Name: 細胞透過性のCysを用いて哺乳動物細胞への直接タンパク質送達 2 -His 2ジンクフィンガードメイン (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: 学ぶジンクフィンガードメインを用いた哺乳動物細胞へのタンパク質送達法。プラスミド構築、大腸菌発現、精製、細胞取り込み、フローサイトメトリーによる効率評価の詳細プロトコルを解説します。

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この作品は、とShanghaiTech大学、上海、中国（DP1CA174426カルロスF.バルバスへ）（JL）の国立衛生研究所によってサポートされていました。分子グラフィックスはPyMOLをを使用して生成された。

1.クローニング<ol><li>をpET-28の発現ベクター系にサブクローン化し、要求（PET-2F-ZIF）承りますされてきたアラニン置換二本指ZIFドメインを取得します。34 </li><li> PCRはプライマーを用いて、プラスミドエメラルド-のpBADからEmGFPを増幅5 &#39;のXmaI-EmGFP（5&#39;-GGAAATTG CCCGGG ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3&#39;;太字でXmaIで I部位）および3 &#39;のSacI-EmGFP（5&#39;-CGGATCT GAGCTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3&#39; ;太字のSacI部位）。 <ol><li>蒸留/脱イオン水で構成された残りの容量は100μlの溶液中で鋳型DNA 5ngの、10×ポリメラーゼバッファー、Taq DNAポリメラーゼの1単位（U）、0.2mMの10μlの各dNTP、各プライマー、0.2μMを使用。サイクル条件を使用してください：95℃、5分間。 1分30秒、72℃30秒間、55℃、95℃の30サイクル; 10分間72℃である。ゲルextractiによってPCR産物を精製し上とABS 260×50 / mlの測定分光光度計を用いてDNA濃度を決定する。 </li></ol></li><li>ダイジェストをpET-2F-ZIFおよび1μgのDNAあたりの酵素10 Uを使用して、37℃で3時間のための推奨バッファ内の制限酵素XmaIで IとSacIでEmGFPをコードするインサート。臭化エチジウム等の蛍光インターカレート色素を用いたアガロースゲル電気泳動によりDNAを可視化する。 </li><li>ゲル抽出キットによって消化されたDNAを精製し、腹筋260×50 / mlのを測定する分光光度計でDNA濃度を決定する。 </li><li> RTで少なくとも1時間のT4 DNAリガーゼの1 Uを用いたPET-2F-ZIFの50-100 NGに精製されたEmGFPをコードするDNAを連結。 1のインサート·ベクターのモル比：最高の結果を得るには、6を使用してライゲーション反応を行う。 </li><li>氷の上の任意の化学的にコンピXL-1ブルー大腸菌細胞50μlを解凍し、連結し、pET-2F-ZIF-EmGFPの10-20 NGで軽く混ぜる。 </li><li> 3氷上で保管してください0分。 90秒間、42℃でヒートショックの混合物を、振とうしながら37℃で1時間、異化代謝産物抑制（SOC）とスーパー最適ブロスの2ミリリットルで細胞を回収する。 </li><li> 50μg/ mlのカナマイシンを含むLB培地（LB）寒天プレート上に回復培養物100μlを広げ、37℃でO / Nインキュベートする。 </li><li>翌日、スーパーブロス（SB）または50μg/ mlのカナマイシン、37℃でLB寒天プレート培養O / Nから1つのコロニーとを含むLB培地6mlの接種。 注：コロニーPCRプライマー5 &#39;のXmaI-EmGFPおよび3&#39;を用いてのSacI-EmGFPをミニプレップする前に、陽性クローンを同定するために使用することができる。 </li><li>ミニプレップによりたpET-2F-ZIF-EmGFPを精製し、T7プロモーターを用いてDNA配列決定によりプラスミドを確認し（5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGG-3 &#39;）。 </li></ol> 2.発現および精製<ol><li>化学的にコンピテントBL21 E.50μlの解凍氷の上で大腸菌の細胞およびPLをpET-2F-ZIF-EmGFP 100ngので軽く混ぜるasmid。ステップ1.7から1.8に記載されているように変換します。 </li><li>翌日、単一コロニーを50μg/ mlのカナマイシンを含むLB培地10mlに接種し、振盪しながら37℃でO / Nを成長させる。 </li><li>翌日、50μg/ mlのカナマイシン、0.2％グルコースおよび100μMのZnCl 2を補充したLB培地1L中にO / N培養物を10mlに希釈。 0.8の600nmで（OD 600）での光学密度に振とうしながら37℃で培養物を成長させ、2 mMのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）を用いてタンパク質発現を誘導する。 37℃での増殖の6時間後に、4℃で10分間、5000×gでの遠心分離により収穫細胞。 