Name: マウス海馬にオリゴマーアミロイドベータの定位注入 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 学ぶマウス海馬歯状回へのオリゴマーアミロイドベータ1-42のステレオタクシック注入法。神経変性疾患におけるアミロイドベータの短期毒性効果を正確に評価する実験モデルを確立します。

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この作品は、神経疾患や脳卒中の助成金（CMT）にNS081333の国立研究所によってサポートされていました、アルツハイマー病協会の助成金NIRG-10から171721と国立精神衛生研究所（UHに）MH096702を付与し、高齢化資金によるアルツハイマー病研究に関する国立研究所（YYJとJBに）コロンビア大学パイロットグラントAG008702でセンター。

注：すべての動物実験では、実験動物の管理と使用のための制度や国のガイドラインに従いました。 1.外科手術器具およびソリューションの準備<ol><li>すべてのステンレス鋼の外科手術用器具をオートクレーブ。 </li><li>無菌の分子等級脱イオン蒸留水で200プルーフ無水エタノールを希釈することにより、70％エタノールを調製します。 </li><li>ハミルトンシリンジに29 G針を取り付けます。汲み上げ、1分間繰り返しナノ純水を噴射してハミルトン注射器と針の内部を清掃してください。 70％エタノールで、この手順を繰り返します。 <ol><li>ハミルトンシリンジからプランジャーと針を外します。空気は、層流フードO / Nで部品を乾燥させます。 </li><li>使用前に、30分間紫外線を針及び注射器を照射します。 </li></ol></li><li> 0.9％の体積濃度を最終重量に分子グレードの水に塩化ナトリウムを溶解して生理食塩水を調製します。 Sterili0.2μmの細孔のフィルターを通してそれをフィルタリングすることによってソリューションをぜ。 </li></ol> 2.オリゴマーAβ1-42の準備<ol><li> FA」など13の出版物に記載されているように単量体化とは、正確に5 mMのDMSO中で組換えヒトAβ1-42を再懸濁します。 </li><li>手術前日に100μMの滅菌（1×）、PBSで5 mMのAβ1-42を希釈します。 </li><li>粉砕してよく、溶液を混ぜます。 </li><li> 4℃で12時間、Aβ1-42溶液をインキュベートします。 注：このようなPBS中にDMSOを希釈またはスクランブルなどのコントロール·ソリューションは、/Aβ1-42ペプチドは、Aβ1-42と同じように準備する必要があります逆にします。 </li></ol> 3.注入座標を決定<ol><li>正確な前後（AP）、内側-外側（ML）を決定するために、成体マウスの脳アトラスを使用し、背腹（DV）は、関心14の脳領域の座標。 いいえTE：私たちはブレグマから次の座標で対象と海馬の歯状回を選んだ技術説明するために：AP、-2.00ミリメートル。 MLは、1.3ミリメートルを±します。 DV、-2.2 mmです。 AP値の前に負の符号は、ブレグマの2.00ミリメートルの後方であることを示しています。 ML値を先行±符号は、中心から左右の方向を示しています。最後に、DVの前に負の符号は、それが脳の表面から腹側に移動していることを示します。 </li></ol> 4.定位フレームの設定<ol><li>外科用フェイスマスク、きれいな白衣、および無菌手術用手袋を着用してください。 </li><li>定位固定装置、70％エタノールでマウスアダプタを拭います。 </li><li>カウンターの上に滅菌外科用ドレープを下にして置きます。 </li><li>滅菌外科用ドレープの上にマウス·アダプタとの定位固定装置を配置します。 </li><li> 70％エタノールでマウスの加熱パッドを拭きます。定位フレームのベッドの上に加熱パッドを配置します。汎用laboraを使用しますマウスアダプタベッドの上に加熱パッドダウンテープに保守党表示用テープ。 <ol><li>製造業者の指示に従って温水再循環ポンプに加熱パッドを取り付けます。 </li><li>温水再循環ポンプの電源を入れ、37℃に温度を設定し、それが温度に達するまで待ちます。 </li></ol></li><li>製造業者の指示に従って、電動垂直注入軸にそれをねじ込むことにより、定位フレーム上に29 G針で50μlのハミルトンシリンジを貼り付けます。 </li><li>ビーズ滅菌器の電源を入れ、メーカーの設定温度に達するまで待ちます。 注：これは、動物間のステンレス鋼器具を滅菌するために使用されます。これは、楽器を殺菌するためのビーズとの接触の20秒かかります。 </li><li>ホットプレートの電源を入れ、42℃に設定し、上にきれいな空のケージを置きます。 </li><li>ハミルトンシリンジを定位フレームに固定されているが、電動定位のIを使用njectorAβ1-42溶液を描画します。 注意：シリンジに溶液を4つ以上μLを描画し、その後、注入量を設定するために定位注射器を使用しています。製造元の指示に係る注射器を操作してください。 </li></ol> 5.動物の準備<ol><li>重量計を用いてマウスの重量を決定します。 </li><li>腹腔内（IP）を注入することにより、100 mgの/ kgのケタミンおよび10mg / kgのキシラジンでケタミン/キシラジンのカクテルで、マウスを麻酔。つま先ピンチ反射の消失によって麻酔深度を監視します。 </li><li>マウスが鎮静された後にバリカンを取ると頭蓋骨上の皮膚を露出させるためにその頭を剃ります。 </li><li>定位ベッドの上に加熱パッドの上にマウスを置きます。 </li><li>口を開いて、歯のガードの内側切歯を配置するために、スパチュラを使用します。マウスの顔にノーズピースを固定します。静かに、あまりにもタイトではない、それを取り締まります。 </li><li>ポジ頭を保護するために外耳道に二国間の耳のクロスバーをTION。それは頭蓋骨に当たるまでの各クロスバーを移動し、それをロックするネジを回します。 <ol><li>頭がそっと頭を下にプッシュする人差し指を使用し固定されていることを確認します。ヘッドが適切に固定されている場合はそれが出て与えることはありませんか押すと移動します。 </li></ol></li><li>湿ったそれらを保つために、目にアイクリームまたは点眼の低下を適用します。目は、外科的処置を通して湿っていることを確認してください。 </li><li>手術部位を消毒するには、70％エタノール、続いて頭蓋骨を覆う皮膚にベータダイン液を、適用するために滅菌綿棒を使用しています。 2回以上清掃交流ベタジンおよび70％エタノールを実行します。 </li></ol> 6.手術と輸液<ol><li>頭皮の正中線2-3ミリの切開を作るためにメスを使用してから、頭蓋骨、ランドマークの矢状縫合、ブレグマとラムダを露出させるために1.0〜1.5センチメートルに切開線を拡張するためにまっすぐ細かいハサミを使用します定位座標が基づいているの。離れて肌を保つために、マイクロクランプを使用してください。 注：ブレグマとラムダ位置はマウスの脳アトラス」定位座標でマウス脳&quot;14で説明されています。 </li><li> 、綿棒を取り、滅菌生理食塩水でそれを浸して、頭蓋骨をきれいにするためにそれを使用。その後、頭蓋骨を乾燥させるためにきれいな乾いた綿棒を使用しています。 </li><li>ブレグマにドットをマークするために、滅菌細かい点のペンを使用してください。針の先端がちょうどブレグマ上のドットに接触するようにハミルトンシリンジを配置するために、定位マイクロマニピュレーターを使用してください。 <ol><li>座標DVを記録します。 </li><li>針の先端は、ラムダ点に接触するように頭蓋骨のAP軸がレベルであるかどうかを確認するには、後方にハミルトンシリンジを移動します。 </li><li> DVの位置を記録します。 0.5ミリメートルの範囲内であるDVはブレグマとラムダの座標を確認してください。 注：目標は、ブレグマとラムダの間のDV差を最小にすることです。 </li></ol></li><li> mを使用しますicromanipulatorはブレグマドットに戻るハミルトン注射針の先端を返します。 </li><li>開始APの位置を記録します。 </li><li>出発APから2.00ミリメートルの座標を減算して終了APの位置を計算します。 </li><li>座標最終APにハミルトンシリンジの針の位置を変更するためにマイクロマニピュレーターを使用してください。 </li><li>現在のML座標記録します。 </li><li>左側を計算し、右MLを終了すると、座標ML開始から1.3ミリメートルを加算または減算することによって調整します。 </li><li>終了ML座標のいずれかにハミルトンシリンジ針を移動させるためにマイクロマニピュレーターを使用してください。 <ol><li>両方の終了ML座標上の頭蓋骨の表面に針先をタッチし、DVの座標を記録し、値が0.5ミリメートルの範囲内であることを確認してください。 注：目標は、2つの終了ML座標間のDV差を最小にすることです。 </li><li>終了時に頭蓋骨の上に0.5〜1センチメートルまで針を引っ張る座標間。目にドットをマークするために、滅菌細かい点ペンを取ります頭蓋骨のE面。頭蓋骨の反対側にこの手順を繰り返します。 </li></ol></li><li>邪魔にならないように明確なハミルトンシリンジをスイング。 </li><li>ドリルに0.8ミリメートルのドリルヘッドを取り付けます。 、両手でドリルを取る安定性のためにテーブルの表面上に肘を設定し、わずかに左または右ML座標のいずれかでシャーピードットの上にドリルヘッドを配置します。ドリルをアクティブにし、頭蓋骨に穴を導入するために頭蓋骨の表面にドリル先端を下げます。反対側に、この手順を繰り返します。 注：一部の出血が新たに導入された孔から発生することがあります。そこ出血している場合は、血液を軽くするため、クリーン乾いた綿棒を使用しています。 </li><li>新たに導入されたML穴のいずれかを介して元の位置に戻しハミルトンシリンジを移動します。ちょうど頭蓋骨を過ぎハミルトン針を下げます。この時点で脳を穿刺しないように注意してください。確認するために針がシュール頭蓋骨が人差し指を取り、静かにするために頭蓋骨に対して針を押して通過しました電子針は穴を終了しません。 </li><li>出発DV座標を記録します。 </li><li>終了DVが開始座標DVから2.2ミリメートルを減算することにより座標を計算します。 </li><li>座標ダウン終了DVに針を下ろします。 </li><li> 0.5μL/分の速度で歯状回にAβ1-42の4μLをポンピングする定位噴射ポンプをアクティブにします。 </li><li>注入が完了すると、針が注入部位から溶液の逆流を最小限に抑えるために追加の1分間の場所に留まるう。 </li><li>脳の反対側に針を移動し、ステップ6.13から6.18を繰り返します。 </li></ol> 7.動物の取り外しおよび術後ケア<ol><li>耳のバーや顔/鼻ガードを外します。装置からマウスを外します。 </li><li>頭皮を閉じて、縫合糸で傷をシールプルする学生標準パターン鉗子を使用してください。 </li><li>水分補給のためのIPを介してマウスに滅菌生理食塩水の1ミリリットルを注入します。 </li><li>で痛みを緩和するジェクトブプレノルフィン（0.1 mgの/ kg）を皮下に投与することができます。 </li><li>それが起きるまで、42℃のホットプレートの上に設定し、クリーン空のケージにマウスを維持し、十分な食料と水をそのハウジングケージに戻します。 </li><li>皮下注射を介して痛みの軽減のために3日間の12時間毎にブプレノルフィンを投与します。 </li></ol> 8.抜糸<ol><li> IPによっては100mg / kgのケタミンおよび10mg / kgのxlyazineでケタミン/キシラジンのカクテルで、マウスを麻酔。注：これは、7〜10日、手術後に行われます。 </li><li>縫合糸を除去するために、学生の標準パターン鉗子とストレート細かいハサミを使用してください。 </li><li>水分補給のためのIPを介してマウスに滅菌生理食塩水の1ミリリットルを注入します。 </li><li>それが起きるまで、42℃のホットプレートの上にきれいな空のケージセットでマウスを維持し、その後、十分な食料と水をそのハウジングケージに戻します。 </li></ol> 9.動物の犠牲と組織処理<ol><li>マウスとpを麻酔、4％パラホルムアルデヒド15でそれをerfuse脳を除去し、16を凍結切片のためにそれを処理します。 注：動物の犠牲のタイミングは、実験者に依存します。しかし、私たちの研究のために、私たちは7日及び14日に手術を投稿しました。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する金融利害関係がないことを宣言します。

