Name: のゼブラフィッシュ幼生モデルにおける先天性免疫応答の非侵襲的イメージングストレプトコッカスイニエ感染 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ幼生への細菌マイクロインジェクション法と共焦点顕微鏡を用いた非侵襲的先天性免疫応答イメージング技術。宿主病原体相互作用の可視化に有用です。

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著者らは、ゼブラフィッシュのケアとメンテナンスのために研究室のメンバーに感謝したいと思います。この作品は、アンナHuttenlocherにEAハービーとNIH R01GM074827に国立衛生研究所、国立研究サービス賞A155397によってサポートされていました。

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<li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat. Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).</li>
<li>Deng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+bacterial+infection+induces+systemic+activation+of+neutrophils+through+Cxcr2+signaling+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 93 (5), 761-769 (2013).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

ここで使用される感染症法は2-3 DPF胚および幼虫において最初にローカライズされた感染に対する宿主の免疫応答の研究のために有用である。そのような耳胞などの閉じた空洞内の感染症などの炎症性刺激、の焦点は、好中球およびマクロファージ走化性および食作用の研究を可能にします。耳胞に細菌を注入する一つの注意点は、効率的に液体で満たされたキャビティ内の細菌を貪食する好中球の能力は、特定の微生物に依存し得るということである。 大腸菌や枯草菌が簡単に耳胞28中の好中球によって貪食されていませんが、我々は、好中球は、 緑膿菌とS.両方を貪食することができることを発見したこの場所16、24でイニエ 。種々の病原体の侵襲性を研究する際に局所感染にも便利です。 iの後の全身感染を引き起こすために閉じられたキャビティ内にnjectionなど耳胞として、微生物は、物理ホストの障壁を横断することができなければならない。あるいは、異なる病原体は感染の初期部位からの輸送と普及のための宿主細胞に依存してもよい。これは、変更された病原性の菌...

ストレプトコッカスイニエは、魚と人間の1の両方で全身性疾患を引き起こすことができる主要な水生病原体である。 S.ながらイニエは養殖業における大きな損失の原因である、それはまた、他の連鎖球菌のヒト病原体によって引き起こされるものと同様の臨床病理との免疫無防備状態のヒト宿主において疾患を引き起こすことができる潜在的な人畜共通感染病原体である。ヒト病原体との類似性を考えると、それは、Sを研究することが重要です自然宿主との関連でイニエ疾患の病因。 S.の大人のゼブラフィッシュモデルイニエ感染は、適応免疫系7を含むために、時間が短すぎ、感染の局所的部位、ならびに死をホストするために短期間にホスト白血球の堅固な浸潤を明らかにした。 S.に対する自然免疫応答への深い外観を得るためにインビボでの感染イニエ 、それは、nがより適しているモデルを使用することが必要である上の侵襲的なライブイメージング。 幼虫のゼブラフィッシュは、宿主 - 病原体相互作用を研究するため、ますます魅力的な脊椎動物のモデルにする多くの利点がある。ゼブラフィッシュは、比較的安価で使用し、哺乳類のモデルに比べて維持するのは簡単です。適応免疫は4-6週間後受精まで、機能的に成熟していないですが、幼虫が食作用および呼吸バースト2-6含む抗菌機能を備えた補完、Toll様受容体、サイトカイン、及び好中球およびマクロファージとの高度に保存された脊椎動物の自然免疫系を持っている、 8-11。また、遺伝的取り扱いやすさと開発の胚および幼虫の光透過性により、 生体内でリアルタイムで宿主-病原体相互作用を検討すること、蛍光標識された免疫細胞との安定したトランスジェニック系統の生成を可能にする。そのようなデンなどphotoconvertibleタンパク質を用いて、これらのトランスジェニック株の生成DRA2は、感染12の過程で個々の宿主細胞の起源と運命の追跡が可能になります。 ゼブラフィッシュ幼虫の感染モデルを開発する場合、マイクロインジェクションの選択されたサイトは、感染が最初に局所的又は全身性であるかどうかを判断します。キュビエの尾静脈またはダクト内に全身の血液の感染症は、最も一般的にゼブラフィッシュにおける微生物病原体を研究するために使用されると、ホストと微生物細胞、サイトカイン応答、および病原体株の間に病原性の違いの間の相互作用を研究するために有用である。遅い成長微生物について、16-1,000細胞期の胚の卵黄嚢への早期噴射の間であることが見出され、成長の遅い微生物のマイクロインジェクションのための最適な発達段階で、全身感染13,14を生成するために使用できる16から128細胞期15。しかし、ホスト開発の後期段階で、多くの微生物の嚢注射卵黄トンに対して致死的である傾向がある彼は、微生物および白血球16-18浸潤の欠如のために栄養豊富な環境のためにホストします。 局所感染は、通常、容易に非​​侵襲的イメージングを用いて定量することができる感染の部位に向けての白血球の指向遊走をもたらす。このタイプの感染は、白血球遊走、ならびに種々の白血球集団の異なる遊走および食作用の能力の調査を媒介するメカニズムの切開を可能にすることができる。細菌の菌株間の病原性の違いを調べるだけでなく、物理ホストの障害が全身になるために局所感染のために交差しなければならないので、微生物の侵入メカニズムを研究する際にローカライズされた感染症にも便利です。ゼブラフィッシュは、典型的には25〜31°C 19の温度で上昇するが、それらは厳しい温度要件を有する特定のヒト病原体の侵襲性の研究のために34〜35℃程度の高温で維持することができる病原性20、21のために。 多くの異なるサイトでは、後脳心室22、背側尾の筋肉18、心膜空洞23、および耳胞（耳）5、16、24を含む最初にローカライズされた細菌感染を生成するために使用されてきた。しかし、尾の筋肉への細菌の注射は、白血球応答13を調査する際に、結果を歪め得る細菌の独立した組織損傷および炎症を引き起こし得ることが見出されている。少ないダメージは後脳への注入に関連した、それは若い胚における白血球の最初は欠いているが、ミクログリアが住居を取るように、後脳心室が着実に時間をかけてより多くの免疫細胞を獲得されていますが。後脳心室は、画像へのより困難な場所です。耳胞は血管系25、26に直接アクセスすると、閉じた空洞である。それは、レイの通常欠いているkocytesが、白血球は感染症などの炎症性刺激に応答して耳胞に補充することができる。またためにイメージングの容易さおよび注入の可視化のゼブラフィッシュ熟成2-3日後に受精（DPF）中の細菌のマイクロインジェクションの好ましい部位である。したがって、我々はローカライズされた細菌感染の私たちのサイトとして、耳胞を選択しました。

