ハイブリッドμCT-FMT撮像と画像解析

蛍光分子断層撮影（FMT）は、蛍光分布を定量的に評価するための非常に感度の高いイメージング技術です。麻酔下にあるマウスにおいて、多くの標的型蛍光プローブが利用可能であり、血管新生、アポトーシス、炎症などのイメージングが可能です。本動画では、当施設におけるFMTとMicro CTを用いたハイブリッドイメージングの実施方法について解説します。

第1章「装置」では、FMTについて説明します。FMTとは、蛍光分子トモグラフィー（Fluorescence Molecular Tomography）の略称です。トモグラフィーとは、3次元画像を生成することを意味します。FMTは、マウスの近接内因性蛍光のイメージングにおいて高い感度を有しています。

フロントパネルを開き、FMTの内部を確認します。底部には2Dサーバーに搭載されたレーザーがあります。このレーザーは、半透明のマウスベッドに保持されたマウスに向けて光を照射します。

マウスベッドの上部には代替光源としてLEDアレイが配置されており、これによりFMTを通常の反射イメージングデバイスとして動作させることができます。レンズの下にはフィルターホイールが装着されており、レンズで捉えた光をデバイス上部の検出器へと導きます。これが当研究室のmicro CTです。

このマイクロCTには2本のX線管と2枚のフラットパネル検出器が搭載されており、デュアルエナジースキャンの取得が可能です。第2章では、マイクロCT FMTスキャニングプロトコルについて説明します。FMTとマイクロCTは共にマウスのイメージング用に構築されており、イメージング前にマウスをイソフルランで麻酔します。

FMTスキャンを行うには、マウスの被毛を除去する必要がありますが、これには除毛クリームが有効です。マウスの系統によっては、除毛クリームによって発疹が生じる場合があります。したがって、マウスの皮膚に変化がないか監視し、必要に応じて獣医スタッフに連絡して処置を受けることが推奨されます。

また、まずは新しいマウス系統の少量バッチで耐性をテストしてください。低体温症を防ぐため、マウスはヒーティングパッドの上に置かれます。造影剤を注入するため、サイズが小さいためカテーテルを尾静脈に挿入します。

この操作は非常に困難であり、ある程度の経験が必要です。カテーテル内に血液が逆流していれば、カテーテルが適切に留置されていることになります。容量負荷を避けるため、蛍光造影剤やCT造影剤を注入することができます。

最大投与量は、体重1kgあたり5mLとし、30gのマウスの場合は150µLを投与します。スキャンを行う際は、マウスをマルチモーダルマウスベッドに配置します。

マウスの個体識別のために、尾に記号が書き込まれている場合があります。胴体に記号を書き込むと光学スキャンに影響を及ぼす可能性があるため、避けることが重要です。マウスベッドを閉じ、マウスが固定位置にしっかりと保持されるように深さを調整します。

マウスが窒息する可能性があるため、固定ベッドを締めすぎないよう注意し、呼吸状態を監視してください。ヌードマウスは免疫抑制状態にあるため、腫瘍学研究に一般的に使用されます。無毛であることは、遺伝子変異による幸運な副作用です。

したがって、手間のかかる除毛の手順を省くことができます。マウスが適切に呼吸しているかを確認し、必要に応じてマウスベッドを調整してください。その後、マウスベッドをmicro ctの内部に設置します。

デバイス内のガス流量を維持するため、ISOフッ素ガスを輸送するチューブを切り替えます。次に、X線遮蔽を有効にするためにmicro Cを閉じます。micro Cは、蓋が閉じている場合にのみスキャンを開始します。

micro CTのボタンを使用して、マウスをmicro CT内部へ移動させます。micro CTの制御用コンピュータでトポグラムを取得し、ウィンドウ設定を調整してマウスをより鮮明に可視化します。1つ以上のZUPスキャンを設定できます。その位置は水色の領域で表示されます。

通常、1回から3回のZUPスキャンで十分です。スキャンを開始すると、進行状況が濃い青色のプログレスバーで表示されます。当社のフラットパネルmicro CTはZUPスキャンを順次行いますが、これは臨床用のスパイラルCTとは異なります。

ボタンを操作して、マウスベッドを前方へ移動させます。再度、遮蔽蓋を開け、麻酔チューブを交換します。マウスベッドからホルダーを慎重に取り外し、麻酔チューブを引き抜きます。

ANおよびFMTはこの小さなチューブに依存していないため、この操作が必要になります。その代わりに、FMT内部の小さなチャンバーに麻酔ガスを充満させます。次に、マウスが乗ったマウスベッドをFMTまで運び、FMT制御コンピュータに挿入します。

走査視野とサンプリング密度を調整します。通常は、約120ポイントを使用します。ボタンを押すと走査が開始されます。

FMTの最初のパスでは、各レーザー光源点に対して透過照明または励起画像を取得します。この動画では、早送りモードで表示しています。通常、これには約5分かかります。

下半身に比べて上半身を通過する光が大幅に少ないことがわかります。これは、心臓、肝臓、腎臓など、相対的に血液量が多い臓器が上半身に多く集中しているためです。血液は近赤外線の主要な吸収体となります。

2回目のパスでは、異なるフィルターを用いて同じソースポイントを走査します。このフィルターは蛍光光のみを透過させます。第3章「インタラクティブなオイルおよびセグメンテーション」において、両方のデバイスからのデータを統合します。そのため、マウスベッドに組み込まれたマーカーが使用されます。

これらのマーカーは、FMTによって取得された反射画像でも確認できます。マーカーは実際には単純な穴であり、蛍光物質やCT造影剤を充填する必要はありません。当研究施設では、マーカーの検出と融合を自動的に行うソフトウェアプログラムを開発しました。

