Name: 不死化ソートB細胞からの組換えヒトIgGモノクローナル抗体の作製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 学ぶ不死化ソートB細胞からの組換えヒトIgGモノクローナル抗体作製法。Epstein-Barrウイルスによる不死化と流式細胞計測によるIgG陽性細胞選択を用い、自己免疫応答研究に有用な高品質抗体を効率的に産生する技術です。

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研究契約ミゲルServet（ISCIII CD14 / 00032）から（GN-G。）。 （CH）の科学研究「トランスレーショナル神経科学プログラム研究科 &quot;のオランダ機構（022005019）からフェローシップ。 プリンセスベアトリクスフォン（プロジェクトWAR08-12）と協会フランセーズcontreレミオパシーからの補助金（PM-M。）;ならびに科学研究費オランダ機構（916.10.148）のVeniフェローシップによるオランダの脳財団のフェローシップ（FS2008（1）-28）とプリンセスビアトリクスフォン（プロジェクトWAR08-12）（MLへ）。 我々は、フローサイトメトリーによる選別B細胞の彼女の助けのためJozienヤスパースに感謝します。

<ol><li>Vrolix, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+heterogeneity+of+thymic+B+cells+from+early-onset+myasthenia+gravis+patients+with+antibodies+against+the+acetylcholine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Clonal heterogeneity of thymic B cells from early-onset myasthenia gravis patients with antibodies against the acetylcholine receptor.</a> J Autoimmun. 52, 101-112 (2014).</li>
<li>Yamashita, M., Katakura, Y., Shirahata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+generation+of+human+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the generation of human monoclonal antibody.</a> Cytotechnology. 55 (2-3), 55-60 (2007).</li>
<li>Pereira, K. M., Dellavance, A., Andrade, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+identification+of+autoantibodies+specific+to+systemic+autoimmune+rheumatic+diseases+in+high+throughput+operation%3A+Proposal+of+reliable+and+feasible+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">The challenge of identification of autoantibodies specific to systemic autoimmune rheumatic diseases in high throughput operation: Proposal of reliable and feasible strategies.</a> Clin Chim Acta. 437, 403-410 (2014).</li>
<li>Losen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+myasthenia+gravis+by+preventing+acetylcholine+receptor+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Treatment of myasthenia gravis by preventing acetylcholine receptor modulation.</a> Ann N Y Acad Sci. 1132, 174-179 (2008).</li>
<li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+fully+human+monoclonal+antibodies+specific+to+a+vaccinating+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen.</a> Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).</li>
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<li>Traggiai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+to+make+human+monoclonal+antibodies+from+memory+B+cells%3A+potent+neutralization+of+SARS+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus.</a> Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).</li>
<li>Fraussen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantigen+induced+clonal+expansion+in+immortalized+B+cells+from+the+peripheral+blood+of+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Autoantigen induced clonal expansion in immortalized B cells from the peripheral blood of multiple sclerosis patients.</a> J Neuroimmunol. 261 (1-2), 98-107 (2013).</li>
<li>Yamashita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+individual+immune+responses+elicited+by+in+vitro+immunization%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Different individual immune responses elicited by in vitro immunization.</a> Cytotechnology. 40 (1-3), 161-165 (2002).</li>
<li>Hui-Yuen, J., Koganti, S., Bhaduri-McIntosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+B+cell+immortalization+for+monoclonal+antibody+production%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Human B cell immortalization for monoclonal antibody production.</a> Methods Mol Biol. 1131, 183-189 (2014).</li>
<li>Tiller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+monoclonal+antibodies+from+single+human+B+cells+by+single+cell+RT-PCR+and+expression+vector+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning.</a> J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).</li>
<li>Lanzavecchia, A., Corti, D., Sallusto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+monoclonal+antibodies+by+immortalization+of+memory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Human monoclonal antibodies by immortalization of memory B cells.</a> Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 523-528 (2007).</li>
<li>Traggiai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+of+human+B+cells%3A+analysis+of+B+cell+repertoire+and+production+of+human+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immortalization of human B cells: analysis of B cell repertoire and production of human monoclonal antibodies.</a> Methods Mol Biol. 901, 161-170 (2012).</li>
<li>Strober, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+cell+growth.+Curr+Protoc+Immunol+%2F+edited+by%5BTitle%5D)+AND+%22John+E.+Coligan+...+%5Bet+al.%5D%22%5BJournal%5D)">Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol / edited by.</a> John E. Coligan ... [et al.]. Appendix 3, Appendix 3A(2001).</li>
<li>Ibrahim, S. F., van den Engh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+and+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biochem+Eng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry and cell sorting.</a> Adv Biochem Eng Biotechnol. 106, 19-39 (2007).</li>
<li>Leith, J. T., Padfield, G., Faulkner, L. E., Quinn, P., Michelson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+feeder+cells+on+the+X-ray+sensitivity+of+human+colon+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiother+Oncol%22%5BJournal%5D)">Effects of feeder cells on the X-ray sensitivity of human colon cancer cells.</a> Radiother Oncol. 21 (1), 53-59 (1991).</li>
<li>Hui-Yuen, J., McAllister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-McIntosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+Epstein-Barr+virus+growth-transformed+lymphoblastoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishment of Epstein-Barr virus growth-transformed lymphoblastoid cell lines.</a> J Vis Exp. (57), 3321(2011).</li>
<li>Smith, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+detection+in+automated+DNA+sequence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis.</a> Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係がないことを宣言します。

