Name: ハイブリッドμCT-FMT撮像と画像解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: 学ぶハイブリッドμCT-FMT撮像法で、マウスを用いた生体内蛍光分布の定量的評価とインタラクティブな臓器セグメンテーションによる神経科学研究のデータ解析手法を習得できます。

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私たちは、ファントム実験を行うためのマレクワイラーに感謝します。この作品は、欧州研究会議（ERC開始グラント309495：NeoNaNo）によってサポートされていました、ノルトラインヴェストファーレン、ドイツ連邦州（NRW; High-Tech.NRW/EU-Ziel 2 - のprogramm（EFRE）; ForSaTum）、ドイツ語教育研究省（BMBF）（資金調達プログラム仮想肝臓（0315743）、LungSys（0315415C）、LungSys2（0316042F）、Photonik Forschungドイツ（13N13355））、アーヘン工科大学（I 3 TMのシード基金）、フィリップスリサーチ（アーヘン、ドイツ）。

<ol><li>Hoffman, R. M., Yang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+imaging+in+the+live+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Subcellular imaging in the live mouse.</a> Nature Protocols. 1 (2), 775-782 (2006).</li>
<li>Ale, A., Ermolayev, V., Herzog, E., Cohrs, C., Angelis, M. H., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMT-XCT%3A+in+vivo+animal+studies+with+hybrid+fluorescence+molecular+tomography-X-ray+computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">FMT-XCT: in vivo animal studies with hybrid fluorescence molecular tomography-X-ray computed tomography.</a> Nature Methods. 9 (9), 615-620 (2012).</li>
<li>Eaton, V. L., Vasquez, K. O., Goings, G. E., Hunter, Z. N., Peterson, J. D., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tomographic+imaging+of+near+infrared+imaging+agents+quantifies+disease+severity+and+immunomodulation+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Optical tomographic imaging of near infrared imaging agents quantifies disease severity and immunomodulation of experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo.</a> Journal of Neuroinflammation. 10 (138), (2013).</li>
<li>Lederle, W., Arns, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+annexin-based+apoptosis+imaging+in+the+assessment+of+antiangiogenic+therapy+effects%5BTitle%5D)+AND+%22EJNMMI+Research%22%5BJournal%5D)">Failure of annexin-based apoptosis imaging in the assessment of antiangiogenic therapy effects.</a> EJNMMI Research. 1 (26), (2011).</li>
<li>Ntziachristos, V., Tung, C. -H., Bremer, C., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+molecular+tomography+resolves+protease+activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo.</a> Nature Medicine. 8 (7), (2002).</li>
<li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multiple+uses+of+fluorescent+proteins+to+visualize+cancer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The multiple uses of fluorescent proteins to visualize cancer in vivo.</a> Nature Reviews Cancer. 5 (10), 796-806 (2005).</li>
<li>Schulz, R. B., Ale, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+system+for+simultaneous+fluorescence+and+x-ray+computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Medical+Imaging%22%5BJournal%5D)">Hybrid system for simultaneous fluorescence and x-ray computed tomography.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 29 (2), 465-473 (2010).</li>
<li>Stuker, F., Baltes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+small+animal+imaging+system+combining+magnetic+resonance+imaging+with+fluorescence+tomography+using+single+photon+avalanche+diode+detectors%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Medical+Imaging%22%5BJournal%5D)">Hybrid small animal imaging system combining magnetic resonance imaging with fluorescence tomography using single photon avalanche diode detectors.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (6), 1265-1273 (2011).</li>
<li>Leblond, F., Davis, S. C., Valdés, P. A., Pogue, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+Whole-body+Fluorescence+Imaging%3A+Review+of+Instruments%2C+Methods+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobiology+B%3A+Biology%22%5BJournal%5D)">Preclinical Whole-body Fluorescence Imaging: Review of Instruments, Methods and Applications.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 98 (1), 77-94 (2010).</li>
<li>Kunjachan, S., Gremse, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+optical+imaging+of+nanomedicine+biodistribution%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Noninvasive optical imaging of nanomedicine biodistribution.</a> ACS Nano. 7 (1), 252-262 (2013).</li>
<li>Radrich, K., Ale, A., Ermolayev, V., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+limited-projection-angle+fluorescence+molecular+tomography+using+a+co-registered+x-ray+computed+tomography+scan%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Improving limited-projection-angle fluorescence molecular tomography using a co-registered x-ray computed tomography scan.</a> Journal of Biomedical Optics. 17 (12), 126011(2012).</li>
<li>Freyer, M., Ale, A., Schulz, R. B., Zientkowska, M., Ntziachristos, V., Englmeier, K. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+automatic+segmentation+of+anatomical+structures+in+x-ray+computed+tomography+images+to+improve+fluorescence+molecular+tomography+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Fast automatic segmentation of anatomical structures in x-ray computed tomography images to improve fluorescence molecular tomography reconstruction.</a> Journal of Biomedical Optics. 15 (3), 036006(2010).</li>
<li>Gremse, F., Theek, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absorption+Reconstruction+Improves+Biodistribution+Assessment+of+Fluorescent+Nanoprobes+Using+Hybrid+Fluorescence-mediated+Tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Absorption Reconstruction Improves Biodistribution Assessment of Fluorescent Nanoprobes Using Hybrid Fluorescence-mediated Tomography.</a> Theranostics. 4 (10), 960-971 (2014).</li>
