Name: 有害化学物質への曝露後の内皮細胞の遊走の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: 学ぶ 有害化学物質が内皮細胞の遊走に与える影響を、改良型回避チャンバーアッセイや傷治癒アッセイ、細胞追跡法、ミトコンドリア膜電位測定を用いて評価する方法です。創傷治癒障害の治療戦略開発に貢献します。

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この作業はドイツ国防省(助成金番号M-SAB1-6-A009)によって資金提供されました。

以下のプロトコルは、初期の内皮細胞の移動の調査のための手法について説明します。血管内皮細胞の適切な培養は、内皮表現型の適切な増殖および維持を確実にするために、ゼラチンを用いた細胞培養フラスコのプレコーティングを必要とします。 細胞培養フラスコの1プリコート<ol><li> 0.1％の最終濃度になるように0.1 M PBS中のゼラチンを溶かします。 </li><li> （詳細は特定のオートクレーブの手順を参照するための）液体オートクレーブ処理のためのパラメータで溶液をオートクレーブ。 </li><li>無菌の細胞培養フラスコ（T25細胞培養フラスコのため、例えば、少なくとも5 ml）でのオートクレーブ処理ゼラチン溶液の十分な量を加えます。 </li><li>少なくとも30分間、インキュベーター（37℃、5％CO 2を必要としないが、干渉せず）内にフラスコを移し。 </li><li>残りのゼラチン溶液を除去します。その後プレコートフラスコを使用します（参照細胞培養）またはs使用するまで無菌条件下で引き裂きました。 </li></ol>初期の内皮細胞の2細胞培養注：以前に10,11説明したように胚性幹細胞由来の早期内皮細胞（EEC）はPECAM-1陽性細胞分画の磁気活性化細胞選別によって区別マウス胚様体から得ました。 <ol><li> DMEM中でゼラチン被覆細胞培養皿に培養EEC、15％FCS、50 U / mlペニシリン、50 U / mlのストレプトマイシン、200μMのL-グルタミン、100μMのβメルカプトエタノールおよび1％非必須アミノ酸を補充しました。無菌条件下で細胞を処理します。 37℃、5％CO 2で細胞を培養し、95％の湿度サブコンフルエンス（最大80％）になるまで。 </li><li> 5比：サブ合流点に、1でセルを分割します。注：内皮細胞の剥離は重要なステップです。 <ol><li> RTのACCUTASEで細胞を収穫。 、メディアを取り出し、PBSでリンスし、25単位cm ACCUTASEの1ミリリットルを追加します<sup&gt; 2。 </li><li>細胞が分離するまで、2〜10分間室温でフラスコをインキュベートします。細胞を分散し、所望のアプリケーションに転送します。注：播種した細胞は、37℃のインキュベーターに格納されている場合、それが起こるようACCUTASEの化学的中和は必要ありません。しかし、ACCUTASE活性もFCSを含むDMEMを添加することによって低下させることができます。 </li></ol></li></ol> 3.ボイデンチャンバー注：ボイデンチャンバーアッセイは8μmの孔径を有する光不透明なポリエチレンテレフタレートインサートシステムを使用して実行されます。 <ol><li>プレコートフィルターインサート（細胞培養ウェルの内部その適合は、このようにBoydenチャンバーを作成する）、少なくとも30分間、0.1 M PBSに溶解した0.1％ゼラチンを500μlを加えることにより。 </li><li>細胞は有毒化学物質にさらされる場合は、細胞収穫前に、特定の実験計画に応じて露光します。注：細胞を12.5μgのクロラムブシル/ mlのDMEMに曝露しました24時間。