本稿では、ヒトPBMCからのIgG抗体の生成のためのすべてのステップを詳細に示します。このプロトコルは、以前に公表された技術を超えるいくつかの利点が含まれています。利点の一つは、産生された抗体は、B細胞クローンの元の対に対応する重鎖および軽鎖を保つことです。 IgG抗体の同定は、ヒトドナーの任意のタイプで行うことができ、ワクチン接種5による免疫応答の悪化を必要としません。それらは形態学的に異なると区別することは非常に容易であるので、フィーダー細胞として線維芽細胞株の使用WI38は、前述の作品にフィーダー細胞として使用したPBMCと比較して、成長しているクローンのより迅速な検出を可能にします1,6- 8。またフィーダー細胞としてWI38の使用が簡単にすべての実験の前に解凍し、培養することができる細胞アリコートの大量の凍結を促進します。 クリティカルの一つこのプロトコルでiCalの手順では、原料である：PBMCを。血液は遠心分離のためにあまりにも長い間待っていた場合、またはPBMCの抽出後、彼らは、適切な凍結条件に保存されません。生存細胞の数...

この論文の目的は、具体的にヒト末梢血単核細胞（PBMC）から得られたヒトIgGモノクローナル抗体を作製し、特徴づけるための方法を記述することです。 ヒト抗体を研究するための関心は、研究のさまざまな分野に成長しました。特に、多くの研究グループは、自己抗体によって引き起こされる病理1-3に興味を持っています。我々は、クローン化され、1病原性の自己抗体を特徴としています。自己抗体の研究は、競合抗体4を使用して、 例えば 、それらの標的を同定し、治療戦略を開発するのに役立ちます。また、ヒト抗体の研究はまた、露出して特定の病原体6または研究するためにどのに耐性となった個体の抗体プロフィールを特徴付けるために、ワクチン接種後5免疫応答を評価するために、 すなわち 、研究の他の分野に関心のものであることができます抗体がです天然のレパートリー7,12。 いくつかの技術が、組換えヒトモノクローナル抗体8-12を生成するために開発されています。これらのほとんどは、ファージディスプレイおよびB細胞の不死化を使用します。ファージディスプレイの使用は、広範囲に新13抗体の検出に適用されています。しかし、となるヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖対は、プロセス中に解離していること、すなわち、主要な欠点​​を有します。ヒトB細胞またはEBV形質転換とハイブリドーマの生産は、この欠点を克服します。 我々は、Toll様受容体9（TLR-9）、6,12を介して、ポリクローナルB細胞刺激と組み合わせたEBVで胸腺B細胞の感染を使用します。 本稿では、in vitroでの抗体生成にPBMC単離からのすべてのステップの完全な概要と、詳細に我々は、IgGヒト抗体の開発のために使用する技術が記載されています。このこのプロトコルは、ヒトIgGのプロファイルのいずれかのタイプの分析のために使用することができます。我々の研究室では、IgG抗体を産生するB細胞が正常にソートした後のPBMCの残りの部分から分離されました。五8は 、マルチウェルプレートに播種し、単一のB細胞のクローン性増殖のために、EBV及びTLR-9活性化によって不死化することができるB細胞を選別しました。フィーダー細胞としては、ヒト胎児肺組織からの線維芽細胞は、不死化B細胞の可視化を容易にする細胞系WI38が、使用されています。これらのB細胞から、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の配列を、PCRにより得ることができる、および抗体」遺伝子は、免疫グロブリンGを発現ベクター中にクローン化し、 インビトロで生成しました。この技術を用いて、ドナーに見られる全く同じ抗体配列を有する単一の抗体を試験することができます。

