不死化ソートB細胞からの組換えヒトIgGモノクローナル抗体の作製

本手順の全体的な目的は、B細胞によって産生される抗体をクローニングおよび発現させることです。これは、まず血液や胸腺などの適切なソース組織からB細胞を分離することによって達成されます。次のステップとして、FACSを行い、IgG産生陽性のB細胞集団を選別します。

次に、細胞をEpstein-Barr virusで感染させ、同時にC-P-G-O-D-N 2006によってtoll-like receptor nineを活性化させることで不死化し、培養を維持します。最終ステップとして、ElizaによりIgG産生陽性と判定されたクローンからRNAを単離し、IgGの軽鎖と重鎖の両方からcopy DNAを合成します。最終的に、これらのIgG配列を哺乳類発現ベクターにクローニングすることで、大量のヒトモノクローナルIgGを産生させることができます。

ファージディスプレイ技術などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、元のIgG重鎖と軽鎖のペアリングが維持されることです。この方法は、病原性自己抗体の同定や機能解析など、自己免疫疾患分野における重要な課題を解決できます。患者由来の検体およびEBVウイルスを取り扱う際は、リスクが伴うことに留意してください。

EBウイルスはヒト病原体であるため、これらの手順を行う際は、BSL-2の予防措置を講じ、適切な保護具を着用してください。PBMCを染色する前に、6 mLの完全RPMI 1640培地とともに25 cmフラスコに播種し、一晩回復させます。細胞をブロッキングおよび洗浄した後、0.5 mLの培地が入ったチューブにPBMCを回収し、遠心分離します。その後、細胞を標識バッファーに再懸濁し、細胞数をカウントします。

次に、2本の FACSチューブに、バッファー 200 µL に懸濁させた 5 million 個の細胞を分注して準備します。anti CD 22 P-E-R-C-P を 10 µL、または anti IgG pe を 40 µL 添加し、氷上で遮光して 30 分間インキュベートした後、細胞を洗浄し、フィルターに通してソートします。目的は、ダブルポジティブ細胞をカウントすることです。

まず、ソートしたP BMCsを、CPG 2006およびEBVを添加したRPMI 1640完全培地を用いて、1細胞/µLに希釈します。次に、クリーンベンチ内で、EBVおよびCPG 2006を含む細胞希釈液110 µLを、あらかじめWI 38照射細胞を播種した96ウェル丸底プレートの2つのウェルに播種します。1ウェルあたり50細胞の感染は最適化されており、モノクローナル抗体を得られる可能性が高まります。

ただし、これを PCR で確認することを推奨します。1 週間培養後、顕微鏡下で B 細胞の増殖を確認してください。2 週間後、培地を交換します。各ウェルから 90 µL の培地をゆっくりと吸引し、新しいプレートに移します。

ELISAを用いてIgG産生を試験します。その後、IL-2を含む新鮮な補充培地を各ウェルに100 µLずつ添加します。クローンの増殖を、増殖3週目および4週目まで継続してモニタリングします。

毎週、培地交換を繰り返します。クローン増殖法については、テキストプロトコルを参照してください。酵素結合免疫吸着法（ELISA）を用いて、培地交換時に回収した上清のIgG産生量を確認します。

まず、ELISAプレートを準備し、各ウェルにコーティングバッファーで1:200に希釈したヤギ抗ヒトFC抗体を50 µLずつ分注します。プレートをインキュベートして洗浄した後、各ウェルにブロッキングバッファーを100 µLずつ加えてウェルをブロッキングし、再度プレートをインキュベートします。ブロッキング後のインキュベーションが完了したら、プレート内の液体をペーパータオルに叩き出して除去します。

プレートの準備ができたら、上清を4倍量のRPMIで希釈します。次に、標準コントロールとして、ヒトIgG溶液をRPMIで1000 nanograms per milliliterから15.6 nanograms per milliliterまで段階希釈します。

