Name: 同軸ノズルを用いて多能性幹細胞のアルギン酸カプセル化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-02T10:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: 学ぶ 同軸ノズルを用いた多能性幹細胞のアルギン酸カプセル化法。細胞凝集とせん断応力を低減し、ステムセルニッチ研究や大量培養に適した技術です。

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この研究は、国立研究開発法人科学技術振興機構(JST)のS-Innovationプロジェクト、東京大学のライフイノベーションリーダー養成プログラム(GPLLI)、および日本学術振興会の特別研究員の支援を受けました。 ハイスピードカメラで動画を撮影してくださったnac Image Technology Inc.に感謝いたします。

1.準備材料<ol><li> 10mMのHEPES緩衝液を準備します。 RTでpHを7.0に調整し、0.9％に塩化ナトリウムを加えます。 </li><li> 1.1で調製したHEPES緩衝生理食塩水を混合することにより、5％アルギン酸塩溶液および10mM EDTA溶液を準備します。 RTでpHを7.0に調整します。 </li><li> 121℃で20分間、試薬（1.1、1.2）をオートクレーブ。 </li><li> 90、10％ES-修飾FBSおよびマイトマイシンC10μg/ mlのを含むDMEM内でインキュベートすることにより、フィーダー細胞として処理され、2.0×10 6マウス胚性線維芽細胞（MEF）細胞、 - 1.2層状ゼラチンコーティングされた60ミリメートルの料理を準備します - 120分。 </li><li>マウス人工多能性幹（iPS）皿上の細胞を5mlの存在ES修飾FBS、2-メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、50μM、および抗生物質（20％を含むDMEM高グルコース中のフィーダー細胞を維持しますペニシリンGナトリウム、硫酸ストレプトマイシンを100μg/ mlと100単位/ ml、およびamphoteriの250 ng / mlでCINのB）。 </li><li>シード4×10 5ゼラチンコーティングされた60ミリメートル皿にiPS細胞と37℃、5％CO 2でそれらをインキュベートします。インキュベーション中に、毎日培地を変更します。 3の後- 4日間培養し、37℃で0.02％EDTA、5％CO 2を含む0.05％トリプシンの500μlの1分間細胞をトリプシン処理。その後、培養皿を10回タップすることで細胞を剥離。 </li><li> （3回千μlをマイクロピペットでピペッティングにより単一細胞に解離マウスiPS細胞を以下）ES-修飾FBSおよび抗生物質の10％を含むDMEM 2.5 mlを加え3分間160×gで遠心分離細胞懸濁液、上清を除去し、細胞をカウント。細胞計数の後、ゼラチンコートディッシュに回収した細胞を再シードし、MEF細胞からiPS細胞を単離するために30分間インキュベートします。細胞の計数した後（通常は1 - 3×10 6細胞/皿を収集することができます）、上の4×10 5 iPS細胞を再シード皿。 </li></ol>アルギン酸ハイドロゲルカプセルに2細胞のカプセル化<ol><li> 1.5および1.6に記載の方法と同様の方法により細胞を収集します。 3分間160×gで遠心分離した後、三回HEPES緩衝生理食塩水でのiPS細胞ペレットを洗浄します。 HEPES緩衝化生理食塩水で細胞を再懸濁した後、それ以外の場合はノズルを詰まらせる可能性が大きな凝集体を除去するために40μmのセルストレーナーを通して細胞懸濁液を濾過します。 </li><li> HEPES緩衝生理食塩水内の細胞懸濁液2mlを、5％ALG-ナトリウム溶液3mlを混合します。最後に、3％のALG-Na溶液中で細胞懸濁液5mlを得られます。細胞密度は、望ましくは10以上6細胞/ mlです。 </li><li> 5ミリリットルシリンジに細胞懸濁液を収集した後、注射器に同軸ノズル（ 図1A、B）をインストールし、シリンジポンプに設定してください。同軸ノズルの外針を通してN 2ガ ​​ス流量（リットル/分より低い）を放出し、内側ノズルを通して細胞懸濁液を追い出します。 </li><li> 0.5％のCaCl 2溶液250ml中に液滴を収集し、10を待つ- 60〜90 rpmで攪拌しながら、ゲル化のために20分。 </li></ol>アルギン酸カプセルの3処理（オプション） <ol><li> 0.05％、37℃で5分間、5％CO 2（w / v）のポリ-L-リジン（PLL）溶液をALG-カルシウムカプセルをインキュベートします。 </li><li> HEPES緩衝生理食塩水でカプセルを洗浄した後、それらの表面上の電荷を中和するために10％FBSを含むDMEM中でそれらを培養します。コーティングされたカプセル（ 図1C）として、それらを利用しています。 </li><li> 5分間、10mMのEDTAを含むHEPES緩衝生理食塩水でカプセルをインキュベートします。 EDTA処理したカプセルは、中空カプセル（ 図1C）として利用されます。 </li></ol> 4.文化アルギン酸カプセルの細胞を収集<ol><li> 37℃および5％CO 2で振とうしながら75 rpmでカプセル化された細胞をインキュベート10日間。 </li><li>収集し、10分間CO 2を 37℃で、10mMのEDTAでカプセルをインキュベートし、5％。 3分間1,000×gで遠心分離することにより、PLL処理なしのアルギン酸カプセルから細胞を収集します。 </li><li> 5分間5,000×gで - アルギン酸塩カプセルはPLLで処理している場合は、シリンジに取り付けられた1000でそれを遠心針で上下にピペッティング10回の周りによってALG-PLL膜を破ります。針の直径は、カプセルサイズ25 G（260μm）の針が、この実験で使用されているよりも低くなければならない（600ミクロン） </li><li>あなたは、細胞からのmRNAのサンプルを収集したい場合は、遠心分離した後、壊れたALG-PLL膜から厳密に細胞ペレットを収集します。残りのALG-PLL膜は、おそらくmRNA精製を防ぎます。 </li></ol>