<li>Cheong, W. -F., Prahl, S. A., Welch, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+optical+properties+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Journal+of+Quantum+Electronics%22%5BJournal%5D)">A review of the optical properties of biological tissues.</a> IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2166-2185 (1990).</li>
<li>Doleschel, D., Mundigl, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+near-infrared+imaging+of+the+erythropoietin+receptor+in+human+lung+cancer+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%3A+Official+Publication%2C+Society+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeted near-infrared imaging of the erythropoietin receptor in human lung cancer xenografts.</a> Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 53 (2), 304-311 (2012).</li>
<li>Al Rawashdeh, W., Arns, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tomography+of+MMP-activity+allows+a+sensitive+non-invasive+characterization+of+the+invasiveness+and+angiogenesis+of+SCC-xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Optical tomography of MMP-activity allows a sensitive non-invasive characterization of the invasiveness and angiogenesis of SCC-xenografts.</a> Neoplasia. 16 (3), 235-246 (2014).</li>
<li>Kunjachan, S., Pola, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+versus+Active+Tumor+Targeting+Using+RGD-+and+NGR-Modified+Polymeric+Nanomedicines%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Passive versus Active Tumor Targeting Using RGD- and NGR-Modified Polymeric Nanomedicines.</a> Nano Letters. 14 (2), 972-981 (2014).</li>
<li>Schober, A., Nazari-Jahantigh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-126-5p+promotes+endothelial+proliferation+and+limits+atherosclerosis+by+suppressing+Dlk1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-126-5p promotes endothelial proliferation and limits atherosclerosis by suppressing Dlk1.</a> Nature Medicine. 20 (4), 368-376 (2014).</li>
<li>Aikawa, E., Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenesis+associates+with+inflammation+in+early-stage+atherosclerosis+evaluated+by+molecular+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Osteogenesis associates with inflammation in early-stage atherosclerosis evaluated by molecular imaging in vivo.</a> Circulation. 116 (24), 2841-2850 (2007).</li>
<li>Gremse, F., Höfter, A., Schwen, L., Kiessling, F., Naumann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPU-Accelerated+Sparse+Matrix-Matrix+Multiplication+by+Iterative+Row+Merging%5BTitle%5D)+AND+%22SIAM+Journal+on+Scientific+Computing%22%5BJournal%5D)">GPU-Accelerated Sparse Matrix-Matrix Multiplication by Iterative Row Merging.</a> SIAM Journal on Scientific Computing. , C54-C71 (2015).</li>
<li>Vasquez, K. O., Casavant, C., Peterson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Whole+Body+Biodistribution+of+Fluorescent-Labeled+Agents+by+Non-Invasive+Tomographic+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Quantitative Whole Body Biodistribution of Fluorescent-Labeled Agents by Non-Invasive Tomographic Imaging.</a> PLoS ONE. 6 (6), e20594(2011).</li>
<li>Theek, B., Gremse, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+EPR-mediated+passive+drug+targeting+using+contrast-enhanced+functional+ultrasound+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Characterizing EPR-mediated passive drug targeting using contrast-enhanced functional ultrasound imaging.</a> Journal of Controlled Release. 182 (1), 83-89 (2014).</li>
<li>Hyde, D., Schulz, R., Brooks, D., Miller, E., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+dependence+of+hybrid+x-ray+computed+tomography%2Ffluorescence+molecular+tomography+on+the+optical+forward+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Optical+Society+of+America.+A%2C+Optics%2C+Image+Science%2C+and+Vision%22%5BJournal%5D)">Performance dependence of hybrid x-ray computed tomography/fluorescence molecular tomography on the optical forward problem.</a> Journal of the Optical Society of America. A, Optics, Image Science, and Vision. 26 (4), 919-923 (2009).</li>
<li>Jacques, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+properties+of+biological+tissues%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Optical properties of biological tissues: a review.</a> Physics in Medicine and Biology. 58 (11), R37(2013).</li>
<li>Loening, A. M., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMIDE%3A+a+free+software+tool+for+multimodality+medical+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">AMIDE: a free software tool for multimodality medical image analysis.</a> Molecular Imaging. 2 (3), 131-137 (2003).</li>
<li>Gremse, F., Schulz, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+Quantitative+Data+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Small+Animal+Imaging%22%5BJournal%5D)">Qualitative and Quantitative Data Analysis.</a> Small Animal Imaging. , 363-378 (2011).</li>
<li>Baiker, M., Milles, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atlas-based+whole-body+segmentation+of+mice+from+low-contrast+Micro-CT+data%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Image+Analysis%22%5BJournal%5D)">Atlas-based whole-body segmentation of mice from low-contrast Micro-CT data.</a> Medical Image Analysis. 14 (6), 723-737 (2010).</li>
<li>Sevick-Muraca, E. M., Rasmussen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+with+optics%3A+primer+and+case+for+near-infrared+fluorescence+techniques+in+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging with optics: primer and case for near-infrared fluorescence techniques in personalized medicine.</a> Journal of Biomedical Optics. 13 (4), 041303(2008).</li>
</ol>