注意：誘導条件は非常に可変であり、発現しているタンパク質の安定性に依存します。 0.8のOD 600に達するまでOD 600を 30分ごとに監視します。 </li><li>溶解緩衝液5ml（50mMトリス-HCl、500mMのNaCl中で細胞ペレットを再懸濁し、100μMのZnCl 2を 、1メートルMジチオスレイトール（DTT）、1mMのMgCl 2、1mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）、および10 mMイミダゾール、pHは8.0）。溶解以下の設定で超音波処理することにより氷上で細胞：/ 10秒オフの間隔で5秒で50％の電力出力、4分の処理時間。ソリューションの過熱を防ぐ。 </li><li> 4℃で30分間25000×gで細胞溶解物を遠心分離し、新鮮な収集チューブに上清を移す。最良の結果を得るには、4℃でのすべての次の手順を実行します。 </li><li>平衡化されたNi-NTAスラリーの1ミリリットルで予め充填したカラムに上清を実行します。洗浄緩衝液を20ml（50mMトリス-HCl、500mMのNaCl、100μMのZnCl 2、1mMのDTT、1mMのMgCl 2、30 mMイミダゾール、pH8.0）で樹脂を洗浄する。 </li><li>溶出緩衝液5ml（50mMトリス-HCl、500mMのNaCl、100μMのZnCl 2、1mMのDTT、1mMのMgCl 2、300 mMイミダゾール、pH8.0）でタンパク質を溶出する。 </li><li>バッファは、ストレージ·バッファーで溶離したタンパク質（50mMの交換をトリス-HCl、500mMのNaCl、100μMのZnCl 2、1mMのDTT、1mMのMgCl 2、10％グリセロール、pH8.0）で、製造業者の説明書に従って遠心分離によってスピン濃縮器を用いて、少なくとも40μM、タンパク質を濃縮する。 </li><li> BCAやBradfordアッセイによりタンパク質濃度を決定します。 、2μlの2×SDS-PAGEローディング色素で精製タンパク質を2μlを混合し、10分間95℃で沸騰した後、タンパク質純度（ 図2）を評価するために、4％-20％トリス-グリシンSDS-PAGE上で解決する。 </li></ol> 3.タンパク質貯蔵<ol><li>濃縮タンパク質、-80℃で液体窒素とストア内のフラッシュ凍結アリコート。 EmGFP融合タンパク質については、光からタンパク質を保護するためにアルミホイルでチューブをカバーする。 </li><li>タンパク質溶液の凍結融解の繰り返しは避けてください。注意：ZIF融合タンパク質は、少なくとも1ヶ月間、これらの条件下で安定である。不適切または&gt; 4月のストレージがつながる可能性タンパク質沈殿またはEmGFPの光退色に。 </li></ol> 4.タンパク質導入<ol><li> 10％（v / v）のウシ胎児血清（FBS）および1％抗生物質-抗真菌37℃、5％CO 2に完全に加湿雰囲気中を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中でHeLa細胞を維持する。 注：細胞は30倍以上のタンパク質導入のために推奨されていません継代した。 </li><li> 25℃で30から60分間ポリリジンを50μg/ mlの500μlのプレコート24ウェルプレート。ウェルあたり2×10 5細胞の密度で24ウェルプレート上にシード細胞。播種後24時間で、または細胞に一度80パーセント-90％コンフルエントの間にある、各ウェルから培地を除去し、予め温めておいた無血清DMEM（SFM）を500μlで洗浄する。 </li><li>各ウェルに、ZIF-EmGFPタンパク質及び100μMのZnCl 2の2μMを含むSFMの250μlを添加する。 1時間37℃で細胞をインキュベート。注意：ZIFドメインが細胞に入るPRimarilyエネルギー依存性機構であるマクロピノサイトーシス、34を介して。したがって、細胞は、効率的なタンパク質の内在化のために37℃でインキュベートされなければならない。 </li><li>細胞から培地を除去および0.5mg / mlのヘパリンを補足したカルシウムおよびマグネシウムを含まないダルベッコのリン酸緩衝食塩水（DPBS）500μlで3回洗浄する。注：ヘパリン下流分析を複雑にする可能性があり、表面に結合したタンパク質を除去する必要がある。 </li><li>強化された配信のための3回まで（オプション）を繰り返しトリートメント。 </li><li>すぐに2分間37℃で、0.05％トリプシン-EDTAを用いて消化することにより洗浄した後、ヘパリン処理した細胞を単離する。 1％FBSを補充したDPBS 0.5mlに剥離した細胞を再懸濁する。 </li><li>フルオレセインイソチオシアネート（FITC）チャンネル（ 図3）を用いてフローサイトメトリーにより35を 、各サンプルの蛍光強度を測定する。の人口を配置する前方散乱（FSC）および側方散乱（SSC）を調整異なる特性を持つ集団が相互に解決されることを保証する規模の利息、。 </li><li> SFMのみで処置した細胞にZIF-EmGFPで処理したHeLa細胞から36ノーマライズ蛍光を、各サンプル10,000ライブイベントを収集し、フローサイトメトリーデータ分析ソフトウェアを用いてデータを分析する。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もない。

