Name: 「マスト細胞ノックイン」マウスを用いた生体内肥満細胞の機能解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 学ぶマスト細胞ノックインマウスを用いた生体内機能解析法。骨髄由来培養マスト細胞を欠損マウスに移植し、フローサイトメトリーと免疫組織化学で解析します。この手法はマスト細胞の生理・免疫・病理学的役割を直接評価できます。

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N.G.はフランスの「フォンダシオンは、ラ・レシェルシュ・メディカルFRMを注ぐ」とフィリップ財団からのフェローシップの受領者です。R.S.は、ルシル・パッカード小児健康財団とスタンフォードNIH/NCRR CTSA賞番号UL1 RR025744によってサポートされています。P.S.はマックスケイド財団のマックスケイドフェローシップとオーストリア科学アカデミー、オーストリア科学基金(FWF):J3399-B21のシュレーディングフェローシップによってサポートされています。S.J.G.は、国立衛生研究所の助成金U19 AI104209、NS 080062、およびカリフォルニア大学のタバコ関連疾患研究プログラムからの支援を認めています。L.L.R.は、関節炎国立研究財団(ANRF)と国立衛生研究所助成金K99AI110645からの支援を認めています。

すべての動物のケアと実験は、国立衛生研究所のガイドラインに従い、スタンフォード大学の制度的動物ケアと使用委員会の具体的な承認を得て行われました。
1. 骨髄由来培養マスト細胞(BMC)の生成と特性評価
注:ドナーBMCCsは、レシピエントMC欠損マウスと同じ遺伝的背景の骨髄細胞から生成されるべきである。男性由来ドナーBMCは、雌マウスの生着には適していない。女性由来ドナーBMCは、男性と女性の両方のレシピエントに正常に生着します。
<ol><li>骨髄抽出.<ol>
<li>滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を6ウェル培養プレート(1回1個)に注ぎ、氷の上に置きます。</li>
		<li>解剖器を70%エタノールに浸して殺菌する。</li>
		<li>二酸化炭素(CO2)吸入によってドナーマウスを安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を行い、その後、操作部位に70%エタノールをマウスに噴霧する。</li>
		<li>骨の骨の骨を切断せずに大腿骨、脛骨および脛骨を抽出するために無菌解剖器を使用してください。</li>
		<li>鉗子で骨を固定しながら、滅菌はさみ(またはメスの刃)を使用して骨からすべての組織を削り取る(そしてフィブラを捨てる)。すべての骨が収集されるまで氷の上にPBSに骨を置きます。</li>
		<li>滅菌組織培養フード内の残りのステップをすべて実行します。滅菌器具を使用して、鉗子で骨を固定し、髄腔を露出させるために両方の骨を切断する。</li>
		<li>3 ml注射器および30G針を使用し、冷たい紅潮媒体(Dulbecco修正イーグルミディアム[DMEM]10%胎児子牛血清[FCS、熱不活性化]、2 mM L-グルタミン、1%抗生物質抗ミコティック溶液、50μM β-メルカプトエタノール)を使用して、赤骨髄をペトリ皿に洗い流す。</li>
		<li>穏やかな吸引と放出を繰り返すことによって、フラッシュされた骨髄細胞クラスターを解負するために同じシリンジを使用してください。</li>
		<li>各マウスから15ml遠心分離管に大腿骨および脛骨骨髄をプールする。4°Cで5分間、骨髄細胞と遠心分離機を400xgで洗浄するために冷たい紅潮媒体でチューブを充填します。</li>
	</ol></li>
	<li>BMC文化。<ol>
<li>上清を除去し、10mlの培養培地でペレット化された骨髄細胞を回収する(DMEMは10%の胎児の子牛血清を補充した[FCS、 [熱不活化]、2 mM L-グルタミン、1%抗生物質抗抗酸溶液、50 μM β-メルカプトエタノールおよび20%WEHI-3細胞調整培地[IL-3の供給源として;代わりに10 ng/mlで組み換えマウスIL-3を使用]。</li>
		<li>適切なサイズの組織培養フラスコに細胞を入れる(例えば、1匹のマウスのT25、2匹のマウスの場合はT75など)。</li>
		<li>めっき後1~2日後、培地および懸濁細胞(フラスコの底に付着した破片や付着細胞を残す)を新しいフラスコに移し、新鮮な培養培地(10ml/マウス)を加える。</li>
		<li>次の週の間に、3〜4日毎に細胞を供給する(1つのマウスにつき10mlの培地を加える)。2.5 x 105-1 x 106 細胞/mlの間で細胞密度を維持します。培養フラスコに付着細胞が存在しなくなるまで、非接着性細胞を週に1回新しいフラスコに移す。 インビトロ アッセイまたはMC欠損マウスへの生着に使用する前に細胞の成熟度(下記参照)をテストする。 注: BMC の完全な差別化には 4~6 週間かかります。</li>
	</ol></li>
	<li>BMCMCの成熟度の評価。<ol>
<li>
フローサイトメトリーを使用する。
		<ol>
<li>5 ml ポリスチレンラウンドボトムチューブで、氷冷 FACS バッファー (PBS、 0.5% FCS) でセル(5 x 104-5 x 10 5 セル/条件) を洗浄します。4°Cで5分間400×gで遠心分離機。 吸気上清。</li>
			<li>FACSバッファーに薄い抗マウスCD16/32(クローン93または2.4G2)モノクローナル抗体1:200(2.5 μg/ml)を希釈。各ペレットに10μlを加え、短いボルテックスで再中断します。氷上で5分間インキュベートし、Fc結合をブロックします。 注: 残りのすべてのステップで、直接光からサンプルを保護します。</li>