具体的な実験計画に関しては、命令が異なる場合があります。 </li><li>収穫EEC計数セルチャンバーを用いて細胞数を決定します。注：自動計数装置を使用することができるが、注意して使用する必要があります。マニュアル細胞計数は、より正確であり、強くお勧めします。 </li><li>ボイデンチャンバーの下室区画に500μlの細胞培養培地を追加します。 </li><li>上室区画にフィルタインサートあたり500μlの細胞培養培地中で正確に10 4 EECを追加します。気泡を除去します。 </li><li>正確に8時間、インキュベーターのフィルタインサートをインキュベートします。 </li><li> PBSで一度洗浄し、細胞固定のための25分間両方の区画に0.5ミリリットルの4％パラホルムアルデヒドを含む培地を交換してください。 0.1 M PBSでフィルターが、少なくとも3回洗浄します。 </li><li>メスで膜を切除。 </li><li>核staininのためにDAPIを含む封入剤を有する2つのガラスカバースリップ間の膜をマウントgです。向きに注意してください。膜の下室側に向かって移動した細胞のみがカウントされていることを確認します。 </li><li> 400Xの倍率で蛍光顕微鏡を用いて、膜の下室側に向かって移動した細胞をカウントします。移動した細胞（ 図1A、1B）との膜孔を混同しないでください。生物学的複製（条件当たり少なくとも3生物学的反復）の合理的な数を調査します。 </li></ol> 4.創傷治癒アッセイ<ol><li> DIC顕微鏡を使用する場合、プラスチック表面ベースの培養皿またはウェルプレートを回避するが、代わりにガラスベースのデバイスを使用します。利用可能な機器に依存して、慎重に細胞培養皿またはプレートを選択します。 注：位相差顕微鏡を使用している場合は、プラスチックベースの料理を使用することもできます。 </li><li>適切な細胞培養装置にEECを養う（ライブセルイメージングに適した例えば 4センチガラスボトムシャーレ）80％コンフルエンスになるまで。重要：合流を完了するために、細胞を培養しないでください。 </li><li>滅菌10μlのピペットチップを用いて単層を傷つけ。皿表面上にあまりにも多くの圧力なしそっと先端を押して、分離した細胞を除去するために、0.1 M PBSで二回other.Washに一方の側からスムーズに直線状に移動してください。 </li><li>培養皿に培地の十分な量を追加します。該当する場合は、調査する必要がある化合物を追加します。 注：15 NGを含む1.5 mlの培地/ mlのアルファリノレン酸を添加しました。 </li><li>ライブセルイメージングが可能な顕微鏡下で培養皿をマウントします。 5％CO 2、37℃、加湿雰囲気を確認してください。 注：加湿媒体の蒸発を避けるために特に重要です。 </li><li> 10分間隔で24時間かけてタイムラプス画像を取得します。大きなファイルサイズを計画します。注意：512×512ピクセルの解像度が通常は十分です。しかし、我々は、少なくとも1,024×1,0の画像を使用することをお勧めします24。 </li><li> = 0時間tでのギャップ幅を測定し、tの= 24時間顕微鏡で提供されるソフトウェアの長さツールを使用するか、オープンソースソフトウェア（ 例えば、ImageJの）を使用します。注意：一般に、特定の画像取得及び解析ソフトウェアは、製造業者によって提供されます。そのため、ソフトウェアの使用に関する技術的な詳細については、マニュアルを参照してください。 </li></ol> 5.細胞追跡<ol><li> DIC顕微鏡を使用する場合、プラスチック表面ベースの培養皿またはウェルプレートを回避するが、代わりにガラスベースのデバイスを使用します。