ここでは、細胞透過性のジンクフィンガー（ZIF）ドメインを用いてタンパク質送達のためのステップバイステップのプロトコルが提供される。 ZIFドメインは、融合した、酵素貨物34の活性を低下させない。非修飾タンパク質で観察されるものとほぼ同じ収率でのタンパク質の産生および精製を可能にする。そして伝統的な細胞透過性ペプチドまたはタンパク質導入ドメインシステムを超える効率を有する広範囲の細胞型にタンパク質および酵素を輸送することができる。まとめると、これらの知見は、広範囲の用途のための細胞への直接タンパク質送達を媒介するためのZIFドメインの幅広い可能性を示している。 最大のタンパク質の送達は、以前より大きな正電荷を運ぶ3および4フィンガーZIFドメインの配列を延長にもかかわらず、唯一の二本指ZIFドメインを使用して達成された。これらの知見は、ZIF媒介細胞侵入、電荷、株式会社以外の要因によって影響されるかもしれないことを示すタンパク質の安定性または配座剛性をluding。 ZIFドメイン媒介性タンパク質の送達はまた、エネルギー依存性であることが見出され、従って、タン...

高効率と汎用性タンパク質の送達戦略は、多くの基礎研究および治療用途のために重要である。細胞への精製されたタンパク質の直接送達は、これを達成するための最も安全で簡単な方法のいずれかを表す。核酸からの遺伝子発現に依存する戦略とは異なり1,2、3-5タンパク質の送達は、挿入突然変異の危険をもたらすことはないとは無関係である細胞の転写/翻訳機構と即効することができます。しかし、タンパク質上に細胞透過活性の賦与するための簡単​​で一般化方法の欠如は、日常的に細胞への直接のエントリを混乱させる。細胞内タンパク質の送達を容易にするための現在の方法は、天然6-8または設計された細胞透過性ペプチド、9-12過給導入ドメイン、13,14ナノ粒子15およびリポソーム16ウイルス様粒子17,18発生の使用に基づいている</SUP&gt;とポリマーマイクロスフェア材料。19残念ながら、これらのアプローチの多くは、低細胞取り込み率、20,21安定性が悪く、22不注意細胞型特異性、23低いエンドソーム脱出特性24と毒性によって妨げられている。さらに、25、多くのタンパク質形質導入技術は、配信するタンパク質の生物活性を減らす。14 キメラ制限がプログラム可能なのCys 2 -His 2ジンクフィンガーDNA結合タンパク質とFokI制限エンドヌクレアーゼ26-28の切断ドメインからなるエンドヌクレアーゼ- -本質的に無細胞である私たちの研究室では、以前ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）のタンパク質があることを実証した透過性。29この驚くべき細胞透過活性はカスタム設計ジンクフィンガードメイン、ターゲットゲノムENのための強力なツールとして浮上しているDNA結合プラットフォーム固有の性質であることが示されたgineering、30-32およびタンパク質表面の6つの正に荷電した残基のコンステレーションの結果であると考えられる。実際、c-Junの及びN-DEKを含むいくつかのDNA結合タンパク質は、細胞膜を通過する先天的能力を有することが示されている。 図33は、さらに最近では、我々の研究室では、これらの結果に展開され、亜鉛の細胞透過活性のことを実証指（ZIF）ドメインは、細胞内のタンパク質送達のために活用することができた。従来の多くの細胞透過性ペプチド送達システムを超えた効率性を取り込むために導いた特定のタンパク質の貨物に一次元または二本指をZIFドメインのどちらかの遺伝子融合。34最も顕著、ZIF媒介送達が融合した、酵素貨物の活性を危うくし、促進しませんでした細胞質ゾルデリバリーの高レベル。まとめると、これらの知見は、タンパク質の効率的かつ容易な送達を促進するためのZIFドメインの可能性を実証し、潜在的により多様な種類のマクロ細胞内への分子、。 ここでは、哺乳動物細胞におけるタンパク質の送達のためのZIF技術を実装する方法の詳細なステップバイステップのプロトコルが提供される。我々は以前に一次元、二次元、三、四速、五起因αヘリックスDNA結合残基のそれぞれの置換を、DNAに結合する能力を欠いている6フィンガーZIFドメインのスイートを構築したが、セル34（ 図1）にタンパク質を送達することができる。二本指ZIFドメインを使用してHeLa細胞にエメラルドGFP（EmGFP）の産生および形質導入が記載されている。このプロトコルは、 大腸菌での可溶性発現が可能なほぼすべてのタンパク質、ほぼ任意の哺乳動物細胞型に拡張可能である。期待される結果を提供し、このシステムのパフォーマンスを最大化するための戦略もまた、議論されている。