<table><tbody><tr><td>Histopaque-1077&nbsp;</td><td>ポリスクロースとジアトリゾ酸ナトリウムを含む</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td>溶液</tr><tr><td>FACSAria IIセルソーター&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 U底マイクロウェルプレート&nbsp;</td><td>共演者</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>アドバンスドロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)1640ミディアム&nbsp;</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>12633-020</td><td></td></tr><tr><td>B95-8細胞株の30% v/v EBV含有上清&nbsp;&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-1612</td><td>3.4 x 108 コピー/ml</td></tr><tr><td>CpG2006&nbsp;</td><td>Invivogen</td><td>ODN 7909</td><td></td></tr><tr><td>Wi38細胞&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>90020107</td><td></td></tr><tr><td>インターロイキン2</td>号<td>ロシュ&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10799068001 ELISAプレート</td><td>Greiner Bio-One, Microlon</td><td>655092</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fc&gamma;Fragment Specific (unconjugated)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-006-008</td><td></td></tr><tr><td>4% non-fat dry milk (Blotting Grade Blocker)&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>ヒトIgG&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I 2511</td><td>HUMAN IgG精製免疫グロブリン、5.6 mg/ml</td></tr><tr><td>ヤギF(ab)2抗ヒトIgG Fc&γ;(ペルオキシダーゼ(PO)と結合)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-036-008</td><td></td></tr><tr><td>ELISAリーダー(Perkin Elmer 2030)&nbsp;</td><td>パーキン・エルマー&nbsp;</td><td>2030-0050</td><td></td></tr><tr><td>ペルオキシダーゼ結合 AffiniPure rabbit 抗ヒト IgM, Fc5&micro;&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>309-035-095</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III細胞直接cDNA合成システム&nbsp;</td><td>インビトロジェン&nbsp;</td><td>18080-200</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR System 2700</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高純度 RNA 単離キット&nbsp;</td><td>ロシュ</td><td>社 11828665001</td><td></td></tr><tr><td>逆転写システムキット&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A3500</td><td></td></tr><tr><td>組換え Taq DNA ポリメラーゼ</td><td>TAKARA</td><td>R001A</td><td></td></tr><tr><td>プライマー (2 &mu;l)</td><td>シグマ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超高純度アガロース&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>100 bp ラダー</td><td>Invitrogen</td><td>15628-019</td><td></td></tr><tr><td>数量 1 4.5.2 (Gel Doc 2000)</td><td>Biorad</td><td>170-8100</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 精製キット</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 サイクル シーケンシング キット&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337455</td><td></td></tr><tr><td>0.1 ml 反応プレート (MicroAMP Optical 96-well)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>Genetic analyser ABI300&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>DH5&α; コンピテントセル (E. coli)</td><td>Invitrogen</td><td>18263-012</td><td></td></tr><tr><td>pFUSEss-CHIg-hG1 (4,493 bp)</td><td>Invivogen</td><td>pfusess-hchg1</td><td></td></tr><tr><td>pFUSEss-CHIg-hG4 (4,484 bp)&nbsp;</td><td>Invivogen</td><td>pfusess-hchg4</td><td></td></tr><tr><td>pFUSE2ss-CLIg-hk (3,875 bp)</td><td>Invivogen</td><td>pfuse2ss-hclk</td><td></td></tr><tr><td>pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3,883 bp)&nbsp;</td><td>Invivogen</td><td>pfuse2ss-hcll2</td><td></td></tr><tr><td>SOC 培地</td><td>Invitrogen</td><td>15544-034</td><td></td></tr><tr><td>LB ベースの寒天培地にゼオシン (Fast-Media Zeo 寒天培地)を添加</td>した<td>Invivogen</td><td>fas-zn-s</td><td></td></tr><tr><td>テラフィックブロス (TB) ベースの液体培地にゼオシン (Fast-Media Zeo TB)を添加した</td><td>Invivogen</td><td>fas-zn-l</td><td></td></tr><tr><td>DNA Miniprep キット&nbsp;</td><td>Omega Bio Technology</td><td>D6942-02</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop (ND1000 分光光度計)</td><td>Nanodrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB ベースの寒天培地にブラストサイジン (Fast-Media Blast Agar)を添加した</td><td>Invivogen</td><td>fas-bl-s</td><td></td></tr><tr><td>Terrific Broth (TB) ベースの液体培地にブラストサイジン (Fast-Media Blast TB)を添加した</td><td>Invivogen</td><td>fas-bl-l</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New EnglandBiolabs</td><td>R0101S</td><td>20,000 U/ml、10x NEBuffer EcoRI</td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0131S</td><td>10,000 U/ml、10x NEBuffer 2.1</td></tr><tr><td>2-Log DNA ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N3200S</td><td>0.1-10.0 kb、1,000 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>XmaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0180S</td><td>10,000 U/ml、10x CutSmart Buffer&nbsp;</td></tr><tr><td>BsiWI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0553S</td><td>10,000 U/ml、10x NEBuffer 3.1</td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0174S</td><td>5,000 U/ml、10x CutSmart Buffer&nbsp;</td></tr><tr><td>FastAP感温性アルカリホスファターゼ</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td>1 U/&micro;l、10x FastAP Buffer</td></tr><tr><td>DH5&alpha;コンピテントセル&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18263-012</td><td></td></tr><tr><td>PE マウス 抗ヒト IgG</td><td>BD Pharmingen</td><td>555787</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD22, PerCP-Cy5.5, クローン: HIB22</td><td>Fisher scientific</td><td>BDB563942</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>BigDyeターミネーターv3.1</td><td>応用バイオシステムズ</td><td>4337455</td><td></td></tr></tbody></table>