<ol><li>Zweigerdt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+production+of+stem+cells+and+their+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biochem.+Eng.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Large scale production of stem cells and their derivatives.</a> Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 114, 201-235 (2009).</li>
<li>Chen, A., Chen, X., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+microcarrier+properties+affecting+the+expansion+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+Res%22%5BJournal%5D)">Critical microcarrier properties affecting the expansion of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Stem cell Res. 7 (2), 97-111 (2011).</li>
<li>Schroeder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+lineage+selection+of+mouse+embryonic+stem+cells+in+a+stirred+bench+scale+bioreactor+with+automated+process+control%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Differentiation and lineage selection of mouse embryonic stem cells in a stirred bench scale bioreactor with automated process control.</a> Biotechnol. Bioeng. 92 (7), 920-933 (2005).</li>
<li>Leung, H. W., Chen, A., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agitation+can+induce+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+microcarrier+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C%22%5BJournal%5D)">Agitation can induce differentiation of human pluripotent stem cells in microcarrier cultures.</a> Tissue Eng. Part C. 17 (2), 165-172 (2011).</li>
<li>Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled%2C+scalable+embryonic+stem+cell+differentiation+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture.</a> Stem Cells. 22 (3), 275-282 (2004).</li>
<li>Weber, L. M., He, J., Haskins, K., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG-based+hydrogels+as+an+in+vitro+encapsulation+platform+for+testing+controlled+for+testing+controlled+%C3%9F-cell+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled for testing controlled ß-cell microenvironments.</a> Acta Biomater. 2 (1), 1-8 (2006).</li>
<li>Horiguchi, I., Chowdhury, M. M., Sakai, Y., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation%2C+morphology%2C+and+pluripotency+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells+in+three+different+types+of+alginate+beads+for+mass+production%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Proliferation, morphology, and pluripotency of mouse induced pluripotent stem cells in three different types of alginate beads for mass production.</a> Biotechnol. Prog. 30 (4), 896-904 (2014).</li>
<li>Rahman, N., Purpura, K. A., Wylie, R. G., Zandstra, P. W., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+vascular+endothelial+growth+factor+functionalized+agarose+to+guide+pluripotent+stem+cell+aggregates+toward+blood+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of vascular endothelial growth factor functionalized agarose to guide pluripotent stem cell aggregates toward blood progenitor cells.</a> Biomaterials. 31 (32), 8262-8270 (2010).</li>
<li>Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+benefit+of+human+embryonic+stem+cell+encapsulation+for+prolonged+feeder-free+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance.</a> Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).</li>
<li>Magyer, J. P., Nemir, M., Ehler, E., Suter, N., Perriard, J., Eppenberger, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Production+of+Embryoid+Bodies+in+Microbeads%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mass Production of Embryoid Bodies in Microbeads.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 944, 135-143 (2001).</li>
<li>Xu, J., Li, S., Tan, J., Luo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controllable+Preparation+of+Monodispersed+Calcium+Alginate+Microbeads+in+a+Novel+Microfluidic+System%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eng.+Technol%22%5BJournal%5D)">Controllable Preparation of Monodispersed Calcium Alginate Microbeads in a Novel Microfluidic System.</a> Chem. Eng. Technol. 31 (8), 1223-1226 (2008).</li>
<li>Sakai, M. P., Y, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Bioactive+Hydrogel+Capsules+for+The+3D+Expansion+of+Pluripotent+Stem+Cells+in+Bioreactors%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater.+Sci%22%5BJournal%5D)">Development of Bioactive Hydrogel Capsules for The 3D Expansion of Pluripotent Stem Cells in Bioreactors.</a> Biomater. Sci. 2 (176), 176-183 (2014).</li>
<li>Chowdhury, M. M., Katsuda, T., Montagne, K., Kimura, H., Kojima, N., Akutsu, H., Ochiya, T., Fujii, T., Sakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+effects+of+secreted+soluble+factor+preserve+better+pluripotent+state+of+embry-+onic+stem+cell+culture+in+a+membrane-based+compartmentalized+micro-bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Enhanced effects of secreted soluble factor preserve better pluripotent state of embry- onic stem cell culture in a membrane-based compartmentalized micro-bioreactor.</a> Biomed. Microdevices. 12 (6), 1097-1105 (2010).</li>
<li>Chowdhury, M. M., Kimura, H., Fujii, T., Sakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+alternative+fate+other+than+default+neuronal+fate+of+embryonic+stem+cells+in+a+membrane-based+two-chambered+micro-+bioreactor+by+cell-secreted+BMP4%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Induction of alternative fate other than default neuronal fate of embryonic stem cells in a membrane-based two-chambered micro- bioreactor by cell-secreted BMP4.</a> Biomicrofluidics. 6 (1), 14117-14117-13 (2012).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