フェリックスGremseはGremse-IT、フィリップスとアーヘン工科大学の実験的分子イメージングのための部門との協力における医用画像解析のためのソフトウェアとサービスを提供しています新興企業の創設者であり、所有者です。

我々は、説明し、マルチモーダルμCT-FMTイメージングのためのプロトコルを適用します。 17,21 -私たちは、市販されており、広く使用されているFMTとμCTデバイス3,11,15を使用します。プロトコルは、特定のFMTを必要とするがμCTは、同様の機能と同等の走査パラメータを持つ別のμCTに置き換えることができ、例えば、視野がマーカーを含むマウスのベッドをカバーするのに十分な大きさでなければなりません。 FMTは、μCTまたはMRI 21と組み合わせることなく、生体分布分析のために使用されてきたが、解剖学的データは、セグメンテーションをμCTデータ10に表示された臓器の境界に基づいて行うことができるため、再現性を高めるために有益です。統合μCT-FMT装置は2,7を開発されてきたが、これらはまだ市販されていません。さらに、2つの別々のデバイスを使用する配管は、可能にする、すなわち 、次のマウスCAを最初のマウスは、スループットを向上させるために、FMTである間のnμCTで画像化すること。 手動の作業負荷を低減するために、我々は、自動化されたマーカーの検出および融合を行います。さらに、マウスの形状を自動的にセグメント化され、この情報はかなりの蛍光再構成11,13,22を改善します。定量的蛍光再構成のために、吸収及び散乱マップは13,23を必要としています。我々は、自動化されたμCTデータのセグメント化といくつかの組織タイプ（肺、骨、皮膚、脂肪、および残りの軟組織）の既知の散乱係数を割り当てる24により散乱マップを導出します。その後、我々は、心臓や肝臓13,20だけでなく、灌流臓器のために特に重要である光生データからの吸収マップを再構築します。 複数の時点で、いくつかのマウスをスキャンするとすぐに分析されるデータセットの数が多いことになります。 biodis用tributionの研究は、いくつかの器官は、各μCT-FMTスキャンのためにセグメント化される必要があります。マウスが新たに繰り返しマウス床に位置しているので残念ながら、セグメンテーションは、再利用することはできません。私たちは私たちの研究所で開発された対話型のセグメント化のためのツールを使用するが、他のツールも25適切であるかもしれません。これらは、楕円やキューブ26のような単純な形状よりも複雑な器官へのより良い一致しているため私たちは、ボクセルワイズセグメンテーションを生成します。自動化された全動物のセグメンテーションは、さらに手動の作業負荷27を減少させるのに有用であろうが、インタラクティブセグメンテーションツールは依然としてセグメント化誤差を補正するために必要とされるであろう。また、自動化されたセグメント化ツールは、正確に病状などの特別な場合をほとんど予想することはできません。私たちはネイティブμCTスキャンを使用するため、脾臓などのいくつかの器官があっても、手動でセグメントに非常に困難です。造影剤は役立つだろうが、忍容性に問題があり、それはmaintaiすることが困難です縦イメージングを通じてNA安定した造影剤の分布。 我々ファントム研究は、蛍光再構成のために形状情報を使用した場合の信号定位が改善されることを示している。 インビボでは 、プローブの大量に既にある場合にも同様の改善が、早い時点（注射後15分）のために明らかです膀胱。ヒドロキシアパタイト結合プローブは、骨や関節に蓄積します。それはつまり 、この問題が発生したどのくらいの速顕著で、信号は注射後脊柱15分ですでにはっきりと見えます。これはおそらく、標的領域へ​​の高速血管外漏出と拡散を可能にプローブの低分子量によって引き起こされます。プローブがその標的ヒドロキシアパタイトに共有結合し、結合していないプローブが排泄されます。後の時点では、6時間および注射後24時間の間、脊椎における信号強度はおそらく、比較的安定したままで、ほとんどすべての光再ため、蛍光を漂白する深いマウスに痛みます。私たちの研究のために、我々は、注入前に取得したスキャンの明らかなように、低バックグラウンド蛍光を生じさせる750 nmのチャネルを使用します。低い波長では、より多くのバックグラウンド信号28を期待することができます。 要約すると、我々は、商業的に入手可能なFMTとμCTデバイスのためのマルチモーダルイメージングプロトコルを記述します。我々は、組み合わせは、蛍光再構成のための利点を提供することを示しています。我々は、生体内分布曲線をインタラクティブ臓器セグメンテーション及びバッチ処理によって大量の画像データから抽出される方法を示します。我々は、この標準化されたワークフローは、薬剤開発および蛍光標識したプローブを用いて、他のイメージング研究のために役立つことができると信じています。