<table><tbody><tr><td>XmaI</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>R0180L</td><td></td></tr><tr><td>SacI</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>R0156L</td><td></td></tr><tr><td>ハイフィデリティ PCR システム</td><td>ロシュ</td><td>11759078001</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>N0446S</td><td></td></tr><tr><td>4%-20% トリス-グリシン ミニタンパク質ゲル、1.5 mm、10 ウェル</td><td>ライフ テクノロジー</td>ズ <td>EC6028BOX</td><td></td></tr><tr><td>2xLaemmli サンプルバッファー</td><td>BioRad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA リガーゼ</td><td>Life Technologies</td><td>15224-017</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) コンピテント E. coli</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>C2527I</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0391</td><td></td></tr><tr><td>塩化亜鉛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086-5G</td><td></td></tr><tr><td>硫酸カナマイシン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP152-25</td><td></td></tr>塩化<tr><td>ナトリウム</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>S9888-25G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>PR-V3151&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTAアガロース樹脂</td><td>QIAGEN</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513-25G</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 遠心フィルターユニット</td><td>EMO Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>生命技術</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌薬&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>24ウェルフラットボトムプレート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3527-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>DPBS、カルシウム、マグネシウムなし</td><td>Life Technologies</td><td>21600010</td><td></td></tr><tr><td>ヘパラン硫酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4777</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>25300054</tr><tr><td>HeLa細胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Nano Drop ND-1000 分光光度計&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquickPCR精製キット</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquickゲル抽出キット</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr></tbody></table>