成功したAβ1-42注入を達成するために、実験者または外科医は、必要があります：1）無菌技術を使用します。 2）正しく、正確な座標を持つ対象の脳領域を特定します。 3）適切にAPとML軸に水平に脳と定位フレームにマウスを確保することができます。 4）精度のマイクロマニピュレーターを操作する能力を有します。 5）適切な術後ケアを確保します。これらの重要なステップに従っている場合、マウスは観察されない感染症の手術に耐える必要があります。 in vitroでの研究と一致して、私たちと他の人は、Aβ1-42が直接海馬に注入されたことが示されているADの主要な特徴の一つを描いた、神経細胞死1,4,9,10を誘発します。変性1のマーカーの増加によって補完される歯状回の体積に減少によって示されるように変性は、注射部位の近傍で明らかです。また、T彼はコリン作動性標識の低下やBF 1,10におけるTUNEL陽性染色の増加によって示されるように、海馬に突出ニューロンが逆行で...

アミロイドβ（Aβ1-42）で構成されているアミロイド斑沈着は、アルツハイマー病（AD）の病理の重要な特徴です。多くの研究は、組換えオリゴマーAβ1-42の高いまたは毒性レベルが神経細胞死、シナプスジストロフィー、損失および機能障害を誘発することが示されています。ならびに学習および記憶の欠損1-4。影響を受けた脳領域は、海馬、皮質、及び前脳基底核と扁桃体の5,6のような皮質下構造を含みます。これまで、ADのAβ1-42病状をシミュレートしようとする多数のトランスジェニックマウスモデルが存在します。歪みに応じてこれらの動物は、ADの病理学的特徴の選択を検討するのに有用であることが判明しています。残念ながら、2トランスジェニックライン、APP23および5XFADを除いて、これらのマウスは完全にニューロン損失、ADの重要な側面を複製することはありません。でもAPP23と5XFAD、神経細胞死のobserで観察された神経細胞の損失でVEDは、微妙な年齢依存し、いくつかの選択領域7,8に単離しました。 野生型マウスの脳へのオリゴマーAβ1-42の直接注入はamyloidopathy 1,9,10の神経細胞死の側面を複製インビボモデルに優れたを提供します。一般的に利用するトランスジェニックマウスモデルとは異なり、オリゴマーAβ1-42注入モデルは、急性空間的、時間的な方法でAβ1-42のレベルを上昇させるのに最適です。このモデルのために、野生型マウスを使用する利点は、トランスジェニックマウスの系統に導入された変異の潜在的な補償または副作用がなくなります。過去の研究では、海馬に、Aβ1-42の毒性レベルを注入すると、1週間以内に1注射部位の近傍で神経細胞死を誘発することが示されています。また、Aβ1-42は、コリン作動性ニューロン11前脳基底部に毒性の観察と一致していること海馬に突出コリン作動性ニューロン（BFCN）集団は、効果的に脳内の孤立した神経回路の検査を可能にする、マウスにおけるβアミロイド注入1,10以下の7〜14日以内に20〜50％に減少します。大部分の制御/車両とオリゴマーAβ1-42溶液のための海馬12の歯状回に同側BFCNプロジェクトので比較は左右の半球1の間で行うことを可能にする脳のいずれかの側に注入することができます。 この報告では、成人の野生型C57BL / 6Jマウスの詳細な外科的および注射の方法論を提供します。このマウス株があるため、研究での広範な使用を選択されています。技術的には、いずれかの脳の領域は、しかし、ここで私たちは技術を説明するために、ターゲットとして、海馬の歯状回を使用し、注入のために標的とすることができます。

