細胞株および組織試料中の脱ユビキチン化酵素の活性を測定する方法
2015年5月10日
現在のプロトコルは、機能的に相同脱ユビキチン化酵素の活性を測定する方法を詳述します。特殊なプローブは、共有結合酵素を変更し、検出を可能にします。この方法は、新たな治療標的を同定する可能性を保持しています。
次の実験の全体的な目標は、細胞内の脱ユビキチン化酵素の活性を視覚化することです。これは、細胞を高い同時流暢さまで培養し、それらを回収して、第2ステップとして濃縮されたライセートの生成を促進することによって達成されます。穏やかな機械的溶解を使用して、細胞の細胞質の代謝像を維持するライセートを生成します。
次に、活性部位のシステイン残基と反応して脱ユビキチン酵素を標識するために、酵素をヘマグルチニン由来プローブとインキュベートすると、ウェスタンブロッティングとその後の化学発光検出に基づく多くの脱ユビキチン酵素の活性プロファイルが示されました。この手法は、通常のウェスタンブロッティングなどの既存の方法と比較した場合の主な利点は、ユーザーが複数の酵素の活性を視覚化できることです。ある実験では、30ミリリットルのドベドコ、改変ワシ培地、またはDMEMと10%のウシ胎児血清を50ミリリットルの円錐管に入れて培養し、Aliによる細胞培養培地を調製します。
実験用の細胞は、凍結したM17またはA細胞を液体窒素貯蔵からぬるま湯の入った小さなビーカーに移します。次に、細胞を30ミリリットルの培地を含む50ミリリットルの円錐管に移します。次に、細胞バイアルに培地を添加し、解凍後5秒以内に再懸濁した細胞を移します。
細胞懸濁液を450Gで5分間遠心分離し、細胞ペレットを得ます。次に、20ミリリットルのメディアをT75フラスコに加えます。吸引を使用して細胞から培地を取り除きます。
細胞ペレットに5ミリリットルの新鮮な培地を加え、懸濁液を復活させます。5ミリリットルの細胞懸濁液をT 75フラスコ内の20ミリリットルの培地に移し、摂氏37度でインキュベートした。細胞を採取するために3日ごとに培地を交換します。
細胞に触れないように注意しながら、吸引して培地を取り出します。細胞を5ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水またはPBSで洗浄します。吸引を使用してPBSを取り除きます。
次に、3ミリリットルのtripsin EDTAをT 75フラスコに加え、摂氏37度で3分間インキュベートします。インキュベーション後、6ミリリットルの新鮮な培地をフラスコとresusに加えます。セルを一時停止します。
懸濁液を15ミリリットルのコニカルチューブに移し、290Gで5分間遠心分離し、上清を取り除き、5ミリリットルのPBSを加えます。チューブの底を軽くたたいてペレットを砕き、290 Gで5分間遠心分離します。PBS洗浄を3回繰り返した後、古いPBSを取り外し、細胞を1ミリリットルの新鮮なPBSに再懸濁します。
次に、細胞をeinor tubeに移し、290 GSで5分間遠心します。細胞溶解を行うには、ピペットを使用してペレットのおおよその体積を測定し、ガラスビーズと質量対体積比を1対1で秤量します。溶解バッファーをペレットの2倍の容量でペレットに加えます。
次に、ガラスビーズをペレットと溶解に加えます。アイノールチューブ内の細胞を、4°Cで最大攪拌で30分間、低温室でボルテックスすることにより緩衝します。200GSで30秒間短時間遠心分離します。
ビーズを沈殿させ、上清を回収します。前と同じ量のガラスビーズを上清の渦に加え、再び最大攪拌で4°Cで30分間攪拌し、遠心分離後、200Gで30秒間短時間加えます。ガラスビーズを落ち着かせるために、上清を集めます。