			<li>希薄なフィコエリスリン(PE)共役抗マウスFc εRI α(クローンMAR-1)1:200(1 μg/ml)およびフルオレセインイソチオシアネート(FITC)共役抗マウスキット(CD117; クローン2B8)1:200(2.5μg/ml)(「染色溶液」)、またはFACSバッファ内のそれぞれの標識アイソタイプ対照抗体(「アイソタイプ制御溶液」)</li>
			<li>ブロックされた細胞の半分をステップ1.3.1.2)から追加のポリスチレン丸底管に分割し、1つのチューブに20 μlの「染色液」を、もう一方のチューブに「アイソタイプ制御溶液」を20 μl加えます。氷の上で30分インキュベート。</li>
			<li>400 x g で 3 ml の氷冷 FACS バッファーと遠心分離機を 5 °C で 5 分間追加します。 上清を捨て、ヨウ化プロピジウム1μg/ml(PI、死細胞の同定用)を含む300μl FACSバッファー内のペレットを再懸濁します。フローサイトメトリー解析に進みます( 図2Aを参照)。</li>
		</ol>
</li>
		<li>トルイジンブルー染色を用いた。<ol>
<li>1 x 105 細胞をPBSで1回、400 x gで400 x gで遠心分離して室温で5分間洗浄し、PBS 200 μlで細胞を吸引して再懸濁します。</li>
			<li>細胞懸濁液を顕微鏡スライドに取り付けた準備された細胞漏斗に移し、細胞遠心分離機(40xg)を用いて細胞遠心分離を進める。</li>
			<li>空気乾燥スライドは10分間、PAPペンを使用して細胞の周りにワックスサークルを描きます。細胞を覆うために0.1%トルイジンブルー溶液を追加します。1分間インキュベートします。水道水でスライドを1分間洗浄し、10分間空気乾燥スライドします。</li>
			<li>取り付け媒体を使用したカバースリップセル。軽顕微鏡分析に進みます( 図2Bを参照)</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. 肥満細胞欠損マウスのBCMCによる生着
<ol><li>皮内(i.d.)注射による耳の生着。 注:MC欠損マウスの耳のピナエへのBMCCCsの採用移行については、耳のピナあたり1 x 106 細胞(合計2 x 106 細胞)の2回の注射を行うことをお勧めします。MC欠損マウスの耳のピナエへのBCMCの皮内生着は、受動皮膚アナフィラキシー(PCA)24,27、宿主防御28、および慢性過敏症(CHS)反応29,30を含むいくつかのモデルにおいて多くの研究者によって使用されてきた。<ol>
<li>セルを 4 x 107 の BMCCs/ml (1 x 106 BMCCcs/ 25 μl) で冷たい DMEM でカウントおよび再懸濁します。BMCMC溶液を30G針を装備した1mlシリンジに移します。注射まで氷の上に保管してください。</li>
		<li>イゾフルラン(2.5%v/v)を使用して4〜6週齢のMC欠損マウスを麻酔する。つま先ピンチで麻酔の深さを確認し、指示された場合はイオブルランを調整し、手順全体を通して呼吸とつま先のピンチ応答を監視し続けます。眼の乾燥を防ぐためにQチップで眼科軟膏を塗布してください。</li>
		<li>人差し指で、耳のピナの背側面に垂直圧力を加え、腹側の顔を露出して伸ばします。</li>
		<li>耳のピナの腹側面の2つの異なる部位にBMCMC溶液の2つの25 μl i.d.注射を行い、耳の真ん中に最初の注射を行い、耳の先端に向かって2回目の注射を行います。 インビボ 実験を行う前に、i.d.の生着後4〜6週間待ちます。 注:我々の経験では、その時点で、耳のピナの中央部の真皮のMC/mm2の数は、一般的に野生型マウスの対応する位置と同様であるのに対し、耳のピンネの周囲のMC/mm2の数は、典型的には、対応する野生型マウス27,28の中のMC/mm2の数よりもかなり低い。このようなMC生着マウスを用いた実験を設計する際には、このことを念頭に置く必要があります(例えば、MC機能に影響を及ぼす可能性のある薬剤を耳のピナエの中央部に注入し、そのような治療の効果の分析もその領域に焦点を当てる必要があります)。</li>
	</ol></li>
	<li>腹腔内注入による腹腔の生着(すなわち)注射。 注:MC欠乏マウスの腹腔へのBMCCCsの導入は、マウスあたり2 x 106 細胞の1回の注入を必要とする。このようなi.p.MMC欠損マウスへのi.p.注射は、様々なモデルにおける腹膜MCの役割を研究するために多くのグループによって使用されてきたが、毒素31 または細菌敗血症32,33に対する宿主防御のモデルを含む。<ol>
<li>適切な数のセルをカウントし、冷たいDMEMで1 x 107 のBMCCS/ml(2 x 106 BMCCcc/ 200 μl)で再懸濁します。BMCMC溶液を25G針を装備した1mlシリンジに移します。注射まで氷の上に保管してください。</li>
		<li>4-6週齢のMC欠損マウスの腹腔内に200μl BMCMc溶液を1回注入します。 インビボ 実験を行う前に、i.p.の生着後4〜6週間待ちます。</li>
	</ol></li>
	<li>静脈注射による生着(i.v.)注射。 注:MC欠損マウスへのi.v.インジェクションによるBMCCsの導入は、マウスあたり5 x 106 細胞の1回の注入を必要とする。MC欠損マウスへのBMCの静脈内(i.v.)注射は、膀胱感染34、喘息35、肺線維症36、および抗体媒介性関節炎37のモデルを含む様々な疾患モデルにおけるMCの役割を研究するために多くのグループによって使用されてきた。<ol>
<li>適切な数のセルをカウントし、コールド DMEM で 2.5 x 10 7 BMCCs/ml (5 x 10 6 BMCCs/200 μl) で再懸濁します。BMCMC溶液を30G針を装備した1mlシリンジに移します。注射まで氷の上に保管してください。</li>
		<li>イゾフルラン(2.5%v/v)を使用して4〜6週齢のMC欠損マウスを麻酔する。つま先ピンチで麻酔の深さを確認し、指示された場合はイオブルランを調整し、手順全体を通して呼吸とつま先のピンチ応答を監視し続けます。眼の乾燥を防ぐためにQチップで眼科軟膏を塗布してください。</li>
