「マスト細胞ノックイン」マウスを用いた生体内肥満細胞の機能解析

以下の方法の全体的な目標は、肥満細胞ノックインマウスを用いてin vivoで肥満細胞の機能を解析することです。これは、最初に骨髄由来の培養肥満細胞、またはBMC MCを生成するか、肥満細胞欠損マウスに生着することによって達成されます。第2のステップでは、BMC MCを肥満細胞欠損マウスの様々な解剖学的部位に養子として移植して、肥満細胞ノックインマウスを作製します。

最終的に、養子移植された肥満細胞の数と解剖学的分布をフローサイトメトリーと免疫組織化学分析によって評価し、生着した集団が野生型マウスに見られるものにどの程度似ているかを評価します。この技術の主な利点は、生着壁型または遺伝子組み換えMA細胞集団のin vivoの機能を直接評価できることです。したがって、この方法は、MA細胞またはその産物が、ヒト疾患のモデルを含む生理学的、免疫学的、または病理学的プロセスのマウスモデルの特徴にどの程度貢献できるかなど、MA細胞生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。

一般に、この方法を学ぶ個人は、肥満細胞の生着と欠損が、BM CMCを生成するために使用される方法、注射の根源、注入されるBMC MCの数、および生着後1重量でin vivo実験を行うまでの週数によって異なる可能性があるため、苦労する可能性があります。この方法の視覚的なデモンストレーションは、生着手順の側面が正確に実行されない限り習得が難しいため、非常に重要です。最初に骨髄を抽出するには、滅菌解剖ツールを使用して、骨の骨端を口にすることなく、野生型マウスから大腿骨、脛骨、および腓骨を採取します。

各骨を解剖したら、鉗子で固定し、無関係な組織をすべてこすり落とします。次に、すべての骨が収集されたら、骨を氷上のPBSに置き、無菌組織培養フードに移し、次に一度に1つずつ、各骨を鉗子で固定し、両方の骨端を切り取って髄腔を露出させます。次に、30ゲージの針と洗い流す冷たい培地を装備した3ミリリットルの注射器を使用して、各骨からのすべての赤い骨髄を新しいペトリ皿に洗い流し、すべての骨を洗い流したら、同じ注射器を使用して、穏やかな吸引と排出を繰り返すことにより骨髄細胞クラスターを解離します。

次に、細胞懸濁液を15ミリリットルの遠心分離チューブに移します。チューブにコールドフラッシング培地を充填し、細胞を遠心分離します。細胞ペレットを10ミリリットルの培地に懸濁します。

次に、骨髄細胞を適切なサイズの組織培養フラスコに移します。1〜2日間の培養後、非付着性細胞を新しいフラスコに移し、次の数週間でマウスあたり10ミリリットルの新鮮な培養液を培地にします。3〜4日ごとに細胞を栄養補給することは、まさに実証されています。

非接着細胞を週に一度、耳栓のResusへの皮内生着のために付着細胞が残らなくなるまで、新しいフラスコに移します。BMC MCを冷DMEMで1ミリリットルあたり7セルの4倍10で懸濁します。次に、30ゲージの針を備えた1ミリリットルの注射器に細胞を吸引し、注射器を氷の上に置きます。

次に、生後4〜6週齢の肥満細胞欠損レシピエントマウスをトップピンチで適切な麻酔の深さを確認し、眼軟膏を塗布して細胞を注入します。人差し指を使用して、耳のピナーの腹面を露出させて伸ばし、耳の背面に垂直方向の圧力をかけます。次に、耳の中央に 6 つの BMC MC に 1 回 10 回の 25 マイクロリットルの皮内注射を 1 回行い、ピナーの先端に向けて 2 回目の 25 マイクロリットルの皮内注射を行います。

腹腔内投与の場合、生着により、BMC MCを10回で冷DMEM中の1ミリリットルあたり7細胞に再懸濁します。.次に、25ゲージの針を備えた1ミリリットルの注射器を使用して、200マイクロリットルの培地で6つのBM CMCに2回10を注入します マスト細胞欠損レシピエントの腹腔に静脈生着のために。BM CMCを冷DMEMで1ミリリットルあたり7細胞に2.5倍10で再懸濁し、次に尾静脈を介して200マイクロリットルの培地に6つのBMC MCに5倍10を注入します。

腹腔内生着の4〜6週間後に、25ゲージの針を備えた5ミリリットルの注射器を使用して、レシピエント動物の腹腔に5ミリリットルの冷たいPBSを注入します。腹部を20秒間マッサージして腹膜細胞を採取します。次に、22ゲージの針を備えた5ミリリットルの注射器を使用して、腹膜洗浄をゆっくりと吸引します。

腹膜洗浄液中の肥満細胞の割合と総細胞数は、フローサイトメトリーまたは組織化学によって評価できます。腸間膜窓の肥満細胞を評価するには、腹膜を切り開いて腸管を露出させます。マウスごとに4〜5個の腸間膜窓をスライドに配置し、その後、車の騒音溶液に1時間固定します。

インキュベーションの終わりに室温を加え、スライドを風乾し、腸を取り出します。固定された腸間膜窓はスライドに取り付けられたままになります。最後に、室温で20分間調製物をchaba染色溶液で染色し、1回の15日および45日の培養後のBM CMCのフローサイトメトリー分析およびオジンブルー染色を表すDMEMでは、ILを補充した3つのBM CMCが45日間および95%純度で培養され、多数の細胞質顆粒を含むことが示されています。

したがって、これらの培養細胞は生着実験に適していますが、15日間培養された細胞はこれらの画像には含まれていません。皮内、腸間膜窓の生着から4週間後の耳のペニーの生着成功、腹腔内生着の6週間後の腹腔、静脈生着の12週間後の肺の正常な生着が予想どおりに示されています。野生型マウスから単離された組織サンプルには肥満細胞が存在しますが、肥満細胞ノックインマウスの肥満細胞欠損動物には肥満細胞は検出されません。

しかし、養子縁組されたBMC MCは、野生型動物で観察されたものと同様の場所に現れます。この手順を試みる際には、生着と実験の研究の間隔が肥満細胞注入部位によって異なることを覚えておくことが重要です。生着した細胞が成熟し、最終的な位置の生体内を取り込むのに十分な時間を確保するために、このような間隔を尊重することが非常に重要です。

このアプローチは、mass cellとその製品がin vivoで何ができて何ができないかについての重要な情報を提供してきましたし、これからも提供し続けます。生きた動物を扱うには、特定のトレーニング、実験プロトコルの適切なレビューと承認、およびこれらの手順を実行する際の動物の痛みやストレスを軽減するための注意を含む、最高水準の動物ケアの厳格な遵守が必要であることを常に念頭に置いてください。