利用可能な機器に依存して、慎重に細胞培養皿またはプレートを選択します。 注：位相差顕微鏡を使用している場合は、プラスチックベースの料理を使用することもできます。 </li><li>適切な細胞培養装置で補充したDMEM中に5×10 4 EEC種（ 例えば、24マルチウェルプレート）、37℃で1〜2日間、95％湿度、5％CO 2で細胞を養います。 </li><li>細胞は80にまで成長してきた場合には％コンフルエンス、それぞれの試験物質（例えば、12.5μgのクロラムブシル/ mlのDMEM）の存在下で、メディアと文化の新しいメディアで細胞を除去します。常に（個々のアッセイ系に依存して、24時間）一定時間、37℃での対照細胞（溶媒で処理し、 例えば、エタノール）が挙げられます。 </li><li>生細胞イメージング（37℃、5％CO 2及び95％湿度）が可能な顕微鏡下で培養皿をマウント。事前に定義された間隔で、24時間かけてタイムラプス画像を取得します。 10分間隔で画像を取得します。 </li><li> ImageJのプラグインMTrackJを使用して手動でEECの追跡を行います。視野からランダムに10個のセルを選択し、MTrackJのコマンドを「追加」を使用して時間内にポイント当たりのデータポイントを追加することで、その動きを追跡します。 </li></ol>注：MTrackJは[。Meijering、 Mtrackj「http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/」]で無料で利用可能で、ImageJがご利用できますです。ルで[Rasband、 ImageJの。 &quot;http://rsbweb.nih.gov/ij/&quot;]。MTrackJプラグインについての詳細なマニュアルは、「http://www.imagescience.org」で入手できます。 ミトコンドリア膜電位の6ライブセルイメージング/評価<ol><li> 80％のコンフルエンスまで適切な細胞培養装置（ライブセルイメージングに適した例えば 4センチガラスボトムシャーレ）にEECの育成。 重要：合流を完了するために、細胞を培養しないでください。 </li><li>該当する場合は、化学物質に細胞を公開します。注：細胞は、24時間12.5 / mlのクロラムブシルに曝露しました。具体的な実験計画に関しては、命令が異なる場合があります。 </li><li>テトラメチルDMSO中（TMRM）の10mMストック溶液を調製します。光から保護します。注：ストック溶液は-20℃で保存することができます。 </li><li> （：1,000希釈1）10μMの濃度での作業溶液に細胞培養培地中の原液を希釈します。光から保護しますできるだけ早く使用しています。注：作業溶液は、いくつかの時間（&gt; 1時間）室温で維持することができる、しかし、新鮮なワーキング溶液の調製を強くお勧めします。 </li><li> 1ミリリットルの作業溶液の新鮮な細胞培養培地（ローディング溶液）の2μlを添加します。 </li><li>ローディング溶液で細胞培養培地を交換し、細胞をロードします。 37℃、5％CO 2加湿雰囲気（インキュベーター）で15分間インキュベートします。注意：ほとんどすべての蛍光指示薬は、時間をかけて生細胞によってエクスポートされます。したがって、長期のロードまたは遅延解析を避けます。 </li><li>洗浄することなく、生細胞イメージングに適した顕微鏡下で皿を置きます。重要：蛍光指示薬は、したがって、不要な光の露出を避けるため、光に非常に敏感です。 </li><li>異なる画像間の比較可能性を確保するために取得パラメータを変更せずに画像を取得します。 </li></ol>