		<li>MC欠損マウスの尾静脈(または、あるいは、レトロ軌道静脈)に200 μlのBMCMC溶液を1回注入します。 インビボ 実験を行う前に、i.v.の生着後12週間待ちます。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 移植されたマスト細胞欠損マウスの分析
<ol><li>耳の生着分析。<ol>
<li>実験の終わりに、マウスをCO2 吸入し、続いて子宮頸部脱臼によって安楽死させる。</li>
		<li>耳のピンネーを分離し、4°Cで一晩10%(vol/vol)緩衝ホルマリンに固定します。 パラフィンに固定された耳のピナエを埋め込み、耳のピネの4μmのセクションをカットし、ガラススライドにマウントします。</li>
		<li>スライドを室温で1分間0.1%のトルイジンブルー溶液で染色します。水道水でスライドを1分間洗浄し、室温で10分間空気乾燥スライドします。</li>
		<li>取り付け媒体を使用してカバースリップスライドし、次に光顕微鏡を使用してピンネー切片当たりの生着MCの数をカウントします。生着マウス と野生型 マウスの皮膚におけるMCの割合と分布を比較することにより、生着効率を評価する。</li>
	</ol></li>
	<li>腹腔生着解析。<ol>
<li>腹腔内の肥満細胞数の評価<ol>
<li>実験の終わりに、マウスをCO2 吸入し、続いて子宮頸部脱臼によって安楽死させる。腹腔を壊さずに、慎重にマウスの腹側皮を除去する。</li>
			<li>25G針を装着した5mlシリンジを使用して、腹腔内に5mlの冷たいまたは室温のPBSを注入します。冷たいPBSを使用して腹膜細胞を活性化するリスクを減らします(これは腹膜MC脱顆粒または腹膜洗浄液中のいくつかのMC由来製品のレベルを評価する際に非常に重要です)。腹膜細胞を収穫するために20秒間腹部のマッサージを行います。</li>
			<li>22G針を装着した5mlシリンジを用いて腹膜洗浄をゆっくりと吸引する。吸引洗浄の量を記録します(注入された体積の80%まで回復すると予想されます)。</li>
			<li>腹膜洗浄液を5mlポリスチレン丸底管に移し、遠心分離機を400 x gで4°Cで5分間移動させます。 吸気上清。400 μl の冷たい PBS でペレットを回収します。</li>
			<li>ヘモサイトメーターチャンバーを使用した腹膜細胞の総数をカウントする。フローサイトメトリー分析(ステップ1.3.1で説明されているように)に細胞懸濁液の半分を使用して、腹腔内の生着MCの割合およびマーカー発現を評価する。腹膜細胞の総数に MC の割合を掛けて、腹膜 MC の絶対数を求めます。</li>
			<li>ステップ1.3.2.2に記載されているように、残りの細胞で細胞遠心分離を行う。空気乾燥スライドは室温で10分間滑り、PAPペンを使用して細胞の周りにワックスサークルを描きます。</li>
			<li>希釈されていないMay-グリュンヴァルト染色液で細胞を5分間覆い、続いて室温で5分間PBSで洗浄します。ギムサ染色液を1:20に脱イオン水で覆い、室温で20分間インキュベートします。2回の水道水で2回洗浄し、その後、空気乾燥スライド。</li>
			<li>取り付け培地を用いたカバースリップ細胞、および(少なくとも400個の細胞を計って)光顕微鏡を用いて、生着したMCの割合を計算する。生着マウス と 野生型マウスの腹膜洗浄におけるMCの割合を比較することにより、生着効率を評価する。</li>
		</ol>
</li>
		<li>腸間膜窓における肥満細胞の評価<ol>
<li>ステップ3.2.1に記載の腹膜洗浄に続いて、腹膜を切開してマウスの腸管を露出させる。スライドにマウスごとに4〜5個の腸間膜窓を配置します。</li>
			<li>カルノイ溶液(エタノール、クロロホルム、氷酢酸の3:2:1 vol/vol/vol)で1時間スライドを室温で固定します。空気乾燥スライドと腸を取り除きます (固定の腸間膜窓はスライドに取り付けられたままです)。</li>
			<li>Csaba(アルシアブルー/サフラニンO)染色液で室温で20分間の調製物を染色します。<ol>
<li>500mlのCsabaステインを作るために、1M酢酸ナトリウム溶液100mlを1MHClの120mlと混合して500mlの酢酸緩衝液を調製し、脱イオン水で500mlまで調製し、pHを1.42に調整します。次に、90mgのサフラニンを溶解し(赤で「成熟したMC」を識別する)、1.8gアルシアンブルー(青で「未熟なMC」を識別する)、2.4gの硫酸アンモニウムNH4Fe(SO4)2を500mlの酢酸緩衝液に溶解する。</li>
			</ol>
</li>
			<li>取り付け媒体を使用してカバースリップスライドし、次に、光顕微鏡を使用して、腸間膜窓あたりの生着MCの数をカウントします。生着マウス と野生型 マウスの腸間膜窓におけるMCの割合と分布を比較することにより、生着効率を評価する。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>I.v. 生着分析.<ol>
<li>実験の最後に、CO2 吸入によってマウスを安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼、および目的の組織(例えば 肺、皮膚または脾臓)を収穫し、4°Cでホルマリンを10%(vol/vol)緩衝したホルマリンで一晩固定する。</li>
		<li>パラフィンに固定組織を埋め込み、4μmのセクションをカットし、ガラススライドに取り付けます。スライドを室温で1分間0.1%のトルイジンブルー溶液で染色します。水道水でスライドを1分間洗浄し、10分間空気乾燥スライドします。</li>
		<li>取り付け媒体を用いたカバースリップスライド、および光顕微鏡を用いて、組織切片当たりの生着MCの数と分布を評価する。</li>
	</ol></li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