<html>カプセル化培養物を直接懸濁培養物と比較することができます。浮遊培養は、カプセル化方法よりも多能性幹細胞を大量に得るための簡単​​な方法です。しかし、懸濁培養中の細胞の凝集を制御することは依然として困難です。カプセル化方法において、細胞凝集は、カプセル内に限定されるので、十分に制御することができます。以前の刊行物は、大きな細胞塊が自由懸濁培養7で登場し、一方カプセル化された細胞は、均一な大きさの凝集体を形成することを示しました。さらに、以前の報告は、強力な攪拌がPS細胞の直接懸濁培養における細胞死を引き起こすことを実証しました。このように制限された撹拌速度を必要とします。対照的に、カプセル化もサスペンション条件下で剪断応力から細胞を保護することができます。懸濁液中の細胞を成長させる際のカプセル化方法は、したがって、運転条件の自由度を可能にします。 「ove_content&gt;はカプセル化は、量産プロセスの変更だけでなく、幹細胞研究の両方のための有用なツールである。幹細胞のカプセル化は、細胞外マトリックスおよび増殖因子を含む、幹細胞のニッチを研究するのに有用である。いくつかの研究者がいることを実...

人工多能性幹細胞(iPS細胞)は、再生医療におけるその役割から、現在、集中的な研究の源となっています。 しかし、組織の再生には膨大な量の細胞が必要です。 例えば、1型糖尿病患者1に必要な膵臓細胞は約10億個です。 しかし、従来のディッシュ培養では1×10個の5細胞/cm2しか得られず、1型糖尿病患者を治療するのに十分な幹細胞由来の膵臓細胞を得るためには、1m2の培養面積が必要でした。 そのため、マイクロキャリア2や懸濁培養などの多能性幹細胞を大量培養するシステムの開発が再生医療に求められています。 懸濁培養は有望な大量培養法ですが、ヒトiPS細胞の直接懸濁培養では細胞の凝集を制御することが困難です3。 実際、浮遊細胞はせん断応力にさらされ、細胞損傷3または分化4を引き起こします。
浮遊培養に関連する問題を解決するために、ハイドロゲルベースのカプセル化の研究が行われてきました。 ハイドロゲルカプセルでは、細胞は培地の流れから保護されています。 以前の報告では、アガロース5、PEG6、アルギン酸塩(Alg)など、さまざまな種類のハイドロゲルを細胞カプセル化に使用することが文書化されています。 Alg-Caハイドロゲルは、アルギン酸溶液をCaCl2溶液に滴下した直後に形成され、酵素やキレート試薬によって容易に消化されるため、Alg-Caハイドロゲルは細胞カプセル化に最も有用なハイドロゲルの1つです。 
ここでは、同軸ノズルを用いてiPS細胞のアルギン酸を安定的にカプセル化するプロセスを確立しました。 N2ガス流を液滴形成に利用することで、油などの他の試薬を必要とせずに細胞を均一なカプセルに封入することができます。 この方法では、N2の流速とCaCl2とアルギン酸塩の両方の濃度が、カプセルのサイズ、形状、および均一性に影響を与える主要な動作条件です。 本稿では、ハイスピードカメラと顕微鏡を用いて、これらの運転条件を最適化した事例を紹介する。