細胞透過性のcysを用いて哺乳動物細胞への直接タンパク質送達<sub&gt; 2</sub&gt; -his<sub&gt; 2</sub&gt;ジンクフィンガードメイン

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

そのモジュール性と広範囲のDNA配列を認識するための再プログラム能力により、Cys2-His 2 zinc-finger DNA結合ドメインは、標的ゲノムエンジニアリングのための有用なツールとして浮上しています。他の多くのDNA結合タンパク質と同様に、ジンクフィンガーも細胞膜を横断する先天的な能力を持っています。私たちは最近、この固有の細胞透過性が細胞内タンパク質の送達に利用できることを示しました。ジンクフィンガーモチーフの遺伝的融合により、タンパク質と酵素のカーゴが幅広い哺乳類細胞タイプに効率的に輸送されます。他のタンパク質形質導入技術とは異なり、ジンクフィンガードメインを介した導入は酵素活性を阻害せず、高レベルの細胞質導入につながります。ここでは、哺乳類細胞へのタンパク質送達のためのジンクフィンガー技術の実装について、詳細なステップバイステップのプロトコールを紹介します。高レベルの細胞内亜鉛フィンガー媒介送達を達成するための主要なステップが強調され、このシステムのパフォーマンスを最大化するための戦略について説明します。

二本指ZIF-EmGFP融合タンパク質はE.で発現させることができる大腸菌 &gt; 95％の均質性及び高収率で（&gt; 25 mg / ml）で（ 図2）。一般的には、1次元と2本指のZIF融合タンパク質は、野生型非修飾タンパク質のものとほぼ同じ量で製造することができる。しかし、いくつかの文脈において、5員環及び6フィンガーZIF融合タンパク質は、下流の用途のために十分に高い収率で製造することができない。 37℃で90分間インキュベートしたHeLa細胞上に二本指ZIF-EmGFPタンパク質の直接適用は、EmGFP蛍光（ 図3A）の用量依存的な増加をもたらす。批判的に、蛍光はZIFドメインの非存在下で観察されない。我々は以前、細胞のほぼ100％が、わずか2μM二指ZIF-EmGFP蛋白質で処理した後、蛍光性であることが観察され、ZIF融合タンパク質で処理したHeLa細胞は、タンパク質濃度でEmGFP蛍光に関して陽性であることを<html> 0.25μM（ 図3...

ジンクフィンガードメインは、本質的に細胞透過性及び広範囲の哺乳類細胞型へのタンパク質の送達を媒介することができる。ここでは、細胞内タンパク質の送達のためのジンクフィンガーの技術を実施するための詳細なステップバイステップのプロトコルが提供される。

細胞透過性のCysを用いて哺乳動物細胞への直接タンパク質送達<sub&gt; 2</sub&gt; -His<sub&gt; 2</sub&gt;ジンクフィンガードメイン

