ヒト好中球における細胞外DNAのリリースおよび定量NET形成のハイスループット測定インビトロ

この手順の全体的な目標は、ヒト好中球から放出される好中球細胞外トラップ(NET)をハイスループットスケールで定量することです。ここで紹介する方法は、ヒト好中球におけるin vitro好中球細胞外トラップ形成のメカニズムと制御の研究を通じて、炎症および炎症性疾患の変化の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の意味するところは、中央のNET媒介シグナル伝達経路とNET阻害性またはNET刺激性分子の同定を含む。

血液から好中球を分離するには、20ミリリットルのヒト血液を250ミリリットルの円錐管に分注します。10ミリリットルの6%デキストランを加え、次いで穏やかに混合し、溶液を室温で20分間放置する。白血球が豊富な上相を清潔な50ミリリットルの円錐形チューブに慎重に移し、滅菌PBSを使用してチューブを上部まで充填します。

次に、サンプルをGの400倍で10分間遠心分離し、15ミリリットルの滅菌PBSを使用してペレットを再懸濁します。この洗浄手順をもう一度繰り返します。次に、215ミリリットルの円錐管に85、80、75、70、65パーセントの5段階のパーコール勾配を調製し、各勾配の上に2ミリリットルの白血球懸濁液を重ねます。

次に、グラジエントをGの800倍で30分間遠心分離します。遠心分離後、75-80%および70-75%界面の層に細胞を回収します。PBSを使用して細胞を2回洗浄し、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。

細胞外DNA放出の動態を測定するには、アッセイ培地中の好中球懸濁液をアッセイ培地に10倍から6細胞/mLの濃度で調製します。膜不透過性DNA結合色素であるSYTOXオレンジを1リットルあたり5マイクロモル加え、穏やかに混合します。ヒト好中球を滅菌済みの96ウェル黒色透明底部マイクロプレートに分注し、アッセイ培地がウェルの底部全体を覆うようにします。

そうでない場合は、側面のプレートを軽くたたきます。プレートを摂氏37度で10分間温めます。その間に、摂氏37度のアッセイ培地を使用して、使用する最終濃度の2倍の刺激を含む溶液を調製します。

ポジティブNETコントロールとして、100ナノモルのミリスチン酸ホルボール(PMA)を調製し、ヒト好中球を4時間治療して、最大のNET放出をトリガーします。次に、測定用のマイクロプレート蛍光光度計を準備します。好中球懸濁液50マイクロリットルに刺激溶液50マイクロリットルを添加して好中球を刺激します。

1つのウェルにサポニン1ミリリットルあたり0.5ミリグラムの最終濃度を加えて、最大DNA放出シグナルを測定します。プレートをリーダーに置き、2分間隔で4時間、振とうせずに蛍光の変化を測定します。データを分析するには、サポニンを含むすべてのウェルのエンドポイント値からベースライン蛍光を差し引くことにより、経時的な蛍光の正規化された増加を計算します。

サポニン蛍光の上昇は最も高いシグナルであるべきであり、最大DNA放出と呼ばれます。反復の結果を平均化し、最大DNA放出のパーセントとして表示します。MPO-DNAおよびHNE-DNA ELISAアッセイを使用してNET形成を定量するには、抗MPOまたは抗HNE捕捉抗体を96ウェルの高結合能ELISAプレートに添加し、一晩インキュベートしてコーティングします。

翌朝、PBSのウェルあたり200マイクロリットルを使用して、ELISAプレートを3回洗浄します。次に、200マイクロリットルの5%ウシ血清アルブミン(BSA)と0.1%ヒト血清アルブミン(HSA)を使用して、室温で2時間ウェルをブロックします。その間に、96ウェルプレート上の100マイクロリットルのアッセイ培地に好中球を100,000細胞/ウェルあたりの密度で播種し、37°Cで4時間インキュベートすることにより刺激を加えた後にNET形成を誘導します。