マウスの形状ならびに不均一な吸収および散乱マップは、最近のTheranostics誌の論文に記載されている通り、マイクロCTデータを用いて自動的に推定されます。これらのパラメータは、定量的な蛍光再構成において重要です。蛍光の生体内分布を測定するには、臓器のセグメンテーションが必要です。

以下では、当研究所で開発されたimulitic preclinicalというソフトウェアを使用して、このようなセグメンテーションをインタラクティブに生成します。このようなセグメンテーションの様子を早送りで示しますが、経験者は約10〜20分で完了させることができます。まず、CTデータセットをロードします。

ISO表面レンダリングを用いて、3Dで検査することが可能です。ウィンドウ設定を変更することで、ISO値を変更できます。例えば、マウスベッドと共にマウス全身の骨を可視化する場合、オーバーレイをロードします。

この例では、信号が膀胱に現れています。ここでは、解剖学的セグメンテーションに集中するため、オーバーレイ表示をオフにします。

ネイティブのmicroCTスキャンでは、他の軟組織との強いネガティブコントラストにより、肺を容易に見つけることができます。肺の内部にある大きな構造物は心臓です。まず、肺のセグメンテーションを行いましょう。

閾値処理を用いて、ある一定の値より小さいすべてのボクセルをセグメント化します。これは緑色で表示されます。肺は連結領域であるため、塗りつぶし操作によって分離することが可能です。

塗りつぶしツールと同様の手法です。ペイントソフトにおいて、切り取りと塗りつぶしを行うことで、缶を肺から分離させることができます。膀胱のような凸状の臓器は、臓器の境界線をなぞるようにスクリブル（自由線）を描くことでセグメンテーションが可能です。

十分な精度に達するまで、さらにスクリブルを追加します。腸のような非凸状の臓器は、一部分ずつセグメンテーションすることが可能です。肝臓は均質な領域として現れますが、より複雑な構造をしています。

複数の葉で構成されているため、セグメンテーションをディスクに保存し、プログラムに読み込むことができます。このようなセグメンテーションを用いることで、蛍光信号を各臓器に割り当てることが可能です。プログラムがこれらの量を算出し、別シートとして保存します。縦断的なスキャンの場合、マウスを固定した状態で麻酔を維持するには通常の時間間隔が長すぎるため、各タイムポイントで再度セグメンテーションを行う必要があります。

したがって、多くのマウスや多くのタイムポイントが含まれる場合、セグメンテーションは労力を要する作業となります。結果を定量化するには、オーバーレイとセグメンテーションを読み込みます。[Batch settings] をクリックして、現在の設定をプログラムに記憶させます。

次に、「batch statistics」をクリックし、すべてのmicro CT FMTスキャンにおける全領域の値を計算するようにプログラムに指示します。これには数秒かかります。その後、統計データが1つのスプレッドシートファイルに保存されます。

これにより、ユーザーが数十ものファイルを自身でマージする必要がなくなるため便利です。このファイルに基づいて、臓器の曲線（organ curves）を算出できます。第4章では、代表的な結果について述べます。

フュージョンが適切に機能することを検証するため、arosファントムを使用しました。散乱させるために、酸化チタン粉末を少量添加しました。また、不規則な形状を再現するために、一部を切り出しました。

蛍光およびCT造影剤を満たしたいくつかの小さな封入体をファントム内に構築しました。FMTは物体の真の形状を把握しておらず、簡略化された形状を想定するため、不規則な形状の物体に対する再構成は正確ではありません。そこで、マイクロCTデータから得られた形状を利用する別の再構成手法を実装しました。

ご覧の通り、ファントムにおける信号の局在化が大幅に改善されています。in vivoデータを検討するため、イメージングのタイムポイントを確認しましょう。これがプレスキャンです。

ここに見えるのは、基本的には単なるノイズとアーチファクトです。次のタイムポイント、つまり注入後の時点に移動すると、信号が大幅に増加していることがわかりますが、ウィンドウ設定が硬すぎます。ウィンドウダイアログを使用して、ウィンドウ設定を調整することができます。

シグナルの大部分は膀胱に認められます。次の時間点である投与後0.2時間を確認すると、マウスの外側にもシグナルが見られます。これは、マウスがマウスベッド上に蛍光物質を排尿したためです。

ウィンドウ設定をさらに調整すると、脊椎と膝に信号が確認できます。次に、投与後0.4時間の時点を確認します。尿からの信号は消失しており、次回の測定ポイントである投与後6時間および24時間においても、脊椎と膝に蛍光が認められます。同様の結果が得られています。

次に、別の鼻の症例を確認しましょう。このウィンドウ設定を用いたプレスキャンでは、何も認められません。注入15分後のスキャンでは、膀胱に強い信号が見られます。

本研究では、このプローブの迅速な腎排泄の結果、投与後間もなくに膀胱内で高濃度に検出されることが分かりました。さらに、脊髄における信号は急速に上昇し、その後のイメージングの時間経過を通じて比較的安定した状態を維持しました。第5章、結論。

結論として、本研究では蛍光イメージング、分子トモグラフィー、およびマイクロコンピュータ断層撮影（マイクロCT）のそれぞれの強みを組み合わせたマルチモーダルイメージングプロトコルを提示しました。解剖学的なマイクロCTデータを用いることで、マウスの形状に基づいた精度の高い蛍光再構成が可能になります。さらに、画像データから定量的な測定値を抽出するために必要な臓器セグメンテーションを作成する際にも有用です。