蛍光媒介トモグラフィーは、とも呼ばれる蛍光分子トモグラフィー（FMT）は、定量的にそのような麻酔したマウス、さらには人間の身体組織、 例えば 、乳房や指の関節などのびまん性組織における蛍光分布を評価するための有望な技術です。細胞下解像度1の表面的な標的のイメージングを可能にする非侵襲的な顕微鏡技術とは対照的に、FMTは、低解像度2であるが、数センチメートルの深さで蛍光源の三次元再構成を可能にします。 5 -多くのターゲットに蛍光プローブは、画像、血管新生、アポトーシス、炎症、その他2にご利用いただけます。いくつかのプローブは、 例えば 、活性化可能である。、蛍光色素のunquenchingにつながる特定の酵素切断によって。また、蛍光タンパク質を発現するレポーター遺伝子は、腫瘍細胞遊走6を追跡するため、 例えば 、画像化することができます。 FMTは強く解剖学的モダリティ、 例えば 、μCT2,7またはMRI 8と組み合わせから利益を得ます。スタンドアロンFMT装置9市販されているが、蛍光画像は、解剖学的な参照情報なしに解釈するのは困難です。最近では、融合された解剖学的画像データは、より堅牢な分析10を可能にすること、を示すことができました。解剖学的データはまた、正確な光造形および蛍光再構成11のために重要であるマウスの外形として予備知識を提供するために使用することができます。また、光散乱および吸収マップは、組織タイプのセグメント化を用いて推定し、クラス固有の係数12,13を割り当てることにより得ることができます。近赤外光は、ヘモグロビンはメラニンや毛皮14以外にも、マウスでは、吸収性本体です。相対血液量が桁違いに地域変化するので、吸収マップは、泉のために特に重要ですtitative蛍光再建13。 非侵襲性の撮像素子を使用することの一つの利点は、マウスを複数の時点で、すなわち 、縦方向に画像化することができるということです。これは、プローブの動的挙動、 即ち、それらの標的の蓄積、生体分布および排泄10,15を評価するため、または疾患の進行16を評価することが重要です。複数の時点で、いくつかのマウスを画像化する場合、画像データが大量に発生します。比較可能性を有効にするには、これらは明確に定義され、文書化プロトコルを使用して、 すなわち 、体系的な方法で取得する必要があります。スキャン多数の画像データから定量的な測定を抽出するために必要とされる画像解析のための課題を提起します。 私たちの研究の目的は、我々はいくつかの研究10,13,15,17,18全体で使用され、最適化μCT-FMT撮像プロトコルの詳細な説明を提供することにあります。我々は説明しデータセットが生成されるか、処理して可視化し、分析しました。これは、ヒドロキシアパタイト19に結合確立分子プローブ、OsteoSenseを用いて実証され、画像の骨疾患に使用され、2を改造することができます。動物に関わるすべての手順は、動物のケアに関する政府の審査委員会によって承認されました。

<table><tbody><tr><td>FMT(蛍光分子断層撮影)FMT2500 LX</td><td>PerkinElmer</td><td>FMT2000</td><td>蛍光分子断層撮影用デバイス</td></tr><tr><td>&micro;CT(マイクロコンピュータ断層撮影) トモスコープデュオ</td><td>CTイメージングGmbH</td><td>マイクロコンピュータ断層撮影用ト</td><td>モスコープデュオ</td>装置</tr><tr><td>マルチモーダルマウスベッド</td><td>CTイメージングGmbH</td><td>実験ビルダー</td><td>部分的に透明なアニマルホルダー</td></tr><tr><td>IsoFlo (イソフルラン、USP)</td> <td>アボット</td><td>05260-05</td><td>イソフルラン吸入麻酔</td></tr><tr><td>小動物麻酔システム</td><td>ハーバード大学製装置</td><td>726419</td><td>完全なイソフルラン卓上システム</td></tr><tr><td>クロロフィルフリーマウス食品</td><td>Ssniff</td><td>E15051</td><td>低クロロフィル/低蛍光食品</td></tr><tr><td>OsteoSense 750EX</td><td>PerkinElmer</td><td>NEV10053EX</td><td>動物FMT造影剤</td></tr><tr><td>Portex ファインボア ポリエチレン チューブ</td><td>スミスメディカル</td><td>800/100/120</td><td>注射カテーテル用チューブ</td></tr><tr><td>ステリカン 30g</td><td>BBraun</td><td>4656300</td><td>カテーテル用皮下注射針</td></tr><tr><td>イメロン</td><td>・アルタナ・ファーマ</td><td>INLA F.1/0203/3.5337.69</td><td>ファントム・インクルージョン用CT造影剤</td></tr><tr><td>アガロース</td><td>・シグマ</td><td>90-12-36-6</td><td>ファントム製造用アガロース</td></tr><tr><td>TiO2</td><td>Applichem</td><td>A1900,1000</td><td>ファントム散乱剤としての酸化チタン</td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>フルーカ</td><td>93595</td><td>ファントムライトを調整するトリパンブルー伝播</td></tr><tr><td>Cy7</td><td>Lumiprobe</td><td>15020</td><td>ファントムインクルージョン用蛍光色素</td></tr><tr><td>リポベノエス 20%</td><td>フレゼニウス・カビ</td><td>3094740</td><td>脂質エマルジョン、FMT造影剤用散乱剤</td></tr><tr><td>Definiens Developer XDサーバー Definiens</td><td>AG</td><td>サーバー XD</td><td>自動セグメンテーション用ソフトウェアプラットフォーム</td></tr><tr><td>Imalytics Preclinical</td><td>ExMI/Gremse-IT</td><td>バージョン2.0.1</td><td>画像融合、再構成、分析用ソフトウェア</td></tr><tr><td>NVIDIA Geforce Titan</td><td>Asus</td><td>GTXTITAN6GD5</td><td>ハイエンド コンピューター グラフィックス カード、6GB メモリ</td></tr></tbody></table>