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

本手順の全体的な目的は、ジンクフィンガードメインを用いて、緑色蛍光タンパク質などの機能性タンパク質を哺乳類細胞へ導入する方法を実演することです。まず、エメラルド緑色蛍光タンパク質MGFPをジンクフィンガードメインに翻訳融合させた発現プラスミドを作製します。次に、この蛍光融合タンパク質を細菌で発現させます。次に、細菌細胞を溶菌させ、蛍光融合タンパク質を精製します。最終ステップとして、精製した蛍光融合タンパク質を哺乳類細胞とともにインキュベートし、細胞内への取り込みを行わせます。最終的に、処理した細胞の蛍光をフローサイトメトリーで定量することで、細胞への融合タンパク質導入効率を決定できます。thiefや、HIV由来のTATペプチド、ポリアルギニンなどのその他のタンパク質導入ドメインの主な利点は、輸送される酵素カーゴの活性を損なうことなく、高レベルの細胞質への導入を促進できることです。PCRを開始するには、テキストプロトコルに従ってプラスミドからemerald GFPまたはMGFP配列を増幅させ、ゲル抽出キットを用いてPCR産物を精製し、分光光度計を用いてDNA濃度を定量します。次に、アラニンの配列を含むPET 28発現ベクターを入手します。2本のフィンガー（ジンクフィンガーまたは2つのFZドメイン）を含む消化済みベクターとMG F-P-P-C-R産物を、DNA 1 µgあたり10 unitの制限酵素を用いてXMA1およびSAC1で処理し、37 °Cで3時間インキュベートします。ゲル抽出によりDNA断片を精製し、ベクターとMG F-P-P-C-R産物の濃度を測定します。分光光度計を用いて、MG F-P-P-C-R産物と50〜100 ngのベクターを、インサートとベクターのモル比が6:1になるように単一のチューブに混合します。次に、1 unitのT4 DNAリガーゼを加え、室温で1時間インキュベートして、ライゲーションされたプラスミドを細菌に形質転換させます。化学的コンピテントE. coli細胞の50 µL分注液を氷上で融解させます。その後、細胞を100～20 ngのライゲーション済みDNAと穏やかに混合し、氷上で30分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞を42 °Cで90秒間ヒートショックします。チューブにSOC培地2 mLを加え、37 °Cで1時間振盪しながら細胞を回復させ、形質転換体を抽出します。50 µg/mLのカナマイシンを含むLB寒天培地に、培養液100 µLを塗布し、37 °Cで一晩インキュベートします。50 µg/mLのカナマイシンを含む6 mLのLB培地に、オーバーナイト培養プレートから単一コロニーを接種します。この培養液を37 °Cで振とうしながら一晩インキュベートします。翌日、細胞を回収してミニプレップを行いプラスミドを単離し、その後、プライマーを用いてシーケンシングによりプラスミドを確認します。T7プロモーターを用いるため、プラスミドは2つのFZドメインとMGFPのN末端翻訳融合タンパク質を含んでいる必要があります。タンパク質精製を開始するには、まずBL 21(DE3)細胞に100 ngの精製プラスミドを形質転換します。翌日、カナマイシンを含むLB寒天培地で形質転換体を選択します。 overnightプレートから単一コロニーを、カナマイシンを含む10 mLのLB培地に接種し、37 °Cで振盪しながら一晩培養します。この一晩培養したコロニー全体を、カナマイシン、0.2% glucose、および100 µM chlorideを含む1 LのLB培地で希釈します。600 nmにおける吸光度（OD₆₀₀）が0.8に達するまで、37 °Cで振盪しながら培養し、その後、発現を誘導するためにIPTGを最終濃度2 mMになるように添加します。誘導後6時間で、4 °Cにて5,000 ×gで10分間遠心分離し、細胞を回収します。細胞ペレットを5 mLの溶解バッファーで再懸濁し、超音波処理（出力50%、5秒ON/10秒OFFのサイクル）を用いて氷上で4分間細胞を溶解させます。