の欠損を示します。多くのロコモティブ障害は進行性であるため、ハエの経時的な進化を観察することが重要です。
生後2日で、目標線より上に登るハエの数には大きな違いがあります。コントロールとの比較。この上昇性能は、突然変異体のハエが2日から数日経過するにつれて低下し続けます。
この実験と分析をマスターすれば、3時間で完了することができます。このビデオを見た後、神経障害の dola 変異体モデルにおける機関車の欠陥を定量化する方法について十分に理解できるはずです。
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概要
この記事では、ショウジョウバエを用いた最適化された、安価で信頼性の高い負の重力走性アッセイを紹介します。このアッセイは神経変性疾患のモデルとして機能し、軽度の運動機能障害により敏感に設計され、潜在的な遺伝的相互作用と薬物標的のスクリーニングに役立ちます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 行動アッセイ
- 遺伝学
背景
- ショウジョウバエは神経生物学で広く使用されているモデル生物です。
- 負の重力走性アッセイは果実蠅の登攀能力を測定します。
- 運動機能障害の特定は神経変性疾患への洞察を提供できます。
- 遺伝子変異は運動に影響を与え、このアッセイを研究に価値あるものにします。
研究の目的
- 野生型および変異型ショウジョウバエの登攀能力を定量化すること。
- 特定の遺伝子変異に関連する登攀能力の欠陥を特定すること。
- 運動機能に関連する潜在的な遺伝的相互作用と薬物標的をスクリーニングすること。
使用された方法
- ハエをガラス製量筒に移します。
- 筒を軽く叩いてハエを底に移動させます。
- ビデオカメラを使用して、2分間ハエがターゲットラインを越える回数を記録します。
- ビデオを分析して、10秒ごとにターゲットラインを越えるハエの数をプロットします。
主な結果
- このアッセイは野生型および変異型ハエの登攀能力を正確に定量化します。
- 軽度の運動機能障害に対する感度を示します。
- 結果は潜在的な遺伝的相互作用と薬物標的に関する情報を提供します。
- この方法はスクリーニング目的には信頼性が高く、費用対効果に優れています。
結論
- 負の重力走性アッセイはショウジョウバエの運動機能を研究するための価値あるツールです。
- 神経変性疾患に影響を与える遺伝的要因を特定するのに役立ちます。
- この方法は治療標的をスクリーニングする能力を向上させます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This assay provides a sensitive, cost-effective method for detecting early locomotor defects in Drosophila models of neurodegenerative disorders, enabling earlier identification of genetic modifiers and therapeutic candidates. By quantifying climbing performance over time, it supports mechanistic de-risking of target hypotheses in discovery pipelines. The method’s reproducibility and scalability make it suitable for screening campaigns aimed at validating disease-relevant mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in locomotion pathways relevant to neurodegenerative disease models.
- Operational Value: Provides quantitative, time-resolved phenotypic readouts for assessing mutant or drug-treated fly performance.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Detects mild climbing defects that may be missed in standard assays, increasing sensitivity for early-stage screening.
- Operational Value: Uses inexpensive, reusable glass cylinders and minimal training, supporting high-throughput compatibility.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Tracks age-dependent decline in climbing ability, modeling progressive locomotor dysfunction seen in human neurodegeneration.
- Operational Value: Generates longitudinal data to evaluate therapeutic intervention effects over time in preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within early discovery workflows, supporting target validation and lead identification by linking genetic perturbations to quantifiable behavioral phenotypes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring locomotor output as a functional readout of neuronal integrity.
- Screening: Enables reproducible quantification of fly climbing to assess compound or genetic modifier effects.
- Analytics: Generates time-series data on fly position, allowing calculation of climbing velocity and endurance metrics.
- Translational Research: Models progressive decline in motor function, aligning with preclinical evaluation of disease-modifying candidates.
- Enterprise Reuse: Standardized protocol allows reuse across multiple mutant lines and screening campaigns with minimal revalidation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking genotype to quantifiable locomotor phenotype.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized tapping, video capture, and blind analysis protocols.
- Strategic Value: Reduces false negatives in early screening by detecting subtle defects, improving hit-to-lead efficiency.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on phenotypic severity and progression.
Implementation Considerations
- Requires basic fly handling and anesthesia skills using CO2.
- Needs a 250 mL glass graduated cylinder, wax film seal, foam pad, tripod, and video recording device.
- Demands consistent environmental conditions (22°C, 40% humidity, same time of day) to minimize variability.
- Requires training in video analysis to score fly crossings and handle falls or reversals correctly.
- Limited to measuring negative geotaxis; does not assess other motor behaviors like flight or gait coordination.