<table><tbody><tr><td>1.7 ml Eppendorfs</td><td>MidSci</td><td>AVSS1700</td><td></td></tr><tr><td>14 ml Falcon tube</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>27 G x &frac12; in. needle</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>96-well Plate</td><td>Corning Incorporated</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Red</td><td>Molecular Probes,Invitrogen</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>CNA 寒天</td><td>Dot Scientific, Inc</td><td>7126A</td><td></td></tr><tr><td>ディスポーザブルトランスファーピペット</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7m</td><td></td></tr><tr><td>解剖スコープ</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>エタノール 200 プルーフ</td><td>MDS</td><td>2292</td><td></td></tr><tr><td>ファインピンセット</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>ゲルコーム</td><td>VWR</td><td>27372-482</td><td>4.2 mm幅、厚さ1.5 mm</td></tr>ガラス<tr><td>底皿</td><td></td><td></td><td>35mmの組織培養皿の底の中央に16 - 18 mmの穴を開け、穴に22 mmの丸い#1カバースリップを置き、UV光で硬化したNorland Optical Adhesive 68の薄層でシールすることによってカスタムメイドされました。</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>高融点アガロース</td><td>デンビルサイエンティフィック社</td><td>CA3510-6</td><td></td></tr><tr><td>過酸化水素</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>H325</td><td></td></tr><tr><td>レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>FV-1000システム</td><td></td></tr><tr><td>低融点アガロース フィ</td><td>ッシャー</td><td>BP165-25</td><td></td></tr><tr><td>マグネットスタンド</td><td>トライテック(成重)</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクションシステム</td><td>パーカー</td><td>ピコスプリッツァーIII</td><td></td></tr><tr><td>マイクロローダーピペットチップ</td><td>エッペンドルフ</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>Tritech(成重)</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Flaming/Brown P-97</td><td></td></tr><tr><td>ナノドロップ分光法</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>N-フェニルチオ尿素(PTU)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldheyde</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>シャー</td>レ <td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>FB0875712</td><td>100 x 15 mm</td></tr><tr><td>フェノール</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P-4557</td><td></td></tr><tr><td>フェノール レッド</td><td>リッカ 化学 会社</td><td>572516</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>水酸化カリウム</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P-6310</td><td></td></tr><tr><td>プロナーゼ</td><td>ロシュ</td><td>165921</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ ペプトン</td><td>フルカ バイオケミカ</td><td>29185</td><td></td></tr><tr><td>スモール セル カルチャー ディッシュ</td><td>コーニング インコーポレイテッド</td><td>430165</td><td>35 x 10 mm</td></tr><tr><td>スーダン ブラック</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>S2380</td><td></td></tr><tr><td>薄肉ガラス キャピラリー注射針</td><td>ワールド プレシジョン インスツルメンツ,株式 会社。</td><td>TW100-3</td><td></td></tr><tr><td>トッド・ヒューイット</td><td>シグマ アルドリッチ/フルーカ アナリティカル</td><td>T1438</td><td></td></tr><tr><td>トリカイン (エチル 3-アミノ安息香酸)</td><td>アージェント ケミカル ラボラトリー/フィンケル</td><td>C-FINQ-UE-100G</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>トゥイーン 20</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出物</td><td>フルーカ バイオケミカ</td><td>92144</td><td></td></tr></tbody></table>