<table><tbody><tr><td>ケタミンHCl(100 mg / ml)</td><td>ヘンリーシャインメディカル</td><td>1049007</td>動物<td>1kgあたり100mgケタミン</td></tr>キシ<tr><td>ラジン(20mg / ml)</td><td>ヘンリーシャインメディカル</td><td>利用不可</td>動物<td>1kgあたり10mgキシラジン</td></tr><tr><td>ブプレネックス(0.3mg / ml)</td><td>ヘンリーシャインメディカル</td><td>1217793</td><td>動物1kgあたり0.1mgブプレネックス</td></tr><tr><td>A&β;1-42</td><td>David Teplow/UCLA</td><td>利用不可</td><td>100 &mu;M;このアミロイドは、論文</td></tr><tr><td>A&betaで使用されました。1-42</td><td>Bachem</td><td>H-1368</td><td>Teplow lab A&betaのアミロイドの代わりに使用できます</td></tr><tr><td>。1-42</td><td>American Peptide</td><td>62-0-80B</td> Teplow lab Scrambled A&beta <td>のアミロイドの代わりに使用できます</td></tr><tr><td>。1-42</td><td>American Peptide</td><td>62-0-46B</td><td>A&βを比較するためのコントロールペプチドとして使用できます。1-42</td></tr><tr><td>NU4 抗体 (Oligomeric Amyloid Antibody)</td><td>Gift from William Klein/Northwestern U.</td>1<td>:2,000希釈抗</td>アミロイドオリゴマー抗体<td>はご利用いただけません</td></tr><tr><td>&nbsp;(ポリクローナルウサギ)</td><td>EMD Millipore</td><td>AB9234</td><td>Nu4 の代わりに使用することができます。エンドユーザーがテストする必要があります</td></tr><tr><td>6E10 抗体 (モノクローナルマウス) (アミロイド抗体)</td><td>Biolegend</td><td>sig-39320</td><td>1:1,000 希釈</td></tr><tr><td>ChAT 抗体 (ポリクローナルヤギ)</td><td>Millipore</td><td>AB144P</td><td>1:100 希釈</td></tr><tr><td>デッドエンド 蛍光 TUNEL システム</td><td>Promega</td><td>G3250</td><td>メーカーの指示に従ってください。</td></tr><tr><td>DAPIとProlong Gold Antifade ReagentをDAPIで</td>使用 <td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td>スライドを隠すときに使用</td></tr><tr><td>Fluorogold</td><td>Fluorochrome, LLC</td><td>利用不可</td><td>2% 溶液</td></tr><tr><td>無水エタノール (200プルーフ)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-4</td> Novex 10-20% Tricine gel Life Technologies の<td>消毒および消毒のための 70% エタノールの製造</td></tr>用 <tr><td></td><td></td><td>EC6625BOX</td><td>A&betaを分離するため;1-42</td></tr><tr><td>Novex Tricine SDS ランニングバッファー (10X)</td><td>Life Technologies</td><td>LC1675</td><td>10-20% トリシンゲルのランニング用</td></tr><tr><td>Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X)</td><td>Life Technologies</td><td>LC3675</td><td>10-20% トリシンゲルの転写用</td></tr><tr><td>SuperSignal Western Blot Enhancer</td><td>Thermo Scientific</td><td>46640</td><td>A&β;1-42信号;メーカーのプロトコールに従う</td></tr><tr><td>Protran BA79 Nitrocellulose Blotting Membrane, 0.1 &mu;m</td><td>GEヘルスケアライフサイエンス</td><td>10402088</td><td>10-20%トリシンゲルを転写するため</td></tr><tr><td>Xcell SureLock Mini-Cell</td><td>Life Technologies</td><td>EI0001</td><td>電気泳動 10-20%トリシンゲルを実行するためのaparatus</td></tr><tr><td>GenTeal潤滑剤アイジェル</td>ノ<td>バルティス</td><td>は利用できません</td><td>手術中にマウスの目を湿らせておくため、地元の薬局で見つけることができます &#160; <</td></tr><tr>td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>リフレッシュオプティヴ潤滑剤点眼薬</td><td>アラガン</td><td>は利用できません</td><td>手術中にマウスの目を湿らせておくために、地元の薬局で見つけることができます。GenTeal</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Stoelting</td><td>50998</td><td></td></tr>の代わりに使用できます <tr><td>ラウンド/テーパードスパチュラの</td>消毒と消毒用&nbsp;<td>VWR</td><td>82027-490</td><td>動物の口を開くための</td></tr><tr><td>ブルドッグ セリファイズ クランプ (ジョー ディムス 9X1.6 mm;長さ:28 mm)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>18050-28</td><td>オプション。