不死化ソートb細胞からの組換えヒトiggモノクローナル抗体の作製

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

ヒトモノクローナル抗体を生成するための新しい方法を見つけることは、免疫療法の開発を含む基礎科学と応用科学の両方にとって重要な活発な研究分野です。しかし、このような抗体を同定し、作製する技術は困難である傾向があり、抗体の重鎖と軽鎖のペアが解離することがあります。ここでは、エプスタイン・バーウイルス(EBV)による不死化およびToll様受容体9活性化を使用して、ヒト末梢血単核細胞からヒト組換えモノクローナル抗体を作製するための比較的単純で簡単なプロトコルについて説明します。適切な染色を行うことで、抗体を産生するB細胞を単離し、その後の不死化とクローン増殖に役立てることができます。不死化B細胞クローンによって産生された抗体転写産物は、PCRによって増幅され、対応する重鎖および軽鎖のペアとして配列決定され、免疫グロブリン発現ベクターにクローニングできます。この技術で得られた抗体は、自己免疫を含むヒトの免疫応答を研究するための強力なツールとなり、新たな治療法の基礎を築くことができます。

CD22およびIgG陽性細胞を染色した後の選別ゲートは、 図1に示されているこの画像では二重陽性細胞の面積- 。IgG抗体を産生するB細胞が-別のチューブ内のすべてのこれらの細胞を選別するために選択されます。分析では、全PBMCの約1％が、この二重陽性集団に対応しています。得られた選別された細胞の数は、セクション1で得られた細胞の数に依存します。 EBVの不死化およびCpG（ODN2006）刺激の5週間後に異なる結果を図2に示されている成長しているクローンの検出が容易です。 WI38フィーダー細胞は、より細長い線維芽細胞の形状を有し、B細胞クローンは、丸底、マルチウェルプレートの中央に密集伸長するように非常に小さな丸い細胞現れます。この段階では、いくつかのクローンが成長し始めることが明らかです。しかし、成長速度は、ウェルcontaiのいくつかの変数と当然のものとすることができます寧は、細胞が全く成長している任意のセルを持っていない可能性が不死化。 成長して...