次に、細胞溶解液を4°Cで25,000 ×g、30分間遠心分離し、上清を氷上の新しい回収チューブに移します。タンパク質を精製するため、1 mLのニッケルニトリロ三酢酸スラリーをあらかじめ充填したカラムに上清をロードします。上清をカラムに通した後、20 millilitersの洗浄バッファーで樹脂を洗浄します。5 millilitersの溶出バッファーでカラムからタンパク質を溶出し、その溶液を透析チューブに移して、タンパク質と保存バッファーで一晩透析します。スピンコンセントレーターを用い、3000 ×gで1時間遠心分離して、タンパク質を40 micromolar以上に濃縮します。保存に向けて、テキストプロトコルに従ってタンパク質濃度と純度を決定します。1.5 milliliterのフュージチューブに200 microlitersのタンパク質溶液を分注し、MGFP融合タンパク質を光退色から保護するためにチューブをアルミホイルで覆います。その後、タンパク質を液体窒素で急速凍結し、-80 degrees Celsiusで保存します。タンパク質導入の準備として、まず24ウェルプレートの各ウェルに50 micrograms per milliliterの溶液を500 microlitersずつプレコートします。25°Cで30～60分間、ポリリジンで処理します。細胞を播種する前に、ウェルから溶液を吸引除去します。10% FBSおよび1% 抗生物質・抗真菌剤を含むDMMを用い、5% 二酸化炭素濃度の加湿インキュベーター内、37°Cで細胞を培養します。細胞を回収し、1ウェルあたり 200, 000 cells の密度で 24ウェルプレートに播種します。その後、細胞が 80 ～ 90% コンフルエントになるまで約 24 時間インキュベートし、24ウェルプレートをインキュベーターに入れます。各ウェルから培地を吸引し、予温した 500 µL の無血清培地（SFM）で細胞を洗浄します。2 µMのZ-M-G-F-Pタンパク質と100 µMの塩化亜鉛を含むSFMを各ウェルに250 µLずつ加え、細胞を37 °Cで1時間インキュベートします。次に、ウェルから培地を吸引し、0.5 mg/mLのヘパリンを添加したカルシウムおよびマグネシウム不含リン酸緩衝生理食塩水（DPBS）500 µLで細胞を3回洗浄します。続いて、0.05% Trypsin EDTAを各ウェルに200 µL加え、37 °Cで2分間インキュベートして細胞をプレートから剥離させます。遊離した細胞を新しいチューブに移し、300 ×gで5分間遠心分離します。次に、1% FBSを添加したDPBS 500 mLで細胞を再懸濁し、既報の方法に従い、FITCチャンネルを用いてフローサイトメトリーによりサンプルの平均蛍光強度を測定します。前方散乱光（FSC）および側方散乱光（SSC）を調整し、目的の細胞集団がスケール内に収まるようにします。次に、定義したゲーティングを用いて、コントロール群とテストサンプルの解析を行います。サンプルあたり10,000個の生存細胞を収集し、フローサイトメトリー解析ソフトウェアを使用してデータを処理します。タンパク質処理した細胞の蛍光強度を、コントロール血清処理した細胞に対して標準化します。Zif MGFP融合タンパク質をE. coliで発現させ、精製後、SDS-PAGEにより解析しました。これらの結果から、2本指のZIF MG FP融合タンパク質が95%以上の均一性で精製されたことが示されました。HeLa細胞を、濃度の異なるZIF MG FP融合タンパク質で処理したところ、フローサイトメトリーで測定した結果、平均蛍光強度の用量依存的な増加が認められました。2 µMの濃度のZ MG FP融合タンパク質で連続的に処理したところ、細胞のほぼ100%にMGFP蛍光が確認されました。このビデオを視聴することで、機能性タンパク質を哺乳類細胞に導入するためのタンパク質移行ドメインの使用方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