注射時に頭皮の皮膚を離すための</td></tr><tr><td>ストレートファインハサミ(刃先25mm;長さ11.5cm)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14060-11</td>頭<td>皮を切るため</td></tr><tr><td>#3メスハンドル</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>#11外科用ブレード</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>10011-00</td>頭<td>皮切開を行うため</td></tr><tr><td>学生標準パターン鉗子(先端寸法2.5x1.5mm;長さ 11.5 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91100-12</td><td>縫合中に頭皮を閉じたまま保持するため</td></tr><tr><td>トリマーコンボキット</td><td>ケントサイエンティフィック</td><td>CL9990-1201</td><td>髪を剃る場合</td></tr><tr><td>T/ポンプ 温水リサーキュレーター&nbsp;</td><td>ケント・サイエンティフィック&nbsp;</td><td>TP-700</td><td>手術中の動物の温暖化用</td></tr><tr><td>蘇生可能なウォーマイニングパッド (5インチ x 10インチ)</td><td>ケントサイエンティフィック&nbsp;</td><td>TPZ-0510FEA</td><td>手術中に動物を温めるためにT /ポンプ温水リサーキュレーターに取り付けるため</td></tr><tr><td>コードレスマイクロドリル</td><td>ストールティング</td><td>58610</td><td>0.8 mmのスチールバリを使用して頭蓋骨に穴を開けます</td></tr><tr><td>ラボ マウスとマウス付きの標準定位固定装置器具新生児ラットアダプター</td><td>Stoelting</td><td>51615</td><td></td></tr><tr><td>Just for Mouse Stereotaxic Instrument</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td>Stoelting Cat. #51615</td></tr><tr><td>Quintessential Ligtaxic Injector</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>Dry Glass Bead Sterilizer</td><td>Stoelting</td><td>50287</td><td>滅菌用ステンレス製器具</td></tr><tr><td>滅菌外科用ドレープ (18" x26")</td><td>Stoelting</td><td>50981</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Syringe 50 ml, Model 705 RN SYR, NDL</td><td>Hamilton Company</td><td>7637-01</td><td>脳注射用; 異なる溶液に異なるシリンジを使用</td></tr><tr><td>29 G Needle, Small Hub RN NDL</td><td>Hamilton Company</td><td>7803-06</td><td>脳注射用ハミルトンシリン</td></tr>ジに取り付けるため <tr><td>1 ml BD ツベルクリンシリンジ</td><td>VWR</td><td>BD309659</td><td>麻酔と生理食塩水の投与用</td></tr><tr><td>30 G 針 (0.5インチ)</td> <td>VWR</td><td>BD305106</td><td>麻酔と生理食塩水の投与用</td></tr><tr><td>ポータブル電子 CS シリーズ スケール (Ohaus)</td> <td>VWR</td><td>65500-202</td><td>動物の体重を量って麻酔線量を決定するため</td></tr><tr><td>ホットプレート (トッププレート 寸法 7.25x7.25 インチ)</td> <td>VWR</td><td>47751-148</td><td>動物の温暖化用 手術後</td></tr><tr><td>ソフシルクシルク縫合糸 C-1 カッティング3/8, 12 mm</td><td>Covidien</td><td>S1173</td><td>創傷閉鎖用</td></tr><tr><td>Vetbond 組織接着剤 (3M)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-361931</td><td>オプション:創傷閉鎖の補助用;縫合糸と一緒に使用します。</td></tr><tr><td>綿先端木製シャフト滅菌アプリケーター</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>22-029-488</td>手術<td>創の洗浄と乾燥用</td></tr>フィ<tr><td>ッシャーブランドスーパーフロストプラス顕微鏡スライドフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>12-550-15</td><td>脳切片の収集用</td></tr><tr><td>VWR マイクロカバー ガラス 24 X 50 mm</td><td>VWR</td><td>48393241</td><td>顕微鏡スライドの取り付け用</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene シリンジ フィルター 0.2 &mu;m</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>194-2520</td><td>生理食塩水の滅菌用</td></tr><tr><td>Viscot Medical</td><td>Medline</td><td>VIS1422SRL91</td><td>頭蓋骨の座標をマーキングするため</td></tr></tbody></table>