ハイブリッドμct-fmt撮像と画像解析

Hybrid &#181;CT-FMT imaging and image analysis

蛍光媒介トモグラフィー（FMT）は、インビボでの蛍光分布の縦及び定量決意を可能にし、新たなプローブの体内分布を評価するために、確立された分子プローブまたはレポーター遺伝子を用いて、疾患の進行を評価することができます。解剖学的モダリティ、 例えば 、マイクロコンピュータ断層撮影（μCT）との組み合わせは、画像解析のための蛍光再構成のために有益です。我々は、定量的な測定値を抽出するために必要な画像処理ステップを含むマルチモーダルμCT-FMTイメージングのためのプロトコルを説明します。マウスを調製し、画像化を行った後に、マルチモーダルデータセットが登録されています。続いて、改善された蛍光の再構成を考慮にマウスの形状をとる、行われます。定量分析のために、臓器セグメンテーションをインタラクティブセグメンテーションツールを使用して、解剖学的データに基づいて生成されます。最後に、生体内分布のCurvesは、バッチ処理機能を使用して生成されます。我々は、骨や関節に結合するよく知られているプローブの生体内分布を評価することによって方法の適用可能性を示しています。

私たちは、ヒドロキシアパタイトに結合する標的化プローブ、OsteoSenseの生体内分布を評価するために記載されたプロトコールを適用しました。 3匹のマウス（C57BL / 6アポ - / - AHSG - / - 二重ノックアウトマウス、10週齢）は撮像された前、15分、2時間、4時間、6時間、2ナノモルのOsteoSenseの静脈内注射の24時間後。当社のソフトウェアは自動的にFMT（ 図2C、D）で行わ蛍光復興解剖学的μCTデータの融合を可能にしたマルチモーダルマウスのベッドに組み込まれたマーカー（ 図1、図2A、B）を 、検出されました。 OsteoSenseは、低分子量を有するプローブであることから、膀胱における高速腎排泄ので、高信号が期待されます。 FMTの蛍光再建の融合は、膀胱（ 図2C、D）の外に、このような見当違いの信号などの問題を明らかにしました。 FMTはマウスの真の形状を知っていて、ブロック状を呈していないため、これらの問題が発生します。オウRの再構築は、μCTデータから正確な形状を決定し、散乱と吸収が膀胱（ 図2E、F）のために特に顕著である良好な信号の局在化、とのより正確な蛍光再構成を可能にするために、13にマッピングが生成されます。 適切な領域に再構成された蛍光を割り当てるには、我々は対話的に当社のソフトウェア（ 図3）を使用して、いくつかの器官をセグメント化。 18のスキャンのそれぞれについて、7領域はμCTデータ、 すなわち 、心臓、肺、肝臓、腎臓、脊椎、腸および膀胱に基づいてセグメント化されました。次いで、ソフトウェア126の各領域の平均蛍光濃度を計算するために使用されました。幸いなことに、ソフトウェアは、すべての値を計算し、単一のスプレッドシートに保存しますバッチモードを提供します。 蛍光分布を可視化するために、3Dレンダリングは、各時点で生成されました、同等のウィンドウ設定（ 図4A-F）を使用して。定量化された臓器の値を使用して、生体内分布は、3匹のマウス（ 図4G）で臓器値を平均することにより算出しました。注射の前に取得事前スキャンは、無視できるバックグラウンドシグナルを示しました。 15分注射後、最も強い信号があるため、高速腎排泄のため、膀胱に登場しました。その後の時点で、残りのプローブは、骨および関節に蓄積していました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52770/52770fig1.jpg" /> 図1.マルチモーダルマウスベッド。（A）マルチモーダルマウスベッドはしっかりとマウスを保持している2つのアクリルガラスプレートが含まれています。締め付けは、2本のネジを使用して調整されます。マウスのベッドは、画像融合のためのマーカー（空孔）が含まれています。