のゼブラフィッシュ幼生モデルにおける先天性免疫応答の非侵襲的イメージング<em&gt;ストレプトコッカスイニエ</em&gt;感染

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

水生病原体、 ストレプトコッカスイニエは 、養殖業の年間損失億ドル以上を担当し、魚とヒトの両方で全身性疾患を引き起こすことができるである。 S.のより良い理解イニエ疾患の病因は、適切なモデルシステムが必要です。蛍光的には、免疫細胞をタグ付けして、遺伝的扱いやすさとゼブラフィッシュの初期の発達段階の光透過性は、トランスジェニック株の生成と非侵襲的イメージングを可能にします。数週間は、受精を投稿するまで、適応免疫系は、完全に機能していないですが、ゼブラフィッシュの幼虫は、好中球およびマクロファージの両方で保存された脊椎動物自然免疫系を持っている。したがって、幼虫感染モデルの生成はS.制御における自然免疫の特定の寄与の研究を可能にするイニエ感染。 微量注入の部位は、感染があるかどうかを決定する全身または最初にローカライズされた。ここでは、ゼブラフィッシュ高齢の2-3日後に受精などの感染の蛍光共焦点イメージングのための私たちの技術の耳の小胞の注射のために私たちのプロトコルを提示する。ローカライズされた感染部位は、宿主細胞および感染の普及の募集、初期の微生物の侵入を観察することができます。 S.のゼブラフィッシュ幼虫のモデルを使用して、我々の調査結果イニエ感染は、ゼブラフィッシュは、ローカライズ細菌感染における宿主好中球およびマクロファージの異なる寄与を調べるために使用できることを示している。さらに、我々は、免疫細胞の光標識は、感染の過程で、個々の宿主細胞の運命を追跡するために使用する方法を記載している。

S.のマイクロインジェクション最初にローカライズされたホストの応答で、耳胞にイニエ （ 図1と図2）の結果。正しく注入された場合には、細菌は唯一、耳胞ではなく、周囲の組織または血液中に見られるべきである。これは、フェノールレッド色素（ 図1A）を用いてマイクロインジェクションの間に可視化することができる。ラベル細菌が注入された場合あるいは、感染した幼虫のクイックスキャンはすぐに細菌が唯一、耳胞ではなく、周囲の組織（ 図1B）であることを確認することができ、注射後。なお、投与量わずか10 CFU野生型S.イニエは 24〜48時間後に感染（HPI）、非病原性株、CPSA 1000 CFUの注入内致 ​​死感染を確立することができる、致死感染を生じ、その歪みがホスト24内で増殖することができないようではありません。したがって、この局所的な感染モデルではdifferentiatすることができる変更された病原性の細菌の...

