細胞透過性のCysを用いて哺乳動物細胞への直接タンパク質送達 ₂ -His ₂ジンクフィンガードメイン

ジンクフィンガードメインは、本質的に細胞透過性及び広範囲の哺乳類細胞型へのタンパク質の送達を媒介することができる。ここでは、細胞内タンパク質の送達のためのジンクフィンガーの技術を実施するための詳細なステップバイステップのプロトコルが提供される。

この手順の全体的な目標は、ジンクフィンガードメインを使用して、緑色蛍光タンパク質などの機能タンパク質を哺乳類細胞に送達する方法を実証することです。これは、まず、エメラルドグリーン蛍光タンパク質MGFPをジンクフィンガードメインに翻訳融合させた発現プラスミドを生成することによって達成されます。第2のステップは、蛍光融合タンパク質を細菌に発現させることです。

次に、細菌細胞を溶解し、蛍光融合タンパク質を精製します。最後のステップは、精製された蛍光融合タンパク質と哺乳類細胞をインキュベートして取り込みを可能にすることです。最終的には、処理した細胞の蛍光をフローサイトメトリーで定量化し、細胞への融合タンパク質送達の効率を判断できます。

泥棒やHIV由来のタイトペプチドやポリアルギニンなどの他のタンパク質形質導入ドメインの主な利点は、フィールド酵素カーゴの活性を損なうことなく、高レベルの細胞質送達を促進できることです。PCRを開始するには、プラスミドからエメラルドGFPまたはMGFP配列を増幅し、テキストプロトコルに従って、ゲル抽出キットを使用してPCR産物を精製し、次いで分光光度計を使用してDNA濃度を定量する。次に、アラニンの配列を含むPET28発現ベクターを得る。

2本のフィンガー、ジンクフィンガーまたは2つのFZドメイン、消化ベクター、およびMG F-P-P-C-R製品を、DNA1マイクログラムあたり10単位の酵素を使用してXMAおよびSAC one制限酵素に置換し、消化物を摂氏37度で3時間インキュベートします。ゲル抽出によりDNA断片を精製し、ベクターとMG F-P-P-C-R製品の濃度を測定します。分光光度計を使用して、MG F-P-P-C-R製品と50〜100ナノグラムのベクターを1本のチューブに組み合わせ、インサートとベクターのモル比を6対1

次に、T 4 DNAリガーゼを1ユニット添加し、室温で1時間で反応をインキュベートし、ライゲーションプラスミドで細菌を形質転換します。溶ける。氷上の化学的に有能な大腸菌細胞の50マイクロリットルのアリコート。次に、ライゲーションされたDNAと100〜20ナノグラムの細胞を穏やかに混合し、氷上でDNAと細胞を30分間インキュベートします。

インキュベーション後、細胞を摂氏42度で90秒間熱ショックします。2ミリリットルのSOC培地をチューブに加え、細胞を摂氏37度で1時間回復させ、形質転換体を選択します。缶マイシン1ミリリットルあたり50マイクログラムを含むLB寒天プレートに100マイクロリットルの培養物を広げ、翌日プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。

缶マイシン1ミリリットルあたり50マイクログラムを含むLBの6ミリリットル培養物に、オーバーナイトプレートから分離されたコロニーを接種します。培養物を37°Cで一晩、振とうしながらインキュベートします。翌日、細胞を採取してミニプレップし、プラスミドを単離し、プライマーでシーケンシングしてプラスミドを確認します。

T 7プロモーターの場合、プラスミドには、2つのFZドメインのMGFPへのN末端翻訳融合が含まれている必要があります。タンパク質精製を開始するため。まず、BL 21を精製したプラスミド100ナノグラムで細胞を均等化します。

缶マイシンを含むLB寒天上の形質転換体のために選択し、翌日接種 一晩プレートから単一のコロニーを持つ缶マイシンを含むLB培地の10ミリリットルの培養物をインキュレートし、振とうしながら摂氏37度で一晩培養し、一晩のコロニー全体を1リットルのLB培地に希釈し、缶マイシン0.2%グルコースと100マイクロモルの塩化亜鉛を補給します。37°Cで培養物を振とうしながらインキュベートし、600ナノメートルの光学密度0.8に達するまで培養し、その後、IPTGを最終濃度2ミリモルまで添加して発現を誘導します。6時間の誘導後、5, 000倍Gで培養物を摂氏4度で10分間遠心分離し、細胞を収穫します。