麻酔ガスをtで固定されるフレキシブルチューブを使用して供給されます。猿。 （B）マウスの床は、金属ホルダに取り付けられた回転μCTガントリの中心に保持されます。そうしないと、マーカーが誤って間違ったの融合につながる割り当てることができるため、（C）は 、マウスのベッドと金属ホルダとの間のギャップを避けてください。麻酔ガス管はチューブコネクタに接続する必要があります。 （D）は、マウスのベッドは正しい自動融合を可能にするために、フロント最初にFMTに挿入する必要があります。 （E）マーカーは、自動化されたマーカーの検出および融合のために使用されるFMTカメラ、に表示されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52770/52770fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52770/52770fig2.jpg" /> 図2.画像の融合と再構成。（A、B）マーカーとMOUの外形SEは、自動セグメンテーションアルゴリズムによって決定されます。 （C、D）OsteoSenseの注射後15分、プローブのかなりの量は、すでに膀胱中に排泄されています。 μCTデータとベンダー提供の再建を融合した後、問題が見えてきます。信号の大部分は、膀胱の周りではなく、膀胱の内側に表示され、いくつかの信号があっても、空気に表示されます。 FMTは、ブロック状のマウスを想定しているために発生します。 （E、F）私たちの改善された蛍光の再構築、μCTデータから派生したマウスの形状を使用して、膀胱内の蛍光のより良いローカライズをもたらす。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52770/52770fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52770/52770fig3.jpg" /> 図3.インタラクティブオルガンSegmentat蛍光分布を定量化するために、イオン（A）、いくつかの器官がセグメント化されています。心（赤）、肺（ピンク）、肝臓（茶色）、胃（ベージュ）、脊椎（紫）、腎臓（黄色）、腸（緑） 、および膀胱（金）。 （B）に強く、周囲の組織と比較して対比される肺は、しきい値および領域の充填を使用してセグメント化されます。膀胱、腎臓、および心臓などの（C）ラウンド器官は、「落書き」を使用してセグメント化されます。 （D）より複雑な形状の器官は、 例えば 、肝臓と胃を走り書きを使用してインクリメンタルにセグメント化されます。セグメントに背骨、高しきい値は、すべての骨のセグメントに適用されます。そしていくつかの骨、 例えば脊椎が残るまで、リブは、切り取られている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52770/52770fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> 図4：生体内分布。生体内分布を評価するために、マウスを、いくつかの時点（AF）に走査されます。 （A）プリスキャンは、注射の前に、750 nmのチャンネルに少し背景信号を示しています。 （B）15分注入後、プローブのかなりの量は、膀胱内に既にあります。 （C）2時間の時点で、マウスは、マウスの外で蛍光をもたらす、排尿していました。後の時点（DF）において、信号は、脊椎や膝に、骨や関節、 すなわち 。で優先的に表示されます。 （G）蛍光定量化濃度は、選択された臓器のために示されています。

蛍光媒介断層撮影法(FMT)とマイクロコンピュータ断層撮影法(μCT)を組み合わせたハイブリッドイメージングのプロトコルについて説明します。融合・再建後、相互作用による臓器セグメンテーションを行い、蛍光分布の定量的測定値を抽出します。

ハイブリッドμCT-FMT撮像と画像解析

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to ...