マウス海馬にオリゴマーアミロイドベータの定位注入

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

アルツハイマー病は、高齢化に影響を与える神経変性疾患です。疾患の重要な神経病理学的特徴は、アミロイドβの過剰産生と罹患個体の脳領域におけるアミロイドβ斑の沈着です。年間を通して、科学者は、アミロイドベータ病理を複製しようとする多数のアルツハイマー病のマウスモデルを生成しました。残念ながら、マウスモデルは、選択的に、疾患の特徴を模倣します。神経細胞死、アルツハイマー病患者の脳における顕著な効果は、顕著に、これらのマウスに欠けています。ニューロンに最も毒性であることが証明されているアミロイドβの形 - - 定位脳へしたがって、私たちと他の人が直接アミロイドβの可溶性オリゴマー種を注入する方法を採用しています。このレポートでは、選択脳領域におけるアミロイドベータレベルを増加させるこの手術法を文書化するために雄のC57BL / 6Jマウスを利用しています。ザ注入ターゲットは、コリン作動性回路によって接続されている前脳基底部と一緒に、この脳の構造ため、海馬の歯状回である疾患における変性の領域のいずれかを表します。細胞死における同時増加とブロカの対角バンドの垂直肢におけるコリン作動性ニューロンの損失がある間定位注入を介して歯状回におけるアミロイドβの上昇の結果は、1週間以内に歯状回におけるニューロン損失の増加を明らかに前脳基底部の。これらの効果は、2週間まで観察されます。我々のデータは、現在のアミロイドβ注入モデルは、短期的に特定の領域のニューロン死に対処するための代替的なマウスモデルを提供することを示唆しています。このモデルの利点は、アミロイドベータが、空間的および時間的な方法で上昇させることができるということです。

ヒト組換えオリゴマーAβ1-42の調製本発明の方法は、モノマー、ダイマー、トリマー、およびテトラマー（ 図1A）からなる可溶性オリゴマー種をもたらします。これらの低分子量のAβ1-42の種ではなく、原線維およびプラークは、ニューロン1,4,9,17-19に最も毒性であることが、多数の設定で示されています。オリゴマーAβ1-42は、マウスの脳内の神経細胞死を誘導するかどうかを確認するには、Aβ1-42（100μMストック溶液4μl）を9ヶ月齢の野生型C57BLの1半球に海馬のDGに注入しました/ 6Jマウス。 C57BL / 6Jための海馬の重量は、約0.018グラムであると推定され、従って、Aβ1-42の送達は、約100μgの/ gであったれます。 Aβ1-溶解に使用されるDMSOの等量のから成って-同じマウス脳の反対側のDGは、制御/媒体溶液を注入しました42（1×）をPBSで希釈した-比較のために。上述したように、以前にスクランブルか、我々が以前に...

ここでは、アミロイドベータの脳定位固定剤を直接注入するためのプロトコルを紹介します。この方法論は、アミロイドベータが脳ニューロンに及ぼす短期的な影響に対処するための代替のin vivoマウスモデルを提供します。