最初の説明 38 から約30年が経過したところで、"マスト セル ノックイン" アプローチは、MC が生体内で何ができるか、または何ができないかについての貴重な情報を提供し続けています。MCの機能は長い間アレルギーにおけるその役割に限定されると考えられていた。「マスト細胞ノックイン」アプローチを用いて生成されたデータは、MCが他の機能の中で、特定の病原体4,39または毒28,31に対する宿主防御において重要な役割を果たすことができるという証拠を提供することによって、この見解を変えたか、あるいは特定の免疫応答を抑制することができる29,34,40。
我々のプロトコル記述では、骨髄由来培養MC(BMC)の生成と生着に焦点を当てることにした。 しかし、MCは胚性幹細胞(胚性幹細胞由来培養MC[ESCCc])41から直接培養することもでき、また、遺伝的に適合する場合には、これらの細胞をMC欠損マウスへの生着にも...

マスト細胞(MC)は、多能性骨髄前駆物質1-3から生じる造血細胞である。骨髄の進入に続いて、MCの前駆体は、局所的な成長因子1-3の影響を受けて成熟したMCに発展する様々な組織に移行する。組織常駐型のMCは、皮膚、気道、胃腸管などのホスト環境のインターフェースに戦略的に位置し、外部侮辱に対する第一線の防御線として3-6と動作する。多くの場合、MCは「ベースライン」の表向きの特性と解剖学的位置に基づいてサブ分類されます。マウスでは、「結合組織型」のMC(CTMC)および粘膜MC(MC)1~3,7,8という2種類のMCが記載されている。CTMCは、しばしば、小脳および神経線維の近くに位置し、滑膜腔に存在し、MMCは腸内および呼吸粘膜1-3の上皮内位置を占める。
多くの方法論が、MC9-13の生物学的機能を研究するために適用されてきた。多くのグループは、細胞株(ヒトMCラインHMC114またはLAD215,16など)、インビトロ由来MC(ヒト末梢血由来MC17、マウス骨髄由来など)のいずれかを使用してインビトロアプローチに焦点を当てています。 培養したMC[BCMCs]18、胎児皮膚由来培養MC[FSCCs]19および腹膜細胞由来MC[PCMC]20)または異なる解剖学的部位から単離されたMC。これらのモデルはすべて、MC活性化に関与するシグナル伝達経路など、MC生物学の分子的詳細を研究するために広く使用されています。しかし、MC生物学の重要な側面は、その表現型および機能的特性(例えば、細胞質顆粒プロテアーゼ含有量または異なる刺激に対する応答)が解剖学的位置および微小環境2,7によって変調され得る点である。生体内で遭遇するこのような要因の正確な混合物は、in vitroで再現することが困難な場合があるので、我々は、MC機能9に関する洞察を得るためにin vivoアプローチを使用して好む。
遺伝的MC欠乏症を有する複数のマウス株が存在し、広く使用されているWBB6F1-キットW/W-vまたはC57BL/6-キットW-sh/W-shマウスなど。これらのマウスはKIT(CD117)の発現および/または活性を欠いているが、主MC成長因子幹細胞因子(SCF)21,22の受容体である。その結果、これらのマウスは深いMC欠乏症を有するが、また、c−キット突然変異(WBB6F1-キットW/W-vマウス)またはc-キット発現の減少をもたらす大きな染色体反転の影響(C57BL/6-キットW-sh-C-s)9,122222222222222222222年12月12日に関連する表現型異常を有する。さらに最近では、c-キット-独立した構成MC欠乏症を有するマウスのいくつかの株が24-26に報告されている。これらすべてのマウスおよびいくつかの追加の新しいタイプの誘導可能なMC欠乏マウスは、最近詳細に9,10,13で見直された。
ここでは、マウス骨髄由来培養MC(BMC)の生成方法、MC欠損マウスへの導入、異なる解剖部位における養子転移MCの数と分布の分析について述べた。このいわゆる 「マストセルノックイン」 法は 、生体内のMCおよびMC由来製品の機能を評価するために使用することができます。近年開発された代替アプローチに照らして、この方法の利点と限界について議論する。