ここでは、ゼブラフィッシュの耳介における局所的な細菌感染の生成とイメージングのためのプロトコルを提示します。

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

本手順の目的は、ゼブラフィッシュ幼魚に細菌性病原体 streptococcus IEA をマイクロインジェクションし、宿主の免疫応答を非侵襲的なライブイメージングで観察することです。まず、マイクロインジェクション用針に細菌懸濁液を充填し、麻酔をかけたゼブラフィッシュ幼魚をアガロース製注入用モールド上に並べます。次に、細菌懸濁液を幼魚の耳胞にマイクロインジェクションします。その後、注入した幼魚を低融点アガロースに封入します。最後に、追跡を容易にするために宿主の免疫細胞をフォトラベルし、共焦点顕微鏡を用いて感染状態をイメージングします。最終的に、耳胞へのstreptococcus IEAのマイクロインジェクションと、それに続くフォトラベルおよび共焦点顕微鏡観察により、ゼブラフィッシュ幼魚の宿主免疫応答を解析します。尾静脈注射などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、耳胞注射によって局所的な細菌感染を誘発させることで、透明なゼブラフィッシュ幼魚における宿主と病原体の相互作用を非侵襲的にイメージングできる点にあります。まず、E3培地で1.5～2%の高融点アガロース溶液を調製し、溶液が透明になるまで電子レンジで加熱します。冷却後、アガロースをシャーレに注ぎ、底面が覆われる程度の量を加え、円を描くように混ぜ合わせます。アロスが凝固したら、洗浄して乾燥させたゲルコームを上に配置します。このとき、コームの固定端がペトリ皿の縁に接し、切り込みのある端がアロスに触れるようにしてください。コームは可能な限り水平に保ち、底面のアロス層に対して30度の角度になるようにします。コームと底面のアロス層の界面に、少量のアロスを追加で注ぎ、新しいアロス層でコームのウェルを覆います。コームを取り出す前に、完全に冷却させてください。その後、ピペットチップを使用して、ウェルから突き出ているアガロースの破片を取り除きます。インジェクションモールドの上にE three mediumを注ぎ、4°Cで保存してください。テキストのプロトコルに従ってSNEA接種源とゼブラフィッシュ稚魚の注入準備を整えた後、マイクロインジェクターの電源を入れ、時間範囲をミリ秒に設定します。二酸化炭素タンクのバルブを開き、ラインにガスを供給します。マイクロインジェクターの圧力は約20 PSIである必要があります。フェノールレッドおよびPBSで調製したSNEA培養液をボルテックスし、マイクロローダーチップを使用して、2〜3 µLの培養液を引いたガラスキャピラリー注入針にロードします。ロードした針をマグネットスタンドに接続されたマイクロマニピュレーターに取り付け、針が顕微鏡のベースに対して約45〜65度の角度になるように実体顕微鏡の下に配置します。まず、精密ピンセットを用いて針の先端を切り離し、マイクロインジェクターのフットペダルを押して、接種源の一滴を針先に分注します。顕微鏡の接眼レンズにあるスケールバーを用いて、液滴の直径を測定してください。液滴の直径は約0.10 millimeterであり、体積は約1 nanoliterである必要があります。液滴のサイズを調整するには、マイクロインジェクターの時間設定を調整するか、精密ピンセットを使用して針先をさらに切り落としてください。組織への損傷を抑えるため、注入時間は20から35ミリ秒の間に設定してください。次に、プラスチック製転送ピペットを使用し、注入成形の12個のウェルに魚を1匹ずつ移します。次に、ガラス棒、ヘアループ、またはプラスチックチップを用いて、幼魚の頭が顕微鏡の後方を向き、卵黄嚢がウェルの左側に接するように慎重に配置します。幼魚の左耳が天井方向を向くようにします。注入の準備が整ったら、マイクロマニピュレーターのノブを操作し、充填した針を耳胞に合わせて、両者が同じ視野に入るように調整します。針先で耳胞の外上皮層を貫通させ、先端がちょうど耳胞の内部に入るようにします。次に、腔を破裂させない程度の十分低い圧力でフットペダルを押し、所定用量のSNEA 1 nanoliterを注入します。注入が成功すれば、周囲の組織ではなく耳胞のみがフェノールレッド接種液で満たされます。針を幼虫から慎重に引き抜き、5倍の倍率で、幼虫が視野に入るように手で注入プレートを移動させます。蛍光顕微鏡下で蛍光標識細菌を注入する場合、注入した幼虫を視覚的に走査し、細菌の沈着が耳胞内部のみに起こっている個体だけを選別することで、実験期間を通じて注入量が一定に保たれるようにします。48個の胚ごとに、100 µLの滅菌PBSを含む1.7 mL遠心チューブに細菌懸濁液を1滴注入します。