<ol><li>Bauer, S. M., Bauer, R. J., Velazquez, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis%2C+vasculogenesis%2C+and+induction+of+healing+in+chronic+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+and+Endovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis, vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds.</a> Vascular and Endovascular Surgery. 39, 293-306 (2005).</li>
<li>Reinke, J. M., Sorg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22European+Surgical+Research.+Europaische+Chirurgische+Forschung.+Recherches+Chirurgicales+Europeennes%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration.</a> European Surgical Research. Europaische Chirurgische Forschung. Recherches Chirurgicales Europeennes. 49, 35-43 (2012).</li>
<li>Hart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation.+1%3A+Its+role+in+the+healing+of+acute+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Inflammation. 1: Its role in the healing of acute wounds.</a> Journal of Wound Care. 11, 205-209 (2002).</li>
<li>Liu, Z. J., Hyperoxia Velazquez, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((endothelial+progenitor+cell+mobilization%2C+and+diabetic+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 10, 1869-1882 (2008).</li>
<li>Gallagher, K. A., Goldstein, L. J., Thom, S. R., Velazquez, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperbaric+oxygen+and+bone+marrow-derived+endothelial+progenitor+cells+in+diabetic+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular%22%5BJournal%5D)">Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing.</a> Vascular. 14, 328-337 (2006).</li>
<li>Kehe, K., Balszuweit, F., Steinritz, D., Thiermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+toxicology+of+sulfur+mustard-induced+cutaneous+inflammation+and+blistering%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering.</a> Toxicology. 263, 12-19 (2009).</li>
<li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+mustard+%28Chlorambucil%29+has+a+negative+influence+on+early+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Nitrogen mustard (Chlorambucil) has a negative influence on early vascular development.</a> Toxicology. 263, 32-40 (2009).</li>
<li>Steinritz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+N-acetyl+cysteine+and+alpha-linolenic+acid+on+sulfur+mustard+caused+impairment+of+in+vitro+endothelial+tube+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effect of N-acetyl cysteine and alpha-linolenic acid on sulfur mustard caused impairment of in vitro endothelial tube formation.</a> Toxicological Sciences. 118, 521-529 (2010).</li>
<li>Steinritz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorambucil+%28nitrogen+mustard%29+induced+impairment+of+early+vascular+endothelial+cell+migration+-+Effects+of+alpha-linolenic+acid+and+N-acetylcysteine%5BTitle%5D)+AND+%22Chemico-biological+Interactions%22%5BJournal%5D)">Chlorambucil (nitrogen mustard) induced impairment of early vascular endothelial cell migration - Effects of alpha-linolenic acid and N-acetylcysteine.</a> Chemico-biological Interactions. 219C, 143-150 (2014).</li>
<li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+endostatin+on+embryonic+vasculo-+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics+%3A+an+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis.</a> Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 230, 468-480 (2004).</li>
<li>Dainiak, M. B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cell+separations%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Biochemical+Engineering%2FBiotechnology%22%5BJournal%5D)">Methods in cell separations.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 1-18 (2007).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+VEGF-induced+endothelial+cell+migration+by+mitochondrial+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+physiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species.</a> American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+culture+conditions+on+endothelial+cell+growth+and+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness.</a> Tissue & Cell. 30, 525-530 (1998).</li>
<li>Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+substrates+for+human+umbilical+vein+endothelial+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry+%3A+Official+Publication+of+the+Biological+Stain+Commission%22%5BJournal%5D)">A comparison of substrates for human umbilical vein endothelial cell culture.</a> Biotechnic & Histochemistry : Official Publication of the Biological Stain Commission. 67, 241-250 (1992).</li>
<li>Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+probes+and+the+proton+gradient%3A+a+practical+usage+guide%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide.</a> BioTechniques. 50, 98-115 (2011).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