タンパク質導入は、細胞に生物学的に活性なタンパク質の直接配信を可能にします。このようなDNAトランスフェクションまたはウイルス形質導入などの従来の方法とは対照的に、この非侵襲的なパラダイムは、細胞毒性および永久的な遺伝子修飾による発癌性形質転換のリスクを回避滴定可能な方法で高効率な細胞の操作が可能になります。...

エンジニアリング細胞透過性のタンパク質

ポストヒトゲノム時代において、ネイティブコンフォメーションにおける組換えタンパク質の可用性は、構造、機能および治療の研究開発に不可欠である。ここでは、テストと組換えタンパク質のさまざまなを生成するために使用することができるヒト胚性腎臓293T細胞における大規模タンパク質発現系を記述します。...

ヒト細胞から分泌タンパク質の生産のための便利で一般式プラットフォーム

細胞の急速な機械的な変形は高分子およびナノ物質の細胞内送達のための有望な、ベクトルフリー法として浮上している。このプロトコルは、幅広いアプリケーションのためのシステムを使用する方法の詳細な手順を提供しています。...

堅牢、マイクロ流体細胞内送達プラットフォームとしての細胞絞る

哺乳類システムによる組換えタンパク質の発現は、構造生物学のためのタンパク質複合体を生成するための魅力的な方法になりつつあります。ここでは、浮遊増殖した哺乳類細胞を使用して構造研究のためのタンパク質複合体を精製する、シンプルでありながら高効率な発現システムを紹介します。...

HEK 293F懸濁細胞における構造生物学のための組換えタンパク質の発現：小説とアクセアプローチ

ここでは、HEK293T細胞を使用した費用対効果の高いグランザイム発現システムについて説明し、高収量の純粋で完全にグリコシル化され、酵素活性のあるプロテアーゼを生成します。...

哺乳動物細胞におけるヒトグランザイムの高収量およびコスト効率の高い発現システム

私たちは、エンドサイトーシスオルガネラをリーキーにする試薬との簡単な共インキュベーションプロトコルにより、タンパク質と細胞不透過性の小分子を培養された哺乳類細胞に送達する方法を説明します。...

エンドソーム溶解試薬dfTATとのインキュベーションによって生細胞へのタンパク質、ペプチドまたは細胞不浸透性小分子の送達

これは、分泌されたグリコシル化された哺乳類タンパク質の生産と、その後のX線結晶構造解析やその他の生物物理学的研究のための十分な収量の均質なタンパク質のシングルステップ精製のための迅速で費用対効果の高いプロトコルです。...

効率的な哺乳動物細胞発現および結晶化のための細胞外糖タンパク質のシングルステップの精製

適切な翻訳後修飾を伴う真核生物タンパク質の実験室規模での生産は、大きな障壁を表しています。ここでは、哺乳類の発現システムを使用したタンパク質発現の迅速な確立とターンアラウンドを実現する堅牢なプロトコールをご紹介します。このシステムは、選択的アミノ酸、タンパク質の選択的標識、および糖鎖組成の低分子モジュレーターをサポートします。...

懸濁液中のHEK293細胞の一過性トランスフェクションによる組換えヒトタンパ​​ク質のハイ・イールド式

既存の植物改変の方法は適用性が限られています。ここで提案されている新しいペプチド由来の技術は、無傷の植物の目的の細胞内コンパートメントへの外因性タンパク質または遺伝子の導入における簡便性と効率性の両方を約束します。...

植物の細胞や細胞小器官の壁を越え遺伝子やタンパク質を輸送するために、ペプチド由来方法

これは、組み合わせシーケンスの細胞貫通の目新しさとビオチン-アビジン プルダウン ・ システムに基づく細胞内タンパク質間相互作用を研究するためのプロトコルです。主な利点は、ターゲット シーケンスはセル lysates...

細胞内タンパク質間相互作用を研究するビオチン化セル透過ペプチド

学ぶジンクフィンガードメインを用いた哺乳動物細胞へのタンパク質送達法。プラスミド構築、大腸菌発現、精製、細胞取り込み、フローサイトメトリーによる効率評価の詳細プロトコルを解説します。

細胞透過性のCysを用いて哺乳動物細胞への直接タンパク質送達

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