次に、100 µLをTHY＋Pオーガープレートに塗布し、37 °Cで一晩インキュベートします。注入量中のCFUを決定するために、注入ランプ上の12匹の幼虫の全グループへの注入が完了したら、プラスチック製トランスファーピペットを用いて慎重に幼虫をウェルから取り出し、新しいペトリ皿に移します。トリカ溶液を除去し、約2 mLの新鮮なE3培地と交換して、幼虫を回復させます。テキストプロトコルに従って胚をインキュベートします。テキストプロトコルに従ってTricaを含むAroを調製し、実体顕微鏡のステージ上に置いた後、転送ピペットを使用して、麻酔をかけた幼魚を4～5匹、ガラスボトムディッシュに入れます。55 °CのウォーターバスからTricaおよびAro溶液を取り出し、室温で1～2分間冷却させます。その間に、麻酔をかけた幼虫から可能な限り液体を取り除きます。次に、表面の約半分が覆われるまで、冷却したアガロースをディッシュに注ぎます。その後、ディッシュを回してアガロースを広げます。皿の側面に浮上した幼魚を回収し、ピペットで再び中央に戻します。次に、実体顕微鏡下で長いピペットチップを使用し、イメージングに適した位置に幼魚を慎重に配置します。耳胞を観察する場合、右側の耳胞が上を向き、左側の耳胞が皿の底に平らに接するように幼魚を配置してください。皿を移動させる前に、アガロースを約10分間冷却します。次に、アガロース層を湿った状態に保つため、TrizolおよびE3溶液を少 amount ピペットで静かに滴下します。サンプルの可視化には、488 nmおよび543 nmのレーザーを備えたZeiss Confocal顕微鏡を使用します。連続ラインスキャンを用いて、レーザー出力と検出器ゲインを調整します。画像取得コントロールウィンドウ上で、意図しない光変換による赤色蛍光が発生していないことを確認してください。「刺激設定（stimulus setting）」で「スキャナーツールを使用（use scanner tool）」を選択して「メイン（main）」を選び、405 nmレーザーを選択して出力を70%に設定します。次に、円形オプションを使用して、odic vesicle内の関心領域（ROI）を指定します。取得設定ウィンドウの刺激開始設定で「activation」を選択し、プリアクティベーションを1フレーム、アクティベーション時間を60,000ミリ秒に設定します。タイムスキャン項目で、光変換の前後にそれぞれ1分間のインターバルを2回設定します。タイムラプスシリーズを開始し、指定した関心領域の光変換を行います。最後に、Zackを用いて、488 nmおよび543 nmのレーザーでサンプルをスキャンします。光変換された赤色蛍光および残留している緑色蛍光を可視化します。フェノールレッドに溶解したSNEAを耳胞にマイクロインジェクションすると、初期段階で局所的な宿主反応が起こります。正しく注入されていれば、この反応は耳胞内のみで観察され、周囲の組織や血液中では観察されないはずです。あるいは、標識細菌を注入した場合は、注入直後に感染した幼魚を迅速にスキャンすることで、細菌が周囲の組織ではなく耳胞内のみに存在することを確認できます。ここで示すように、初期局在感染のマイクロインジェクション部位は、白血球の化学走性を研究するのに有用です。白血球の動員は、好中球顆粒のスーダンブラック染色、または緑色蛍光タンパク質を発現する遺伝子組換えゼブラフィッシュラインを用いた蛍光遺伝子組換えラインのホルムアルデヒド固定のいずれかによって定量化できます。マクロファージまたは好中球に特異的なDendra 2により、耳胞へのNEAの注入が、感染後60分以内に好中球とマクロファージの動員および細菌の食作用を誘発することが明らかになりました。この図では、感染5時間後に耳胞に動員されたDRAで標識された2つのマクロファージを光変換させ、その後の24時間にわたって追跡しました。光変換された細胞の一部は耳胞または頭部領域に留まっていますが、ここで示されているように、一部の細胞は幼魚の体全体に分散していることも確認されました。このビデオを視聴することで、受精後3日のゼブラフィッシュの耳胞にstreptococcus n EEAをマイクロインジェクションする方法について十分に理解できたはずです。これには、麻酔をかけた幼魚を注入用モールドに整列させ、針に細菌接種液を充填する手順（1）、耳胞へ細菌をマイクロインジェクションする手順（2）、感染させた幼魚を低融点アガロースに固定する手順（3）、そして共焦点顕微鏡を用いて宿主白血球を光ラベル化し、生体内で白血球と病原体の相互作用をイメージングする手順（4）が含まれます。

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Research

JoVE Journal

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