細胞ペレットを5ミリリットルの溶解緩衝液に懸濁し、次いで50%の電力出力と5秒×10秒のオフサイクルで4分間の太陽光を用いて氷上で細胞を溶解する。次に、細胞溶解物を25,000倍Gで摂氏4度で30分間遠心分離し、次いで上清を氷上の新しい収集チューブに移す。タンパク質を精製するには、1ミリリットルの硝酸ニッケル酢酸スラリーをあらかじめ充填したカラムに上清をロードします。

上清をカラムに流した後、20ミリリットルの洗浄バッファーでレジンを洗浄します。5ミリリットルの溶出バッファーでカラムからタンパク質を溶出させ、溶液を透析チューブに移し、透析後一晩でタンパク質と保存バッファーを透析します。スピン濃縮器を使用して、Gの3000倍を1時間遠心分離することにより、タンパク質を少なくとも40マイクロモルに濃縮します。

保存用のテキストプロトコールに示されているように、タンパク質の濃度と純度を決定します。1.5ミリリットルのフージチューブにタンパク質を200マイクロリットルにアクアし、MGFP融合タンパク質を光退色から保護するためにチューブをホイルで覆います。次に、フラッシュし、タンパク質を液体窒素で凍結し、摂氏マイナス80度で保存して、タンパク質形質導入の準備を最初に500マイクロリットルの溶液の500マイクロリットル/ミリリットルの溶液で24ウェルプレートのウェルを準備します。

ポリリジンを摂氏25度で30〜60分間。細胞培養物を播種する前に、ウェルから溶液を吸引します。10%のFBSと1%の抗生物質抗真菌を含むDMMの細胞を、5%の二酸化炭素を含む加湿インキュベーターで摂氏37度で治癒します。

細胞を収穫し、ウェルあたり200、000細胞の密度で24ウェルプレートに播種します。次に、細胞が80〜90%コンフルエントになったら、インキュベーションの約24時間後に24ウェルプレートをインキュベーターに入れます。各ウェルから培地を吸引し、500マイクロリットルの予温無血清培地またはSFMで細胞を洗浄します。

2マイクロモルのZ-M-G-F-Pタンパク質と100マイクロモルの塩化亜鉛を含む250マイクロリットルのSFMを各ウェルに加え、細胞を摂氏37度で1時間インキュベートします。次に、ウェルから培地を吸引し、500マイクロリットルのカルシウムおよびマグネシウム遊離ドコスリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で細胞を3回洗浄し、ヘパリン1ミリリットルあたり0.5ミリグラムを補充します。次に、200マイクロリットルの0.05%tripsin EDTAをウェルに加え、摂氏37度で2分間インキュベートして、細胞をプレートから分離します。

分離した細胞を新しいチューブに移し、Gの300倍で5分間遠心分離します。次に、1%FBSを添加した500ミリリットルのDPBSに細胞を再懸濁し、前述のようにファイトチャネルを使用したフローサイトメトリーによりサンプルの平均蛍光強度を測定する。前方散乱と側面散乱を調整して、関心のある母集団をスケールに配置します。

次に、定義されたゲーティングを使用して、コントロールサンプルとテストサンプルを分析します。サンプルごとに 10 、 000 個のライブベントを収集し、フローサイトメトリー解析ソフトウェアを使用してデータを処理します。タンパク質処理細胞の蛍光強度をコントロール血清処理細胞に正常化します。

大腸菌でZif MGFP融合タンパク質を産生し、SDSページで精製および分析しました。これらの結果は、2本のフィンガーZIF MG FP 融合タンパク質が 95% 以上の均質性で精製されたことを示しています。ヘロ細胞をZIFF MG FP 融合タンパク質の濃度を上げて処理したとき。

彼らは、2マイクロモルの濃度でZ MG FP融合タンパク質を用いたフローサイトメトリーの連続処理によって測定された平均蛍光強度の用量依存的な増加を示し、MGFP蛍光を有する細胞のほぼ100%をもたらしました。このビデオを見れば、泥棒タンパク質トランザクションドメインを使用して機能タンパク質を細胞に送達する方法を十分に理解できるはずです。