最後に5、030 GSで5分間遠心分離します。核、膜、および壊れていない細胞を除去するには、組織誘導体化のための細胞溶解物である上清をCinco nimic acidまたはBCA分析によって収集します。96ウェルプレートで、BCAタンパク質アッセイキットのプロトコルで指定されているように、コレメトリクス96ウェルプレートリーダーを使用してライセートのタンパク質濃度を決定します。
タンパク質濃度を決定した後、脱イオン水を使用して、総タンパク質の20マイクログラムから50マイクロリットルに対応するアリコートを持ってきます。次に、2マイクロリットルの1.35マイクロモルのHAUBビニール携帯電話を溶液に加えます。その結果、最終反応混合物中のプローブの50ナノモルに対して20マイクログラムのライセートが得られます。
これは大きなモル過剰です。機能的なデユビキチン酵素またはダブの標識を確実にするために、溶液を摂氏37度で1時間インキュベートします。次に、溶液にlalyサンプルバッファーを追加します。
反応容量が52マイクロリットルの場合、26マイクロリットルの2 xサンプルバッファー、13マイクロリットルの4 xサンプルバッファー、または8.87マイクロリットルの6 xサンプルバッファーを使用します。サンプルを摂氏95度で5分間インキュベートします。氷の上で冷やします。
ウェスタンブロットを行うためにゲルをロードする前に、まず12をロードし、調製したサンプルの40マイクロリットルを含む4〜20%トリスグリシンゲルをウェルする。イオンの前面が底に達するまで、ゲルを95ボルトで泳がせます。次に、ゲルをポリバインDIフッ化物またはPVDFメンブレンに一晩転写します。
移し替え まず、AMDO black stain でメンブレンをインキュベートし、メンブレンをスキャンして、各レーンのタンパク質量を示す画像を取得します。次に、メンブレンを保持させ、PBS中の5%ミルクで1時間インキュベートしてブロックします。次に、一次抗HA抗体のメンブレンをPBS中の5%牛乳中に1〜10,000の濃度で、摂氏4度で一晩または室温で4時間インキュベートします。
インキュベーション後、0.1%tween 20洗剤を含むPBSで各5分間、3回の洗浄を行います。次に、マウスセイヨウワサビペルオキシダーゼの膜をPBS中の5%牛乳中に1〜10,000の濃度で少なくとも2時間インキュベートします。前回と同様に3回の洗浄を行い、その後PBSで5分間の洗浄を1回行います。
最後に、メンブレンを化学発光検出試薬で10分間インキュベートし、発光検出器を使用して検出します。検出器の自動露出設定を使用してください。タンパク質のローディングは、AM mito black stainを用いて確認しました。
この制御ステップにより、活性の違いが実際の細胞プロセスによるものであり、タンパク質負荷が等しくないことが保証されます。ここに示されているレーンは、最初の実験で同じ量のタンパク質が使用されたことを示しています。2 番目の実験では、異なる細胞株の活性プロファイルに予想される違いのために、不等なタンパク質量がロードされました。
これは、M 17細胞の活性プロファイルを確実に検出するために行われました。ライセートは、シスチン阻害剤であるエチルメードとインキュベートされ、ウェスタンブロットでのシグナルの減少につながるはずです。メンブレンは抗HA一次抗体でインキュベートしました。
マウスウマダイコンペルオキシダーゼを、化学発光イメージングを用いて検出した。プローブを使用してダブのタグ付けが成功すると、メンブレンの各レーンにプロファイルが作成されます。異なる分子量でのバンドの強度は、ダブ酵素の活性レベルに対応します。
細胞株間のさまざまなダブの活性レベルの違いは、U CHLなどの類似タンパク質をhe a細胞とM 17細胞で比較すると明らかになります。この手順の後。細胞内分画のような他の方法は、病理学的プロセスが膜結合オルガネラのユビキチン酵素活性にどのように影響するかなどの質問に答えるために実行できますか?