次に、好中球の上清にDNAse1ミリリットルあたり2単位を添加して限定的なDNase消化を行い、よく混合して室温で15分間インキュベートします。その後、25ミリモルEGTAを15マイクロリットル加えて反応を停止し、よく混合します。上清を採取し、マイクロチューブを洗浄し、サンプルを回転させて、Gの300倍、室温で5分間細胞の破片を取り除きます。

制限付き消化なしでNETを収集すると、データの一貫性が失われます。再現性のある結果を得るためには、DNA消化ステップが限られていることが重要です。そのため、DNase I酵素の濃度と消化の長さが最適化されています。

上清をきれいなマイクロチューブに移し、氷の上に保ちます。次に、あらかじめ調製したNET標準液のアリコートを使用して、PBSおよびEGTAで1〜2希釈液を調製します。次に、PBSとEGTAを使用して、DNase I消化したサンプルを20倍希釈し、捕捉抗体でコーティングしたELISAプレート上で分注します。

プレートを摂氏4度で一晩インキュベートします。PBSを使用してプレートを3回洗浄する前に、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗DNA抗体などの検出抗体溶液にウェルあたり100μLを塗布し、暗所で1時間インキュベートします。PBSで4回洗浄した後、TMBペルオキシダーゼ基質のウェルあたり100μLを加え、30分間インキュベートします。

青色はペルオキシダーゼ活性とNETの存在を示します。反応を止めるには、1モルHCLを100マイクロリットル追加します。青い溶液が黄色に変わります。

マイクロプレート光度計を使用して、450ナノメートルの吸光度を読み取ります。測定された MPO-DNA または HNE-DNA 複合体の量を NET 標準と比較するには、すべてのサンプルからバックグラウンド最適密度を差し引き、希釈した標準サンプルの吸光度値を相対的な NET 含有量に対してプロットします。この標準曲線の非飽和範囲を使用して、使用するソフトウェアからの最適な指数関数的適合を使用してトレンドラインを確立します。

未知物質の測定されたOD値をトレンドライン方程式に挿入し、未知サンプルのNETの量をNET標準のパーセントとして求めます。最後に、反復の平均を計算し、最終データを MPO-DNA または HNE-DNA 複合体の量として表示します。ここに示されているのは、PMAまたはP-aeruginosaで刺激または活性化されないヒト好中球の蛍光ベースのDNA放出アッセイからの代表的なデータです。

P-緑膿菌は、ヒトPMNのNET形成を誘発します。このグラフは、リピートウェルの蛍光増加の平均が計算され、最大蛍光で正規化され、DNA放出として表されることを示しています。これらの蛍光画像は、PMAで治療または刺激された好中球を表しています。

ここに示されているのは、MPO-DNAおよびHNE-DNA Elisaアッセイからの非刺激、PMA、およびPA01活性化ヒト好中球の免疫蛍光画像です。細胞外DNAは典型的なNET形態を示し、MPOおよびNET形成のマーカーであるシトルリン化ヒストンH4と共局在します。この実験は、同じアッセイを使用して、ヒト好中球におけるMPO-DNAおよびHNE-DNAの放出を示しています。

NET標準物質は、平均して19.5マイクログラム/ミリリットルの細胞外DNA、399ナノグラム/ミリリットルのMPO、および103.4ナノグラム/ミリリットルのHNEを含んでいます。MPOおよびHNEの分子量、およびDNAの1マイクログラムが10の14ヌクレオチドの9.91倍を含んでいることに基づいて、NET標準は1,000ヌクレオチドあたり109のHNE分子および147のMPO分子を含んでいる。最後に、NET標準の2倍段階希釈実験により、MPO-DNAおよびHNE-DNA ELISAアッセイの両方のダイナミックレンジがDNA1ミリリットルあたり19〜609ナノグラムであることが明らかになりました。

習得すれば、SYTOXオレンジベースの酸は1時間で簡単かつ迅速に組み立てることができ、翌日には結果が得られます。NET定量アッセイも簡単に実施でき、適切に実施すれば翌日にデータが得られます。このビデオを見れば、ヒト好中球のナチュラーゼをハイスループットで定量する方法を十分に理解できるはずです。