<table><tbody><tr><td>1% 抗生物質-抗真菌剤溶液</td><td>Corning cellgro</td><td>30-004-Cl</td><td></td></tr><tr><td>3 ml シリンジ</td><td>ファルコン</td><td>309656</td><td></td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm ディッシュ</td><td>Corning cellgro</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>5 ml ポリスチレン丸底チューブ</td><td>ファルコン</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>酢酸 氷</td><td>河 フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>A35-500</td><td></td></tr><tr><td>アルシアンブルー8GX</td><td>Rowley Biochemical Danver</td><td>33864-99-2</td><td></td></tr><tr><td>Allegra 6R Centrifuge</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD16/32 (clone 93) 精製</td><td>eBioscience</td><td>14-0161-81</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>BD 1 ml TB シリンジ</td><td>BD シリンジ</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>BD 22 G x 1 (0.7 mm x 25 mm) ニードル</td><td>BDプレシジョングライドニードル</td><td>205155</td><td></td></tr><tr><td>BD 25 G 5/8 ニードル</td><td>BD シリンジ</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>BD 30 G x 1/2 ニードル</td><td>BD プレシジョングライド</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>ブルー MAX Jr, 15 ml ポリプロピレン コニカルチューブ</td><td>ファルコン</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>サイトシール 60 マウンティング ミディアム</td><td>リチャード・アラン・サイエンティフィック</td><td>8310-4</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin3</td><td>Shandon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>DakoCytomation ペン</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ モディファイド イーグル メディウム (DMEM) 1x</td><td>Corning cellgro</td><td>15-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sigma Aldrich E</td><td>7023-500ml</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 熱不活化</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4135-500ml</td><td></td></tr><tr><td>FITC 標識 IgG2b K ラット アイソタイプ コントロール</td><td>eBioscience</td><td>14-4031-82</td><td></td></tr><tr><td>フルオレセイン イソチオシアネート (FITC) 標識抗マウス KIT (CD117; クローン 2B8)</td><td>eBioscience</td><td>11-1171-82</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>F79-500</td><td></td></tr><tr><td>ギムサ染色 修飾</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>GS-1L</td><td></td></tr><tr><td>アイソセシア</td><td>ヘンリー・シャイン アニマルヘルス</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>May-Grunwald Stain</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MG-1L</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 6 well plates</td><td>Falcon</td><td>35 3046</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX60 Microscope</td><td>Olympus</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Plus Tissue Embedding Medium</td><td>Fisher Brand</td><td>23-021-400</td><td></td></tr><tr><td>PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control</td><td>eBioscience</td><td>12-4888-81</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 1x</td><td>Corning cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>フィコエリトリン (PE) 結合抗マウス FceRIa (クローン MAR-1)</td> <td>eBioscience</td><td>12-5898-82</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム染色溶液</td><td>eBioscience</td><td>00-6990-50</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス IL-3</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>Safranin-o 認証</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8884</td><td></td></tr><tr><td>組織培養フラスコ T25 25 cm2</td><td>Beckton Dickinson</td><td>353109</td><td></td></tr><tr><td>組織培養フラスコ T75 75 cm2</td><td>Beckton Dickinson</td><td>353110</td><td></td></tr><tr><td>トルイジン ブルー 1% 水性</td><td>LabChem-Inc</td><td>LC26165-2</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス SCF</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td></td></tr></tbody></table>