有害化学物質への皮膚暴露は、しばしば深刻な創傷治癒障害をもたらします。根底にあるメカニズムは不明な点が多いです。創傷治癒は、異なる位相（止血、炎症、増殖およびリモデリング）で構成され、複雑なプロセスです。細胞移動は、しかし、それは、肉芽組織の形成のために最も重要であり、すべての段階に関与しています。ここで、新しい血管が脈管の脈管形成またはいずれかによって形成されています。 両方のプロセスは、前駆体と早期内皮細胞の影響を受けない移動を必要とします。細胞遊走および乱れ細胞移動のための基礎となるメカニズムを解明の評価は、毒物誘発される創傷治癒障害に対する新たな治療戦略を開発するために、関連性の高いです。 細胞遊走は、異なるアプローチによって評価することができます。一般的に使用される技法は、本来の抗体antigを分析するために導入されたBoydenチャンバーアッセイでありますアンは、白血球13の走化性の原因となりました。このアッセイは、化学誘引物質に応答して、下部コンパートメントにトランスウェルインサートの上部コ...

細胞遊走は、皮膚損傷後の開発、様々な疾患、および創傷治癒を含む多くの生理学的および病態生理学的プロセスにおいて重要です。 皮膚損傷に続いて、炎症は、損傷または壊死組織および造粒予備創傷閉鎖を駆動し、脈管（小説形成）または血管新生（既存の小胞の出芽）1-3を介して、新しい毛細血管のネットワークの形成を可能にするが削除されます。 vasculo-と血管新生の両方が内皮細胞の移動を必要とします。血管の成長ネットワークは、最終的には角質化を受けるケラチノサイト増殖に酸素と栄養素を運ぶ新しい上皮を形成し、創傷閉鎖を提供するために不可欠です。 内皮細胞の障害の移行は、障害4,5創傷治癒の根底にある原因です。したがって、初期の内皮細胞の遊走を評価する方法がpathophysiolを探索するために必要とされます細胞遊走障害の術とは、治療的介入のための新規の戦略を特定します。 アルキル化剤（ 例えば、硫黄、窒素マスタード）への皮膚暴露は、障害6創傷治癒を引き起こします。このような化合物が原因政治的に不安定な地域や比較的単純な合成における既存の備蓄に強い懸念の理由を20世紀に、いくつかの紛争で化学兵器として使用され、残ってました。硫黄マスタードは、​​最初1822年に合成されたが、SM暴露の分子および臨床病理学を詳細に理解されておらず、SMの暴露のための解毒剤が同定されていません。 いくつかの研究は、理解し、SM暴露後障害、創傷治癒をモデル化するために、その効果を確保することができる潜在的な候補化合物を試験するために行われています。シュミットら （2009）は、MOUにおけるSMと同様の特性を持つアルキル化化合物をクロラムブシルの効果を試験しましたSE胚様体モデルおよび血管形成7の劇的な、時には99％以上の減少を発見しました。この副作用は、ほとんどの生理的条件下で、血管内皮前駆細胞の増殖および移動によって支配され、開発の段階で顕著でした。したがって、これらの細胞は、アルキル化剤に特に敏感であることが確認されました。 Steinritz ら （2010）に、マウス胚様体モデルにおいて、特にSMの毒性を低減する能力について、特に、N-アセチルシステイン（NAC）およびアルファリノレン酸（ALA）中の反応性酸素種（ROS）の捕捉剤をテスト血管形成8を復元します。一時的な保護効果は、過剰なROS形成は、創傷治癒にSMの副作用に貢献する可能性があったことを示し、観察されました。これらの効果は一時的なものであり、2つの候補化合物は、長期8の血管形成および創傷治癒を回復することが可能ではないかもしれません。 HoweveR、これらの実験は、細胞遊走の研究を可能にしました複雑な3Dモデルで行いました。従って、我々は、その後血管形成9の過程において重要な役割を持っているEECの細胞遊走に有益な効果のためにNACとALAをテストしました。 また、細胞極性、細胞遊走に必要とされるという証拠があります。 ROSの形成をもたらすミトコンドリア機能不全は、細胞極性を損なうことが示されたので、有害な細胞の移動に影響を及ぼし得ます。したがって、ミトコンドリア機能に関して、生細胞イメージングを行い、ROSスカベンジャーの効果を調べました。以下のプロトコルは、EEC、Boydenチャンバーアッセイ、細胞トラッキング解析および詳細におけるミトコンドリア機能の評価のためにTMRMの使用を含む創傷治癒アッセイの栽培のための一般的な要件について説明します。 EEC栽培と移行のための実験プロトコルの重要な側面が強調されています。

<table><tbody><tr><td>ボイデンチェンバー&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning FluoroBlok 組織培養(TC)処理インサート、24ウェル - 3 &micro;m</td><td>Corning Incorporated</td><td>#351151</td><td></td></tr><tr><td>Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC) 処理インサート、24 ウェル - 8 &micro;m</td><td>Life Sciences</td><td>#351152</td><td></td></tr><tr><td>(for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wound&nbsp; healing assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラス底皿</td><td>Word Precision Instruments, Inc.</td><td>#FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>ミトコンドリア電位</td><td></td><td></td><td></td>の評価</tr><tr><td>TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester)</td><td>Life Technologies</td> <td>#T669</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>PAA, Pasching, Austria</td><td># L11-007</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Linolenic</td><td>acid Fluka (Sigma), Steinheim, Germany</td><td>&nbsp;# L2376</td><td></td></tr><tr><td>Chlorambucil</td><td>Fluka (Sigma)、シュタインハイム、ドイツ</td><td># 23125</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich、シュタインハイム、ドイツ</td><td># G2500-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