また、ブランクも用意してください。各ウェルに50 µLの上清または標準試料を加え、同様の方法でELISAプレートを37 °Cで1時間インキュベートします。抗体親和性を検証するために、上清をさらに希釈して分析する追加のELISAを設定することも可能です。インキュベーション後、プレートを洗浄します。

次に、各ウェルにペルオキシダーゼ標識fab2を含むインキュベーションバッファーを50 µLずつ分注します。さらに1時間インキュベートし、再度洗浄した後、各ウェルにTMBを含む基質溶液を100 µLずつ加えます。その後、青色に発色し、安定するまで最大10分間プレートをインキュベートします。

その後、反応を停止させ、吸光度を測定します。ブランクの測定値より3標準偏差上回る吸光度を示したクローンの上清を陽性と判定します。

ヒトIgG抗体の抗原特異性は、さらなるアッセイによって検出可能です。まず、テキストプロトコルに従って、陽性クローンから相補的DNA（copy DNA）を合成します。次に、IgGの重鎖、κ（カッパ）鎖およびλ（ラムダ）鎖のPCRセットアップを行います。

結果において、400から550 base pairsの位置に重鎖を確認します。300から400 base pairsの位置に軽鎖を確認します。これらが認められない場合は、産物を1 µL使用し、別のPCRのテンプレートとして用いてください。

新しく得られた産物が適切な範囲にあることを確認します。次に、最適と思われる産物のクローニングに進みます。まず、それらの配列を決定してください。エレクトロフェログラムはノイズがなく、単一の免疫グロブリン配列と一致している必要があります。

テキストプロトコルに従い、精製したPCR産物を1 µgのプラスミドDNAにクローニングします。必ず16 °Cで一晩ライゲートしてください。

T4 DNA Ligaseを用いて、サプリメント添加DMEM中でHX細胞を調製し、75 cm²の培養フラスコで75%コンフルエンスまで増殖させます。各重鎖・軽鎖のトランスフェクションに向けて、無血清DMEM 1.75 mLに、重鎖ベクター 4.5 µg、軽鎖ベクター 3 µg、およびポリエチレン溶液 50 µLを含む混合液を調製します。この混合液をHX細胞のプレートに緩やかに加え、プレート全体に溶液が広がるように旋回させます。

プレートを一晩インキュベートした後、毎日培養液の回収を開始します。回収した液は無血清培地と交換してください。培養液には抗体が含まれており、FACSによってCD 22およびIgG陽性のp BMCsをソートして染色した後、4日間にわたって毎日回収することが可能です。

IgG抗体を産生するB細胞であるダブルポジティブ細胞の領域を、拡大培養のために別途回収した。PBMCの約1%がこのダブルポジティブ集団であった。EBVによる不死化およびCPG 2006による刺激を5週間行った後、不死化クローンを単離した。

WI 30フィーダー細胞は、より細長い線維芽細胞様の形態を示し、B細胞クローンは、ラウンドボトムマルチウェルプレートの中央に凝集して増殖する非常に小さな円形の細胞として観察されます。増殖したクローンの上清を用い、IgGに対するELISA試験を行いました。ブランク値より標準偏差の3倍以上の値を示したものを陽性クローンとして評価しました。

陽性クローンの上清少なくとも3つが、ELIで陽性反応を示しました。陽性クローンの抗体について、免疫グロブリン重鎖およびλ鎖の可変領域と定常領域をクローニングした後にシーケンシングを行い、重鎖と軽鎖を特性解析しました。この手順に従いました。

抗体や遺伝子使用、遺伝的多様性などの追加的な疑問に答えるために、シーケンシングなどの他の手法を実施することが可能です。この開発を経て、本手法は自己免疫疾患分野の研究者が、重症筋無力症のような自己免疫疾患における疾患機序、病理、および関連する治療戦略を探索するための道を開きました。病原性抗体の発見は、炎症活性を持たない競合抗体などの新しい治療法の開発につながるため、本手法の影響は重症筋無力症のような疾患の診断および治療にまで及びます。