細胞株および組織試料中の脱ユビキチン化酵素の活性を測定する方法

本実験の全体的な目的は、細胞内における脱ユビキチン化酵素の活性を可視化することです。これを実現するために、まず細胞を高密度に培養して回収し、第2ステップとして濃縮ライセート（細胞溶解液）を調製します。さらに、細胞質内の代謝状態を維持したライセートを得るため、緩やかな機械的溶解法を用います。

次に、活性部位のシステイン残基と反応させることで脱ユビキチン化酵素を標識するため、酵素をヘマグルチニン由来のプローブとともにインキュベートします。その結果、ウェスタンブロッティングおよびその後の化学発光検出に基づいた、多くの脱ユビキチン化酵素の活性プロファイルが得られます。通常のウェスタンブロッティングなどの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、複数の酵素の活性を可視化できることです。ある実験において、細胞培養用培地を調製します。具体的には、30 mLのDMEM（10%胎児牛血清添加）を50 mLコニカルチューブに分注して培養します。

実験に使用する細胞として、凍結保存されたM 17またはhe A細胞を液体窒素保存庫から取り出し、ぬるま湯を入れた小型ビーカーに移します。次に、これらの細胞を30 mLの培地が入った50 mLコニカルチューブに移します。続いて、細胞バイアルに少量の培地を加え、解凍後5秒以内に再懸濁した細胞を移送します。

細胞懸濁液を450 Gsで5分間遠心分離し、細胞ペレットを得ます。次に、T 75フラスコに20 mLの培地を加えます。吸引を用いて細胞から培地を除去します。

5 mLの新鮮な培地を細胞ペレットに加え、再懸濁します。この5 mLの細胞懸濁液をT 75フラスコ内の20 mLの培地に移し、37 °Cでインキュベートします。3日ごとに培地を交換し、細胞を回収します。

細胞に触れないように注意しながら、吸引により培地を除去します。5 mL のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を洗浄します。PBS を吸引して除去します。

次に、T 75フラスコに3 mLのtrypsin EDTAを加え、37 °Cで3分間インキュベートします。インキュベート後、フラスコに6 mLの新鮮な培地を加え、細胞を再懸濁します。

懸濁液を15 mLコニカルチューブに移し、290 Gsで5分間遠心分離した後、上清を除去して5 mLのPBSを加えます。チューブの底を軽く叩いてペレットをほぐしてから、290 Gsで5分間遠心分離します。PBSによる洗浄を3回繰り返した後、古いPBSを除去し、1 mLの新鮮なPBSで細胞を再懸濁します。

その後、細胞をエッペンチューブに移し、290 gで5分間遠心分離します。細胞溶解を行うために、ピペットを用いてペレットの概算体積を測定し、質量対体積比が1:1となるようにガラスビーズを量り取ります。ペレットの2倍の量の溶解バッファーをペレットに加えます。

次に、ペレットにガラスビーズと溶解緩衝液を加え、コールドルーム内でボルテックスを用いて最大攪拌で30分間、4 °Cで細胞を溶解させます。200 Gで30秒間、短時間遠心分離します。

ビーズを沈殿させ、上清を回収します。前と同様の量のガラスビーズを上清に加え、200 Gsで30秒間短時間遠心分離した後、4 °Cで最大強度で30分間、再度ボルテックス処理を行います。ガラスビーズを沈殿させ、上清を回収します。

最後に、5,030 ×gで5分間遠心分離します。核、膜、および未破壊細胞を除去するため、上清を回収します。この上清は、シアン酸（cinconimidic acid）による組織誘導体化またはBCA分析に使用する細胞溶解液となります。BCAタンパク質定量キットのプロトコルに従い、コロリメトリック96ウェルプレートリーダーを用いて溶解液のタンパク質濃度を測定するため、96ウェルプレートに分注します。

タンパク質濃度を決定した後、全タンパク質 20 micrograms に相当する分注量を、脱イオン水を用いて 50 microliters に調整します。次に、1.35 micromolar の HAUB vinyl cell phone を 2 microliters、溶液に加えます。これにより、最終的な反応混合物において、ライセート 20 micrograms に対してプローブ 50 nano molar となります。

これは大過剰のモル量です。機能的な脱ユビキチン化酵素（dubs）のタグ付けを確実にするため、溶液を37 °Cで1時間インキュベートします。次に、溶液にLaemmliサンプルバッファーを加えます。

反応液量 52 µL に対して、2x サンプルバッファーを 26 µL、4x サンプルバッファーを 13 µL、または 6x サンプルバッファーを 8.87 µL 使用します。サンプルを 95 °C で 5 分間インキュベートします。その後、氷上で冷却します。

ウェスタンブロッティングを行う前に、まず準備したサンプル40 µLを、12ウェルの4〜20% Tris-Glycine ゲルにロードします。イオンフロントが底部に到達するまで、95 V でゲル電気泳動を行います。その後、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜へ、以下の手順に従ってゲルのオーバーナイト転写を行います。

まず、メンブレンをAMDO黒染色の溶液でインキュベートし、スキャンして各レーンのタンパク質量を示す画像を取得します。次に、メンブレンを洗浄し、PBSで調製した5%ミルクに1時間インキュベートしてブロッキングを行います。続いて、PBSで調製した5%ミルクを用いて、1:10,000に希釈した一次抗HA抗体で、4°Cで一晩、または室温で4時間インキュベートします。

インキュベーション後、0.1%tween 20界面活性剤を含むPBSで、5分間の洗浄を3回行います。次に、PBSで調製した5%milk中にて、マウスhorseradish peroxidaseを1:10,000に希釈した溶液で、メンブレンを少なくとも2時間インキュベートします。前と同様に3回の洗浄を行い、最後にPBSで5分間1回洗浄します。

最後に、メンブレンを化学発光検出試薬中で10分間インキュベートし、ルミネッセンス検出器を用いて検出します。検出器は自動露光設定で使用してください。タンパク質のローディング量は、AM mito black stainを用いて確認しました。

このコントロールステップにより、活性の差がタンパク質ロード量の不均一によるものではなく、実際の細胞プロセスに起因することを確認します。ここに示したレーンは、最初の実験において等量のタンパク質が使用されたことを示しています。2番目の実験では、異なる細胞株間で活性プロファイルに差が出ることが予想されたため、不均一な量のタンパク質をロードしました。

これは、M 17細胞の活性プロファイルの検出を確実にするために行われました。システイン阻害剤であり、ウェスタンブロットにおけるシグナルの減少につながるはずのエチルマイドとともにライセートをインキュベートしました。メンブレンを抗HA一次抗体でインキュベートしました。

マウス抗 horseradish peroxidase を用い、化学発光イメージングで検出します。プローブによるDUBのタグ付けに成功すると、メンブレンの各レーンにプロファイルが現れます。異なる分子量におけるバンドの強度は、DUB酵素の活性レベルに対応しています。

HeLa細胞とM17細胞においてUCHL1のような類似タンパク質を比較すると、細胞株間でさまざまなDUBの活性レベルに差があることが明らかになります。この手順の後に、細胞分画などの他の手法を行うことで、「病理学的プロセスが膜結合オルガネラのユビキチン酵素活性にどのように影響するか」といった疑問を解決することができます。

このビデオを視聴することで、活性部位標的プローブを用いて脱ユビキチン化酵素活性を測定する方法について、十分に理解することができます。