「マスト細胞ノックイン」マウスを用いた生体内肥満細胞の機能解析

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

マスト細胞(MC)は、様々な組織に存在する造血細胞であり、特に皮膚、気道、消化管などの外部環境に曝露される部位に豊富に存在する。IgE依存性アレルギー反応における有害な役割で最もよく知られているMCは、毒や侵入細菌や寄生虫に対するホスト防御の重要なプレーヤーとしても出現しています。MC表現型および機能は、解剖学的位置によって異なる可能性がある微小環境要因、または免疫応答の発達のタイプまたは段階に基づいて影響を受ける可能性がある。このため、MC機能に関する洞察を得るために、インビトロ法よりもインビボアプローチを支持してきました。ここでは、マウス骨髄由来培養MC(BMC)の生成方法、遺伝的MC欠損マウスへの導入、異なる解剖学的部位における養子転移の数と分布の分析について述べた。この方法は、"マストセルノックイン"アプローチと名付けられ、過去30年間、生体内のMCおよびMC由来製品の機能を評価するために広く使用されてきました。近年開発された代替アプローチに照らして、この方法の利点と限界について議論する。

「マスト細胞ノックイン」アプローチの概要を 図1に示し、BMCの生成、MC欠乏マウスに生着する細胞の数(実験計画に基づいて示された数を変更することができます)、および注入部位に応じて着実と実験の間隔(この場合は異なる場合)が含まれています。 例えば、MC細胞質顆粒中の保存されたメディエーターの含有量は、時間38と共に着実に増加する。 図2 は、IL-3の供給源として20%WEHI-3細胞条件培地に含有するDMEM培地における1、15および45日後のBMCの代表的なフローサイトメトリー分析およびトルイジンブルー染色を示す。なお、45日間培養したBMCMCは95%純粋で、多数の細胞質顆粒を含み、生着実験に使用できますが、15日間培養した細胞は生着に適していません。 図3 は、i.d.生着後4週間(図3A)、腸間膜窓(図3B)および腹腔(図3C)i.p.生着後6週間、およびi.vの生着...

イン ビトロ 由来肥満細胞の生成方法、肥満細胞欠損マウスへのそれらの生着、異なる解剖学的部位における生着マスト細胞の表現型、数および分布の分析について述べた。このプロトコルは、 生体内のマストセルの機能を評価するために使用することができます。