ヒトモノクローナル抗体の合成は、自己抗体を介した免疫応答の病態生理学的メカニズムを解明することを目的とした研究の最初のステップです。私たちは、B細胞単離、抗体クローニング、in vitro合成など、血液で分類されたB細胞から組換えヒト免疫グロブリンG(IgG)モノクローナル抗体を作製するためのプロトコールを開発しました。

不死化ソートB細胞からの組換えヒトIgGモノクローナル抗体の作製

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

本手順の全体的な目的は、B細胞によって産生される抗体をクローニングおよび発現させることです。これは、まず血液や胸腺などの適切なソース組織からB細胞を分離することによって達成されます。次のステップとして、FACSを行い、IgG産生陽性のB細胞集団を選別します。次に、細胞をEpstein-Barr virusで感染させ、同時にC-P-G-O-D-N 2006によってtoll-like receptor nineを活性化させることで不死化し、培養を維持します。最終ステップとして、ElizaによりIgG産生陽性と判定されたクローンからRNAを単離し、IgGの軽鎖と重鎖の両方からcopy DNAを合成します。最終的に、これらのIgG配列を哺乳類発現ベクターにクローニングすることで、大量のヒトモノクローナルIgGを産生させることができます。ファージディスプレイ技術などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、元のIgG重鎖と軽鎖のペアリングが維持されることです。この方法は、病原性自己抗体の同定や機能解析など、自己免疫疾患分野における重要な課題を解決できます。患者由来の検体およびEBVウイルスを取り扱う際は、リスクが伴うことに留意してください。EBウイルスはヒト病原体であるため、これらの手順を行う際は、BSL-2の予防措置を講じ、適切な保護具を着用してください。PBMCを染色する前に、6 mLの完全RPMI 1640培地とともに25 cmフラスコに播種し、一晩回復させます。細胞をブロッキングおよび洗浄した後、0.5 mLの培地が入ったチューブにPBMCを回収し、遠心分離します。その後、細胞を標識バッファーに再懸濁し、細胞数をカウントします。次に、2本の FACSチューブに、バッファー 200 µL に懸濁させた 5 million 個の細胞を分注して準備します。anti CD 22 P-E-R-C-P を 10 µL、または anti IgG pe を 40 µL 添加し、氷上で遮光して 30 分間インキュベートした後、細胞を洗浄し、フィルターに通してソートします。目的は、ダブルポジティブ細胞をカウントすることです。まず、ソートしたP BMCsを、CPG 2006およびEBVを添加したRPMI 1640完全培地を用いて、1細胞/µLに希釈します。次に、クリーンベンチ内で、EBVおよびCPG 2006を含む細胞希釈液110 µLを、あらかじめWI 38照射細胞を播種した96ウェル丸底プレートの2つのウェルに播種します。1ウェルあたり50細胞の感染は最適化されており、モノクローナル抗体を得られる可能性が高まります。ただし、これを PCR で確認することを推奨します。1 週間培養後、顕微鏡下で B 細胞の増殖を確認してください。2 週間後、培地を交換します。各ウェルから 90 µ

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免疫学と感染症

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このビデオは、重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子を持つプラスミドベクターを導入することにより、哺乳類細胞から抗体を生成する方法を示しています。これらのベクターはポリエチレンイミンと相互作用し、ポリプレックスを形成することによって細胞に入ります。その後、それらは個々のタンパク質に翻訳され、完全な抗体に組み立てられ、細胞外培地に分泌されます。...

哺乳類細胞培養物からの組換えモノクローナル抗体の作製

抗原特異的なB細胞からモノクローナル抗体を作製する技術を実演しています。単離された抗原特異的B細胞からクローニングされた抗体の重鎖と軽鎖をコードする真核生物の発現ベクターを、ポリプレックスを用いて哺乳動物細胞に導入します。細胞内に入ると、これらのベクターは翻訳を受け、得られた重鎖ペプチドと軽鎖ペプチドが抗体に集合し、その後、細胞から分泌されます。...

抗原特異的B細胞からモノクローナル抗体を作製する技術

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ヒト末梢血単核細胞から個々の抗原特異的抗体を同定し、回収するBSelex法は、フローサイトメトリーと単一細胞PCRおよびクローニングを組み合わせたものです。...

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