このビデオを見れば、活性部位特異的プローブを使用して脱ユビキチン化酵素活性を測定する方法について十分に理解できるはずです。
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概要
このプロトコルは、特殊なプローブを使用して細胞内のデユビキチナーゼ活性を可視化する手法を説明しています。この技術により、複数の酵素活性の検出が可能となり、潜在的な治療標的に関する洞察が得られます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 生化学
背景
- デユビキチナーゼは細胞プロセスにおいて重要な役割を果たします。
- その活性を理解することで、新しい治療戦略につながる可能性があります。
- 現在の方法では複数の酵素活性を効果的に可視化できない可能性があります。
- このプロトコルは、これらの制限に対処することを目指しています。
研究の目的
- 培養細胞におけるデユビキチナーゼの活性を可視化する。
- 酵素活性プロファイリングの検出方法を改善する。
- 酵素活性分析を通じて潜在的な治療標的を特定する。
使用された方法
- 細胞を高密度まで培養し、収穫します。
- 穏やかな機械的溶解を行って濃縮された溶解物を作り出します。
- 酵素をヘマグルチニン由来のプローブとインキュベートします。
- ウェスタンブロッティングとケミルミネッセンス検出を使用して活性を評価します。
主要な結果
- この方法により、複数のデユビキチナーゼ活性の可視化が可能になります。
- ウェスタンブロット結果に基づいて活性プロファイルが生成されます。
- 結果は従来の方法と比較して技術の有効性を示しています。
- このアプローチを通じて潜在的な新しい治療標的を特定できます。
結論
- このプロトコルは、デユビキチナーゼを研究するための堅牢な方法を提供します。
- 細胞環境における酵素活性の可視化能力を向上させます。
- この発見は新しい治療戦略の開発に貢献する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Measuring deubiquitinating enzyme activity enables target validation in neurodegenerative and oncological pathways where ubiquitin-proteasome dysregulation is implicated. This assay provides a rapid, multiplexed readout of functional enzyme states, supporting early hypothesis testing and mechanistic de-risking. By capturing activity profiles across cell lines, it informs portfolio triage and lead identification efforts in target-rich disease areas.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking enzyme activity to disease-relevant phenotypes.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct visualization of active site engagement.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by distinguishing active from inactive enzyme pools in complex lysates.
- Operational Value: Accelerates target triage by profiling multiple deubiquitinating enzymes in a single assay format.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized lysate systems for downstream compound screening against deubiquitinating enzyme activity.
- Operational Value: Generates quantitative, reproducible activity readouts compatible with Western blot detection platforms.
- Scientific Value: Facilitates assay standardization by using active site-directed probes that report functional enzyme states.
- Operational Value: Enables scalable evaluation of compound effects on enzyme activity across multiple targets simultaneously.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects discovery-phase activity measurements to preclinical validation through disease-relevant cell line comparisons.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by identifying conserved activity patterns across models.
- Scientific Value: Aligns with translational biomarker strategies by monitoring enzyme activity as a functional readout of pathway modulation.
- Operational Value: Provides mechanistic de-risking data that informs target selection for IND-enabling studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation through lead identification, enabling activity-based screening and validation cascades.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing differential enzyme activity between disease and control models.
- Screening: Delivers assay-ready lysates with quantifiable activity outputs for compound library evaluation.
- Analytics: Generates chemiluminescent signal intensities that enable comparative analysis of enzyme activity states.
- Translational Research: Connects early activity profiles to preclinical continuity through cross-model validation in neuronal and cancer cell lines.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for profiling deubiquitinating enzyme activity across diverse therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing ambiguity in target mechanism of action.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized probe-based labeling and lysis procedures.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early functional validation of targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on measurable activity changes in disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, lysis optimization, and Western blot detection.
- Depends on access to hemagglutinin-derived active site probes and chemiluminescent imaging systems.
- Necessitates standardization of lysis buffer composition and protease inhibitor use across teams.
- Involves adaptation considerations for tissue samples versus cultured cells in probe accessibility.
- Limited by probe specificity and potential off-target labeling under suboptimal incubation conditions.