蛍光分子断層撮影（FMT）は、蛍光分布を定量的に評価するための非常に感度の高いイメージング技術です。麻酔下にあるマウスにおいて、多くの標的型蛍光プローブが利用可能であり、血管新生、アポトーシス、炎症などのイメージングが可能です。本動画では、当施設におけるFMTとMicro CTを用いたハイブリッドイメージングの実施方法について解説します。第1章「装置」では、FMTについて説明します。FMTとは、蛍光分子トモグラフィー（Fluorescence Molecular Tomography）の略称です。トモグラフィーとは、3次元画像を生成することを意味します。FMTは、マウスの近接内因性蛍光のイメージングにおいて高い感度を有しています。フロントパネルを開き、FMTの内部を確認します。底部には2Dサーバーに搭載されたレーザーがあります。このレーザーは、半透明のマウスベッドに保持されたマウスに向けて光を照射します。マウスベッドの上部には代替光源としてLEDアレイが配置されており、これによりFMTを通常の反射イメージングデバイスとして動作させることができます。レンズの下にはフィルターホイールが装着されており、レンズで捉えた光をデバイス上部の検出器へと導きます。これが当研究室のmicro CTです。このマイクロCTには2本のX線管と2枚のフラットパネル検出器が搭載されており、デュアルエナジースキャンの取得が可能です。第2章では、マイクロCT FMTスキャニングプロトコルについて説明します。FMTとマイクロCTは共にマウスのイメージング用に構築されており、イメージング前にマウスをイソフルランで麻酔します。FMTスキャンを行うには、マウスの被毛を除去する必要がありますが、これには除毛クリームが有効です。マウスの系統によっては、除毛クリームによって発疹が生じる場合があります。したがって、マウスの皮膚に変化がないか監視し、必要に応じて獣医スタッフに連絡して処置を受けることが推奨されます。また、まずは新しいマウス系統の少量バッチで耐性をテストしてください。低体温症を防ぐため、マウスはヒーティングパッドの上に置かれます。造影剤を注入するため、サイズが小さいためカテーテルを尾静脈に挿入します。この操作は非常に困難であり、ある程度の経験が必要です。カテーテル内に血液が逆流していれば、カテーテルが適切に留置されていることになります。容量負荷を避けるため、蛍光造影剤やCT造影剤を注入することができます。最大投与量は、体重1kgあたり5mLとし、30gのマウスの場合は150µLを投与します。スキャンを行う際は、マウスをマルチモーダルマウスベッドに配置します。マウスの個体識別のために、尾に記号が書き込まれている場合があります。胴体に記号を書き込むと光学スキャンに影響を及ぼす可能性があるため、避けることが重要です。マウスベッドを閉じ、マウスが固定位置にしっかりと保持されるように深さを調整します。マウスが窒息する可能性があるため、固定ベッドを締めすぎないよう注意し、呼吸状態を監視してください。ヌードマウスは免疫抑制状態にあるため、腫瘍学研究に一般的に使用されます。無毛であることは、遺伝子変異による幸運な副作用です。したがって、手間のかかる除毛の手順を省くことができます。マウスが適切に呼吸しているかを確認し、必要に応じてマウスベッドを調整してください。その後、マウスベッドをmicro ctの内部に設置します。デバイス内のガス流量を維持するため、ISOフッ素ガスを輸送するチューブを切り替えます。次に、X線遮蔽を有効にするためにmicro Cを閉じます。micro Cは、蓋が閉じている場合にのみスキャンを開始します。micro CTのボタンを使用して、マウスをmicro CT内部へ移動させます。micro CTの制御用コンピュータでトポグラムを取得し、ウィンドウ設定を調整してマウスをより鮮明に可視化します。1つ以上のZUPスキャンを設定できます。その位置は水色の領域で表示されます。通常、1回から3回のZUPスキャンで十分です。スキャンを開始すると、進行状況が濃い青色のプログレスバーで表示されます。当社のフラットパネルmicro CTはZUPスキャンを順次行いますが、これは臨床用のスパイラルCTとは異なります。ボタンを操作して、マウスベッドを前方へ移動させます。再度、遮蔽蓋を開け、麻酔チューブを交換します。マウスベッドからホルダーを慎重に取り外し、麻酔チューブを引き抜きます。ANおよびFMTはこの小さなチューブに依存していないため、この操作が必要になります。その代わりに、FMT内部の小さなチャンバーに麻酔ガスを充満させます。次に、マウスが乗ったマウスベッドをFMTまで運び、FMT制御コンピュータに挿入します。走査視野とサンプリング密度を調整します。通常は、約120ポイントを使用します。ボタンを押すと走査が開始されます。FMTの最初のパスでは、各レーザー光源点に対して透過照明または励起画像を取得します。この動画では、早送りモードで表示しています。通常、これには約5分かかります。下半身に比べて上半身を通過する光が大幅に少ないことがわかります。これは、心臓、肝臓、腎臓など、相対的に血液量が多い臓器が上半身に多く集中しているためです。血液は近赤外線の主要な吸収体となります。2回目のパスでは、異なるフィルターを用いて同じソースポイントを走査します。このフィルターは蛍光光のみを透過させます。第3章「インタラクティブなオイルおよびセグメンテーション」において、両方のデバイスからのデータを統合します。そのため、マウスベッドに組み込まれたマーカーが使用されます。これらのマーカーは、FMTによって取得された反射画像でも確認できます。マーカーは実際には単純な穴であり、蛍光物質やCT造影剤を充填する必要はありません。当研究施設では、マーカーの検出と融合を自動的に行うソフトウェアプログラムを開発しました。