有害化学物質への曝露後の内皮細胞の遊走の評価

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

（硫黄および窒素マスタードのようなアルキル化化学兵器を含む）の化学物質への曝露は、創傷治癒障害を含む臨床症状の過多を引き起こします。創傷治癒の生理学的過程は非常に複雑です。いずれかの脈管を通って（小説の形成）または血管新生（既存の血管の出芽） - 肉芽組織の形成は、予備的な創傷閉鎖をもたらし、新たな毛細血管のネットワークを提供し、このプロセスの重要なステップです。 vasculo-と血管新生の両方は、内皮細胞の遊走を向け機能が必要です。このように、初期の内皮細胞（EEC）移行の調査は治癒障害の化学誘起される傷の病態生理を理解し、潜在的な治療的介入のための新規な戦略を特定することが重要です。 我々は、エージェントの露出をアルキル化した後、創傷治癒の障害を評価し、TRのための潜在的な候補化合物を試験しましたeatment。私たちは、このプロトコルで概説技術のセットを使用していました。定量EECのケモキネシスを調査する改変ボイデンチャンバーを説明します。また、質的移行を評価するための軌道分析と組み合わせた創傷治癒アッセイの使用が示されています。最後に、乱れた細胞遊走の基礎となるメカニズムを識別するために、ミトコンドリア膜電位の調査のための蛍光色素TMRMの使用を示します。以下のプロトコルは、EECの調査のために適応されている基本的な手法について説明します。

アルキル化剤への皮膚暴露は、紅斑、水疱形成および創傷治癒障害に関連する皮膚潰瘍を引き起こします。創傷治癒は、内皮細胞の移動に基づいているリンパ管のおよび脈管が必要です。定量的な移行はボイデンチャンバーアッセイを使用して評価することができます。アルキル化剤クロラムブシルのEECの図1Cの露光に示すように、細胞遊走9の有意な減少をもたらしました。直接24時間クロラムブシルへの曝露後、ROSスカベンジャーのアルファリノレン酸（ALA）の添加は、有意にほぼ対照のレベルに、この表現型を救出します。 ボイデンチャンバーアッセイは、移動した細胞の数（量）を評価するための適切なツールです。しかし、このアッセイは、細胞の移動挙動に関する情報を提供していません。2図は、未露光EECは傷と癒しのお尻にギャップを閉鎖することが可能であることを示しています24時間9内AY。これとは対照的に、アルキル化剤クロラムブシルに曝露さEECは、アッセイ9創傷治癒に...

特定の疾患の病態生理学を理解し、治療介入のための新しい戦略を特定するために、早期の内皮細胞(EEC)の移動の調査が重要です。次のプロトコルは、EECの調査に適応した細胞遊走を評価する技術について説明しています。