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

本手法の全体的な目的は、マスト細胞ノックインマウスを用いて、生体内（in vivo）におけるマスト細胞の機能を解析することです。これは、まず骨髄由来培養マスト細胞（BMC MCs）を生成し、それをマスト細胞欠損マウスに移植することで達成されます。次に、BMC MCsをマスト細胞欠損マウスのさまざまな解剖学的部位に養親移植し、マスト細胞ノックインマウスを作製します。最終的に、フローサイトメトリーおよび免疫組織化学的解析によって、養子移送されたマスト細胞の数と解剖学的分布を評価し、生着した集団が野生型マウスで見られるものとどの程度類似しているかを確認します。この手法の最大の利点は、生着した野生型または遺伝子改変マスト細胞集団の機能をin vivoで直接的に評価できる点にあります。したがって、本手法は、マスト細胞またはその産物が、生理的、免疫学的、あるいは病理学的プロセスのマウスモデル（ヒト疾患モデルを含む）の特性にどの程度寄与しているかという、マスト細胞生物学における重要な疑問を解決するのに役立ちます。一般的に、この方法を習得する際は、BM CMCの作製方法、注入部位、注入したBMC MCの数、および生体内実験を行う前の生着後の待機週数が、マスト細胞の生着と欠損の程度に影響を与えるため、困難を伴う場合があります。生着手順のいくつかの側面は、実際にどのように行われるかを正確に確認しなければ習得が難しいため、本手法の視覚的なデモンストレーションが極めて重要です。まず骨髄を抽出するために、滅菌済みの解剖器具を用いて、骨端を損傷しないように野生型マウスから大腿骨、脛骨、および腓骨を採取します。各骨を解剖する際、鉗子で固定し、余分な組織をすべて掻き出します。次に、骨を氷上のPBSに入れます。すべての骨を回収した後、滅菌済みの組織培養フード内に移し、骨を一本ずつ鉗子で固定して、両端の骨端を切り取り、髄腔を露出させます。次に、30ゲージの針を装着し、冷やした培地を満たした3 mLシリンジを使用して、各骨からすべての赤色骨髄を新しいペトリ皿に洗い出します。すべての骨の洗浄が終わったら、同じシリンジを用いて、緩やかな吸引と排出を繰り返すことで、骨髄細胞のクラスターを分散させます。次に、細胞懸濁液を15 mL遠心チューブに移します。チューブに冷やした洗浄用培地を満たし、細胞を遠心分離します。細胞ペレットを10 mLの培地で再懸濁します。次に、骨髄細胞を適切なサイズの組織培養フラスコに移します。1〜2日間の培養後、非接着細胞を新しいフラスコに移し、その後数週間はマウス1匹あたり10 millilitersの新鮮な培養培地を加えます。デモンストレーションで行っているように、3〜4日ごとに細胞に給餌してください。非接着細胞を週に一度、新しいフラスコに継代し、耳介への皮内移植に向けて接着細胞がなくなるまで培養します。BMC MCsを、冷えたDMEMを用いて4×10⁷ cells/mLの濃度で懸濁させます。次に、30ゲージの針を装着した1mLシリンジに細胞を吸引し、シリンジを氷上に置きます。次に、4〜6週齢のマスト細胞欠損レシピエントマウスの足先をピンチして、適切な麻酔深度を確認し、細胞を注入するために眼軟膏を塗布します。人差し指を使用して耳介の腹側を露出させ、伸ばし、耳の背側に垂直な圧力をかけます。その後、1 × 10⁶ 個の BMC MCs を耳の中央に 25 µL 皮内注射し、さらに同様に 25 µL を耳介の先端付近に2回目に注射します。腹腔内への移植を行うには、BMC MCsを冷えたDMEMを用いて1 × 10⁷ cells/mLの濃度で再懸濁します。次に、25Gの針を装着した1 mLシリンジを用い、200 µLの培地に含まれる2 × 10⁶個のBM CMCsを、マスト細胞欠損受容動物の腹腔内に注入します。静脈内移植を行う場合は、BM CMCsを冷えたDMEMを用いて2.5 × 10⁷ cells/mLの濃度で再懸濁し、200 µLの培地に含まれる5 × 10⁶個のBMC MCsを尾静脈から注入します。腹腔内移植から4～6週間後、25ゲージの針を装着した5 mLシリンジを用いて、レシピエント動物の腹腔内に冷PBSを5 mL注入します。腹部を20秒間マッサージして腹腔細胞を回収します。その後、22ゲージの針を装着した5 mLシリンジを用いて、腹腔洗浄液をゆっくりと吸引します。その後、腹腔洗浄液中のマスト細胞の割合および総細胞数を、フローサイトメトリーまたは組織化学的手法によって評価できます。腸間膜窓のマスト細胞を評価するには、腹膜を切開して腸管を露出させます。マウス1匹あたり4〜5個の腸間膜窓をスライドガラス上に配置し、カルノ固定液で1時間固定します。インキュベーションの最後に室温に戻し、スライドを風乾させて腸管を除去します。固定された腸間膜窓はスライドに付着したままとなります。最後に、室温で20分間、chaba染色液で標本を染色します。IL-3を添加したDMEMで1日、15日、45日間培養した後のBM CMCのフローサイトメトリー分析およびadine blue染色の結果を示します。45日間培養したBM CMCは95%の純度であり、細胞質顆粒を多く含んでいます。したがって、これらの培養細胞は移植実験に適していますが、これらの画像において15日間培養された細胞は適していません。皮内移植から4週間後の耳、腸間膜窓への移植、腹腔内移植から6週間後の腹腔、および静脈内移植から12週間後の肺における移植の成功が、予想通りに示されています。野生型マウスから単離した組織サンプルにはマスト細胞が存在していますが、マスト細胞欠損動物およびマスト細胞ノックインマウスではマスト細胞は検出されません。しかしながら、養子移設されたBMC MCsは、野生型動物で観察されるのと同様の部位に出現します。この手順を行う際は、生着から実験の解析までの間隔が、マスト細胞の注入部位によって異なることに留意することが重要です。生着した細胞が成熟し、生体内で最終的な局在に到達するまで十分な時間を確保するためには、このような間隔を遵守することが極めて重要です。このアプローチは、生体内においてどの細胞とその産物が何を行い、あるいは何を行わないかについて、これまで重要な情報を提供し、現在も提供し続けています。生きた動物を用いた研究には、専門的なトレーニング、実験プロトコルの適切な審査と承認、そしてこれらの手順を実施する際の動物の痛みやストレスを軽減するための配慮を含む、最高水準の動物愛護基準の厳格な遵守が必要であることを常に念頭に置いてください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ここで説明する乳腺炎をシミュレートするために、ニップルを介して、授乳中のマウス乳腺に注入されるリポ多糖体で技術は、一般的に細菌感染によって引き起こされる症状である。増加した核因子κB（NF-κB）シグナル伝達におけるリポ多糖注射の結果は、NF-κBルシフェラーゼレポーターマウスの生物発光イメージングを通して可視化した。...