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

この手順の全体的な目標は、Liga meric a beta 1 42 を海馬の歯状回に定位固定装置で注入することです。これは、最初にリガメリック、ベータ1 42溶液を調製することによって達成されます。2 番目のステップは、インジェクション座標を決定することです。次に外科的に、動物の頭蓋骨を露出させ、針を挿入するために2つの穴をその中に導入します。最後のステップは、シリンジ針を最終位置に移動し、ベータ1 42を注入することです。最終的に、脳定位固定装置Abeta 1 42注射法を使用して、生きた動物におけるAbeta 1 42の毒性効果を調べます。この技術が既存のトランスジェニックAbeta 42マウスモデルと比較した場合の主な利点は、オリゴマーALA 42を特別かつ時間的に上昇させ、トランスジェニックマウスモデルに欠けている細胞死の病理を確実に再現できることです。この方法は、アルツハイマー病における病理学的プロセスがどのように広がるかなど、アルツハイマー病分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手順を開始するには、麻酔をかけたマウスの頭を剃って皮膚を露出させます。次に、マウスを定位固定装置フレームの加熱パッドに置きます。次に、切歯を歯のガードに固定し、マウスの顔にノーズピースをかぶせます。その後、イヤーバーを聴覚マウスに配置して、頭を固定してチェックします。ヘッドが固定されている場合は、ヘッドをそっと押して動かないようにします。次に、両目に軟膏を塗り、しっとりとした状態を保ちます。その後、頭蓋骨の上の皮膚にベタジンを塗布し、続いて滅菌綿棒で70%エタノールを塗布して手術部位を消毒します。ベタジンとエタノールの洗浄を交互にさらに2回行います。次に、メスで頭皮の正中線に2〜3ミリメートルの切開を行います。まっすぐな細いハサミを使用して切開線を約1.0センチメートルに伸ばし、頭蓋骨の矢状縫合bgmaとラムダを露出させます。その後、鉗子を使用して皮膚を引き離します。滅菌生理食塩水に浸した滅菌綿棒で頭蓋骨を清掃します。次に、清潔で乾いた綿棒を使用して頭蓋骨を乾かします。次に、ドットをマークします。Bre maの位置で、マイクロマニピュレーターを使用してハミルトンシリンジを配置し、針の先端がbgmaのドットにちょうど触れるようにします。次に、ラムダポイントにドットをマークするDV座標を記録し、シリンジをラムダポイントの後方に移動して、頭蓋骨のAP軸が水平であることを確認します。針の先端は、bgmaポイントと同様にラムダポイントに接触する必要があります。その後、DVの位置を記録します。Bre、MA、および Lambda の DV 座標は 0.5 ミリメートル以内である必要があります。次に、針先をBMAドットに戻します。開始APの位置を記録します。次に、開始 AP から 2 mm を引いて、終了 AP の位置を計算します。シリンジ針を最終的なAP座標に調整して再配置します。次に、現在のML座標を記録します。開始 ml から 1.3 ミリメートルを加算または減算して、左右の両端 ml 座標を計算します。シリンジ針を調整し、終了ML座標に移動します。針先を両端のML座標の頭蓋骨の表面に接触させ、DV座標が0.5ミリメートル以内にあることを確認します。ml座標の末尾で、頭蓋骨の0.5〜1センチメートル上に針を引き上げます。頭蓋骨に暗い色の極細ポイントマーカーでドットをマークします。頭蓋骨の反対側に対してこの手順を繰り返します。次に、シリンジを離します。左または右のmlに穴を開け、0.8ミリメートルのドリルビットを使用して頭蓋骨に調整します。反対側についてもこの手順を繰り返します。その後、シリンジを新しく導入した穴の1つに移動します。針を頭蓋骨のすぐ過ぎまで下げ、針が頭蓋骨を通過したことを確認するために脳に穴を開けないように注意してください。針を頭蓋骨にそっと押し付けて、針が穴から出ないようにします。次に、開始DV座標を記録します。終了dvを計算します。開始 DV.Coordinate から 2.2 mm を減算して座標し、終了 db まで針を下げます。次に、脳定位固定装置インジェクターポンプを、ベータ1 42の4マイクロリットルを毎分0.5マイクロリットルの速度で歯状回に注入するように設定します。注入後、注射部位からの溶液の逆流を最小限に抑えるために、針をさらに1分間所定の位置に留まらせます。.その後、針を脳の反対側に移動させ、施術を繰り返します。次に、イヤーバーを緩めます。学生用標準パターン鉗子を使用して頭皮を引っ張り、縫合糸で傷口をシールします。ノーズガードを外し、マウスを取り外します。1ミリリットルの滅菌生理食塩水をマウスに最初に注射して水分を補給し、痛みを和らげるためにブプレノルフィンを1キログラムあたり0.1ミリグラムで皮下に注射します。.その後、マウスが目覚めるまで、摂氏42度のホットプレートの上に設置された清潔な空のケージにマウスを移します。次に、マウスを十分な餌と水を入れたハウジングケージに戻します。この図は、9か月齢のマウスの左右の歯状回にベータ1 42とビヒクルをそれぞれ注入したことを示しています。破線は注入管を示し、矢印は崩壊した歯状回を示しています。Abeta 1 42の注射から1週間以内に、歯状回は、7日後と14日後に、注射部位に近い分子層と多型細胞層でAbeta 1 42レベルの上昇を示しました。Abeta 1 42は、トンネル陽性染色の増加と歯状回の厚さの減少を誘発し、Abeta 1 42の神経変性効果を確認しました。ここでは、逆行性トレーサーフルオロゴールドをAbeta 1 42とともに歯状回に同時注入しました。注射の7日後、フルオロゴールドが前脳基底部で検出され、コリン作動性ニューロンを介した標識の逆行性輸送が示唆されました。基底前脳のフルオロゴールド陽性ニューロンを定量化のために選択しました。注射の7日後、Abeta 1 42はトンネルの増加とチャットの減少を誘発しました。基底4つの脳のポジティブニューロン この手法を習得すると、適切に実行すれば約30分で完了します。この手順に続いて、脳に対するアミロイド注入の機構的影響に対処するための分子メカニズムの研究など、他の方法を使用して追加の質問に答えることができます。私たちのビデオをご覧いただき、ありがとうございます、そしてこの方法があなたの実験に役立つことを願っています。