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

本実験の全体的な目的は、異なる遊走アッセイを用いて、毒性化学物質が血管内皮細胞の遊走に及ぼす影響を調べることです。まず、次回の実験で、曝露した内皮細胞の化学遊走（ケモキネシス）を調べるための改良型回避チャンバーアッセイの使用方法を実演します。その後、細胞トラッキングを組み合わせた創傷治癒アッセイにより、細胞遊走のダイナミクスに関するさらなる詳細な情報を提供します。最終的なアッセイでは、血管内皮細胞の遊走能低下の根底にあるメカニズムを特定するため、ミトコンドリア膜電位の検討について実演します。最終的に、これらの遊走アッセイは、毒性の高いアルキル化剤がミトコンドリア膜電位および血管内皮細胞の遊走に及ぼす影響を評価するために利用できます。これらの手法は、毒性の高い化学物質によって誘発される創傷治癒障害の分野における重要な疑問への回答に寄与します。本手順の実演は、私の研究室の技術者であるramat、voer、およびStefan Millerが行います。細胞培養フラスコの準備として、まず、滅菌済みの細胞培養フラスコの底面をちょうど覆う十分な量の調製直後のゼラチンを加えてください。フラスコを細胞培養インキュベーターに少なくとも30分間置きます。その後、残っているゼラチン溶液を除去し、細胞がサブコンフルエントに達した時点で、胚性幹細胞由来早期内皮細胞（EEC）を、細胞が80%コンフルエントになるまで培養するのに十分な量の培地で移注します。培地を除去し、PBSで細胞を洗浄した後、25 cm²あたり1 mLのAccutane中で2〜10分間インキュベートします。細胞が剥離したら、Boyden chamber assayによる内皮細胞遊走能解析のため、新鮮な培地を用いて細胞を1:5の比率で分割します。フィルターインサートを、調製したばかりの0.1%ゼラチン500 µLでプレコートします。前述の手順でEECを回収した後、細胞数をカウントし、Boyden chamberの下層区画に細胞培養液500 µLを加えます。次に、各フィルターに500 µLの培地で懸濁した1×10⁴個のEECを正確に加えます。その後、気泡を除去し、Boydenチャンバーをインキュベーターに入れ、正確に8時間培養します。培養終了後、フィルターをPBSで1回洗浄します。その後、20分後に両方のコンパートメントに4%パラホルムアルデヒドを0.5 milliliters加えて細胞を固定します。フィルターを0.1 molar PBSで少なくとも3回洗浄し、メスでメンブレンを切り出します。DPIを添加した封入剤を用いて、各メンブレンを2枚のガラスカバースリップの間に封入します。フィルターの向きに注意して確認します。次に、蛍光顕微鏡を用いて400倍の倍率で、下層コンパートメントへ遊走した細胞のみをカウントします。この際、孔（ポア）を遊走細胞と混同しないように注意してください。創傷治癒アッセイを開始するには、滅菌した10 µLピペットチップを、培養皿の一端から他端まで表面上で滑らかに直線的に動かし、80%コンフルエントなEEC培養皿から細胞を手動で剥離させます。剥離した細胞を除去するため、0.1 M PBSでプレートを2回洗浄します。その後、目的の化合物を添加した培地を培養容器に加えます。次に、細胞培養条件下でのライブセルイメージングが可能な顕微鏡に培養皿を設置し、10分間隔で24時間にわたりタイムラプス画像を撮影します。なお、イメージングセッション終了時点での解像度は、少なくとも1024×1024としてください。適切なソフトウェアツールを用いて、0時間後と24時間後のギャップ幅を測定し、セルトラッキングアッセイを実施します。画像シーケンスをImageJにインポートし、ImageJプラグインのMT track Jを有効にします。次に、addコマンドを使用して、視野内からランダムに10個の細胞を選択し、24時間のイメージング期間における細胞の移動を手動でトラッキングします。measureコマンドを使用して結果を表示してください。その後、movieコマンドを使用してトラックをエクスポートし、目的の実験化合物で処理した後の細胞のミトコンドリア膜電位を評価します。細胞培養培地を、新鮮な細胞培養培地1 mLに、調製直後のTMRM 2 µLを加えたものに交換してください。培地を加え、洗浄せずに直ちにディッシュを顕微鏡下に設置し、撮影パラメータを変更せずにコントロール群および実験処理群の細胞の画像を取得します。異なる群間での比較可能性を確保するため、創傷治癒には血管新生が必要であり、これはグラフに示されているように内皮細胞の遊走に依存しています。EECをアルキル化剤であるChlorambacilに曝露させると、Boyden chamber assayで測定した細胞遊走能が有意に低下します。24時間のChlorambacil曝露の直後に、活性酸素種（ROS）スカベンジャーであるα-リノレン酸を添加すると、表現型がコントロールレベルに近い状態まで有意に回復します。しかしながら、ボイデンチャンバーアッセイでは、この代表的な創傷治癒アッセイにおける細胞の遊走挙動に関する情報は得られません。未曝露のEECは24時間以内にギャップを塞ぐことができましたが、クロラムバシル処理したEECではそれが不可能な結果となりました。さらに、個々のEECのセルトラッキングにより、クロラムバシル曝露細胞はほとんど移動を示さないことが明らかになりましたが、ROSスカベンジャーによる処理後にこの能力は回復しました。実際、クロラムバシルに曝露したEECは、TMRM発現の消失によって示されるように、ミトコンドリア膜電位の低下を示します。しかし、ROSスカベンジャーでEECを処理すると、このミトコンドリア損傷が抑制され、ミトコンドリア膜電位が維持されました。このビデオを視聴することで、スクラッチ傷アッセイを用いた修正ポイントインチャンバーアッセイにより、化学的に撹乱された内皮細胞の遊走を分析する方法と、そのミトコンドリア膜電位を評価する方法について十分に理解できるはずです。