マウスの形状ならびに不均一な吸収および散乱マップは、最近のTheranostics誌の論文に記載されている通り、マイクロCTデータを用いて自動的に推定されます。これらのパラメータは、定量的な蛍光再構成において重要です。蛍光の生体内分布を測定するには、臓器のセグメンテーションが必要です。以下では、当研究所で開発されたimulitic preclinicalというソフトウェアを使用して、このようなセグメンテーションをインタラクティブに生成します。このようなセグメンテーションの様子を早送りで示しますが、経験者は約10〜20分で完了させることができます。まず、CTデータセットをロードします。ISO表面レンダリングを用いて、3Dで検査することが可能です。ウィンドウ設定を変更することで、ISO値を変更できます。例えば、マウスベッドと共にマウス全身の骨を可視化する場合、オーバーレイをロードします。この例では、信号が膀胱に現れています。ここでは、解剖学的セグメンテーションに集中するため、オーバーレイ表示をオフにします。ネイティブのmicroCTスキャンでは、他の軟組織との強いネガティブコントラストにより、肺を容易に見つけることができます。肺の内部にある大きな構造物は心臓です。まず、肺のセグメンテーションを行いましょう。閾値処理を用いて、ある一定の値より小さいすべてのボクセルをセグメント化します。これは緑色で表示されます。肺は連結領域であるため、塗りつぶし操作によって分離することが可能です。塗りつぶしツールと同様の手法です。ペイントソフトにおいて、切り取りと塗りつぶしを行うことで、缶を肺から分離させることができます。膀胱のような凸状の臓器は、臓器の境界線をなぞるようにスクリブル（自由線）を描くことでセグメンテーションが可能です。十分な精度に達するまで、さらにスクリブルを追加します。腸のような非凸状の臓器は、一部分ずつセグメンテーションすることが可能です。肝臓は均質な領域として現れますが、より複雑な構造をしています。複数の葉で構成されているため、セグメンテーションをディスクに保存し、プログラムに読み込むことができます。このようなセグメンテーションを用いることで、蛍光信号を各臓器に割り当てることが可能です。プログラムがこれらの量を算出し、別シートとして保存します。縦断的なスキャンの場合、マウスを固定した状態で麻酔を維持するには通常の時間間隔が長すぎるため、各タイムポイントで再度セグメンテーションを行う必要があります。したがって、多くのマウスや多くのタイムポイントが含まれる場合、セグメンテーションは労力を要する作業となります。結果を定量化するには、オーバーレイとセグメンテーションを読み込みます。[Batch settings] をクリックして、現在の設定をプログラムに記憶させます。次に、「batch statistics」をクリックし、すべてのmicro CT FMTスキャンにおける全領域の値を計算するようにプログラムに指示します。これには数秒かかります。その後、統計データが1つのスプレッドシートファイルに保存されます。これにより、ユーザーが数十ものファイルを自身でマージする必要がなくなるため便利です。このファイルに基づいて、臓器の曲線（organ curves）を算出できます。第4章では、代表的な結果について述べます。フュージョンが適切に機能することを検証するため、arosファントムを使用しました。散乱させるために、酸化チタン粉末を少量添加しました。また、不規則な形状を再現するために、一部を切り出しました。蛍光およびCT造影剤を満たしたいくつかの小さな封入体をファントム内に構築しました。FMTは物体の真の形状を把握しておらず、簡略化された形状を想定するため、不規則な形状の物体に対する再構成は正確ではありません。そこで、マイクロCTデータから得られた形状を利用する別の再構成手法を実装しました。ご覧の通り、ファントムにおける信号の局在化が大幅に改善されています。in vivoデータを検討するため、イメージングのタイムポイントを確認しましょう。これがプレスキャンです。ここに見えるのは、基本的には単なるノイズとアーチファクトです。次のタイムポイント、つまり注入後の時点に移動すると、信号が大幅に増加していることがわかりますが、ウィンドウ設定が硬すぎます。ウィンドウダイアログを使用して、ウィンドウ設定を調整することができます。シグナルの大部分は膀胱に認められます。次の時間点である投与後0.2時間を確認すると、マウスの外側にもシグナルが見られます。これは、マウスがマウスベッド上に蛍光物質を排尿したためです。ウィンドウ設定をさらに調整すると、脊椎と膝に信号が確認できます。次に、投与後0.4時間の時点を確認します。尿からの信号は消失しており、次回の測定ポイントである投与後6時間および24時間においても、脊椎と膝に蛍光が認められます。同様の結果が得られています。次に、別の鼻の症例を確認しましょう。このウィンドウ設定を用いたプレスキャンでは、何も認められません。注入15分後のスキャンでは、膀胱に強い信号が見られます。本研究では、このプローブの迅速な腎排泄の結果、投与後間もなくに膀胱内で高濃度に検出されることが分かりました。さらに、脊髄における信号は急速に上昇し、その後のイメージングの時間経過を通じて比較的安定した状態を維持しました。第5章、結論。結論として、本研究では蛍光イメージング、分子トモグラフィー、およびマイクロコンピュータ断層撮影（マイクロCT）のそれぞれの強みを組み合わせたマルチモーダルイメージングプロトコルを提示しました。解剖学的なマイクロCTデータを用いることで、マウスの形状に基づいた精度の高い蛍光再構成が可能になります。さらに、画像データから定量的な測定値を抽出するために必要な臓器セグメンテーションを作成する際にも有用です。

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