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神経科学

アルツハイマー病の特徴のひとつは、Aβの上昇です。...

β-アミロイドオリゴマーの調製 1から42まで</sub海馬スライスでのシナプス可塑性の減損の>と誘導

このビデオは、アミロイドベータ(Aβ)ペプチド特異的抗体をラットの海馬に連続注入する技術を示しています。この研究では、Aβペプチド特異的抗体の制御された注入と可溶性Aβオリゴマー(Aβo)のラット海馬への注入を組み合わせて、オリゴマーと抗体との間の相互作用を研究するための両側カニューレシステムを埋め込むことを採用しています。...

Aβペプチド特異的抗体とAβオリゴマーのラット海馬への制御注入

このビデオは、アルツハイマー病のマウスモデルを確立するために、歯状回へのアミロイドベータの正確な定位固定装置注入を示しています。アミロイドβタンパク質の正確な座標決定と制御された送達は、ニューロンの分解を引き起こし、記憶処理を混乱させ、アルツハイマー病の発症に寄与します。...

アルツハイマー病モデルのためのアミロイドベータタンパク質の脳定位直接注入

出典:Arango-Lievano, M. et.al., Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases(脳血管系の縦断的In vivoイメージング:中枢神経系疾患との関連性)。J. Vis. Exp. (2016)このビデオは、蛍光標識されたアミロイドプラークと脳血管系を視覚化するためのin vivo...

アルツハイマー病モデルマウスにおける脳血管およびアミロイドプラークのin vivoイメージング

出典: Slezia, A. et al.てんかん病巣へのγ-アミノ酪酸(GABA)の電気泳動送達はマウスの発作を予防するJ. Vis.

麻酔マウスのてんかん病巣へのGABAの電気泳動送達

マイクロRNAは、脳の構造と機能に重要な役割を持っている。ここでは、設計されたmiRNAの発現レンチウイルスの定位注射を使用して過剰発現海馬のmiRNAを強制する方法について説明します。このアプローチは、評価するための比較的急速な方法として役立つことができる...

の定位注入マイクロRNA発現マウス海馬CA1領域にレンチウイルスと行動アウトカムの評価

アミロイドβ（Aβ）は、動物モデルが定義された量とAβ断片の種の管理を可能にし、各研究グループ内の個人差を低減-injected。このプロトコルは、正常マウスにおけるアルツハイマー様の行動異常の製造を可能にする、定位楽器なしでAβの脳室内（ICV）注射を説明しています。...

急性アルツハイマーなどの認知障害を誘発するために正常マウスにおけるアミロイドβペプチドの脳室内注射

この記事は、神経伝達物質受容体の発現を定量化する方法と、光遺伝学的ツールのウイルス形質導入と凍結骨折レプリカ免疫標識技術の組み合わせを使用して、シナプス前およびシナプス後要素が特定されたシナプスでのパターンを分析する方法を示しています。...

複合光遺伝学および凍結破砕レプリカ免疫標識をマウス扁桃体におけるグルタミン酸受容体の入力固有の配置を検討すること

慢性アミロイドβオリゴマー輸液の動物モデルにおける神経変性は、浸透圧ポンプを用いて抗体治療フューズによって打ち消されます

マウスの子宮内生存の手術では...

超音波ガイド下のマウスの前脳へのマイクロインジェクション子宮内で E9.5で

学ぶマウス海馬歯状回へのオリゴマーアミロイドベータ1-42のステレオタクシック注入法。神経変性疾患におけるアミロイドベータの短期毒性効果を正確に評価する実験モデルを確立します。

マウス海馬にオリゴマーアミロイドベータの定位注入

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