assessment-endothelial-cell-migration-after-exposure-to-toxic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このビデオは、脳室周囲内皮細胞(PVEC)からの化学療法引力の合図に応答してニューロン間移動をテストする方法を示しています。介在ニューロンは中央のコンパートメントに配置され、両側にPVECと制御細胞があります。PVECへの移動の増加は、それらの化学療法引力シグナルに対する肯定的な反応を示しています。...

脳室周囲内皮細胞からの化学療法引力の手がかりに対する介在ニューロン応答の評価

私たちは、尿路病原性大腸菌で膀胱の感染中の急性の炎症反応の重要な要素を模倣したin vitroモデルを開発しました。 transuroepithelial好中球遊走アッセイは、細菌感染や化学誘引物質に反応して、透過性の支持体上で培養、膀胱上皮間でヒト好中球の遊走の定量的評価が可能になります。...

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三次元流れチャンバ装置は、新規である...

生理フローの状況の下で循環細胞のケモカイン指向溢出を研究する新規三次元フローチャンバーデバイス

一般的に使用される、 インビトロで細胞遊走および浸潤を調べるための高度にアクセス可能な方法が記載されている。第一の方法は、細胞運動性を測定する細胞創傷閉鎖アッセイである。第二の方法は、走化性、細胞の浸潤能を評価するトランスウェル遊走および浸潤アッセイである。...

インビトロでの細胞遊走および浸潤アッセイにおける

細胞移動は、癌のような創傷治癒および免疫応答、および病態生理学的過程として、生理の茄多に関与している生物学的な現象である。 3次元コラーゲンマトリックス遊走アッセイは、3D生理的環境における内の異なる細胞型の遊走特性を分析するための多目的なツールである。...

三次元コラーゲンマトリックス内の細胞移動の解析

内皮細胞単層内の接着細胞の実際の数を定量できるin vitro法を報告します。...

内皮細胞接着性の定量<em&gt;インビトロ</em

細胞浸潤と移行の解析のための 2 つの方法の事例分析: ボイデン室アッセイと体外ビデオ顕微鏡を用いた創傷治癒アッセイ。これらの 2...

細胞浸潤および移行プロセスの評価: ビデオ顕微鏡ベースのスクラッチの比較創傷アッセイと boyden 教授区域の試金

このプロトコルでは、リンパ球は、多孔質膜によって下部チャンバから分離された移行系の上部チャンバーに配置される。ケモカインは底室に添加され、ケモカイン勾配に沿って活発な移動を誘導する。48時間後、リンパ球は、移行を定量するために両方の部屋でカウントされます。...

排ビボ移行システムにおけるリンパ球移動の評価

我々は、3つの単純なインビトロアッセイ-長距離移動アッセイ、共培養移行アッセイ、および化学誘引アッセイ-それは、ヒト幹細胞由来の心室内皮細胞とその機能を一括して評価するGABAergic インターニューロンとの相互作用.

ヒト幹細胞由来内皮細胞およびGABAergicニューロンの移動、化学誘引、共培養アッセイ

また、機器を多用する方法を用いずに細胞移動を決定する新しい手法を提供する、スクラッチ移行アッセイにコスト効率の高い方法を提示します。線維芽細胞はこのプロトコルで使用されたが、それは適応され、細胞の移動に影響を追加の細胞タイプおよび影響を研究するために利用することができる。...

コスト効率と適応性のあるスクラッチ移行アッセイ

学ぶ 有害化学物質が内皮細胞の遊走に与える影響を、改良型回避チャンバーアッセイや傷治癒アッセイ、細胞追跡法、ミトコンドリア膜電位測定を用いて評価する方法です。創傷治癒障害の治療戦略開発に貢献します。

有害化学物質への曝露後の内皮細胞の遊走の評価

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