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このビデオでは、肥満細胞の脱顆粒活性を測定するための比色分析を実演しています。肥満細胞によって放出された酵素は、基質を加水分解し、着色された製品を生成します。肥満細胞の脱顆粒活性は、細胞外への酵素の放出率を細胞内の総酵素含有量で正規化して測定しました。...

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このビデオは、成体マウスの腹腔から成熟結合組織型肥満細胞を単離するための腹膜洗浄法を示しています。初代免疫細胞の混合物を腹腔から単離すると、適切な培養条件下で肥満細胞の選択的増殖が行われます。...

マウス腹腔から初代肥満細胞を単離する技術

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マウスにおけるローカルアナフィラキシーの測定

本プロトコルの目的は、マスト細胞の分泌の機能的ゲノム解析を可能にする方法を開発することであった。プロトコルは、目的の遺伝子とcotrasfected蛍光レポーター遺伝子の放出を定量的に評価し、実時間に基づいて分泌顆粒の形態の分析。...

マスト細胞の分泌顆粒の調査。生からのエキソサイトーシスへ

浸潤しているマクロファージは、循環前駆細胞から成体組織に継続的に動員されるが、常在マクロファージは発達中に組織を播種し、前駆細胞からのさらなる入力なしに維持される。常在マクロファージの前駆細胞は最近同定された。ここでは、常在性マクロファージ前駆細胞の遺伝子運命マッピングのための方法を提示する。...

フローサイトメトリーによるマウス胚における赤血球系前駆細胞およびその子孫の同定

ここで体内のクローン解析運命マッピング、大動脈植と単離平滑筋細胞の詳細を使用して萌芽期および周産期のマウス大動脈を勉強するためのプロトコル。これらの多様なアプローチは、通常開発の萌芽期および周産期の大動脈の疾患の病態形成の調査を促進します。...

体内と組織や細胞植アプローチを使用して形態形成と胚および周産期の大動脈の病因を研究するには

ここでは、分離し、マウスの腹腔肥胖細胞を養うプロトコルを提案します。2 つのプロトコルの機能特性評価についても述べる: リリースされた β-ヘキソアミダーゼの比色定量に基づく細胞内 Ca2...

腹膜由来マスト細胞とその機能特性と Ca2 +の単離-イメージングと脱顆粒の試金

今回ナイーブ cd4 陽性 T 細胞 (T 細胞) の活性化、増殖、GM-CSF 骨髄 (BM) による th1 細胞分化・生体内で定量のためのプロトコル-由来樹状細胞 (Dc)。さらに、このプロトコルでは、BM と T 細胞の分離、DC 世代と DC および T...

メジャー ナイーブ cd4 陽性 T 細胞の活性化、増殖と骨髄由来樹状細胞による th1 細胞分化をIn Vivoマウス モデル

この記事では、バクテリオファージラムダの感染の蛍光標識されたバージョンを準備する手順を説明します...

細胞運命を以下に<em&gt; E大腸菌の</emラムダファージによる感染後&gt;

学ぶマスト細胞ノックインマウスを用いた生体内機能解析法。骨髄由来培養マスト細胞を欠損マウスに移植し、フローサイトメトリーと免疫組織化学で解析します。この手法はマスト細胞の生理・免疫・病理学的役割を直接評価できます。

「マスト細胞ノックイン」マウスを用いた生体内肥満細胞の機能解析

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