<table><tbody><tr><td>マウス胚線維芽細胞</td><td>Cell Biolabs</td><td>SNL 76/7</td><td></td></tr><tr><td>マウス人工多能性幹細胞</td><td>理研 バイオ研究センター</td><td>iPS-MEF-Ng-20D-17</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 高グルコース</td><td>GIBCO</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>ES qualified&nbsp;FBS</td><td>GIBCO</td><td>16141079</td><td></td></tr><tr><td>抗菌剤</td><td>GIBCO</td><td>15240</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>GIBCO</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>GIBCO</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO 白血病抑制因子</td><td>メルクミリポア</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン/EDTA</td><td>GIBCO</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>26 G/16 G 針</td><td>星星精堂</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10ml シリンジ</td><td>テルモ</td><td>SS-10ESZ</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウム&nbsp;塩化物</td><td>和光</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>アルギン酸ナトリウム</td><td>和光</td><td>194-09955</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>和光</td><td>039-00475</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン (MW=15,000-30,000)</td> <td>SIGMA</td><td>P7890</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>同人堂</td><td>345-01865</td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>AS ONE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>DM IRB</td><td></td></tr><tr><td>ハイスピードカメラ</td><td>NAC 画像技術</td><td>Memrecam HX-3</td><td></td></tr></tbody></table>

同軸ノズルを用いて多能性幹細胞のアルギン酸カプセル化

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

多能性幹細胞(PS細胞)は、再生医療や薬物スクリーニングにおける役割から、集中的な研究の焦点となっています。 しかし、これらの用途でPS細胞を利用するためには、大量培養システムの開発が必要となります。 浮遊培養はPS細胞の量産化に有望な培養法の一つですが、凝集の制御や培地からのせん断応力の抑制など、未解決の問題も残っています。 これらの問題を解決するために、同軸ノズルを用いたアルギン酸カルシウム(Alg-Ca)封入法を開発しました。 この方法では、N2ガスを共流させることでカプセルのサイズを簡単に制御できます。 N2ガスの流量が高すぎると液滴が破壊され、不均一なサイズのカプセルが破壊されるため、制御可能なカプセルの直径は500μmより大きくなければなりません。 さらに、Alg-NaおよびCaCl2の濃度が低いと、非球状のカプセルが形成されます。 Alg-PLLコーティングのないAlg-Caカプセルは容易に溶解し、細胞の収集を可能にしますが、Alg-PLLコーティングを施していないカプセルからは細胞が漏れ出す可能性もあります。 実際、アルギン酸-PLLコーティングは細胞の漏洩を防ぐことができるだけでなく、壊れにくいという特徴もあります。 この技術は、カプセル化により細胞外マトリックスや分泌因子の濃度など、細胞を取り巻く微小環境を改変できるため、幹細胞ニッチの研究やPS細胞の大量生産の研究に活用できます。

プロトコル2.5で、排出されたアルギン酸塩溶液は直ちに放出（ - H図2A）の後に球状をなします。懸濁液を1L / minより低いN 2流量で排出された場合、液滴の大きさが均一（ 図2I）です。 N 2流量は、1L /分よりも大きい場合には、液滴（ 図2G、白矢印）を分解し、液滴の大きさは、不均一（ 図2J）となります。これを考えると、この方法を使用して500ミクロン未満の液滴を調製することは困難です。 ALG-NA（3％以上）の濃度が十分に（ 図3E-H、K、I）であればゲル化工程（プロトコル2.4）では、ALG-Naが塩化カルシウム溶液中の球状ALG-カルシウムカプセルを形成される液滴。しかし、ALG-ナトリウム（3％未満）の低濃度は、非球面せ、カプセルの非滑らかな形状（ 図3A-D、I）、そのコー​​ティング...

私たちは、多能性幹細胞(PS細胞)を同軸ノズルを用いてアルギン酸ヒドロゲルカプセルに封入する方法を確立しました。 これにより、細胞が過度に凝集するのを防ぎ、浮遊培養で細胞が受けるせん断応力を制限します。 この技術は、PS細胞の大量生産だけでなく、幹細胞ニッチの研究にも応用できます。

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

本手順の全体的な目的は、幹細胞をアルギン酸ハイドロゲルカプセル内に安全かつ効果的に封入し、カプセル内で培養することで、細胞凝集および微小環境を制御することである。これは、まずろ過した幹細胞懸濁液とアルギン酸ナトリウム溶液を混合することで達成される。次に、この混合液をシリンジに移し、同軸ノズルを装着した後、シリンジポンプにセットする。続いて、細胞懸濁液を窒素ガスの共流と共に押し出し、塩化カルシウム溶液中で回収することで、液滴を調製する。その後、カプセルをポリLリシンで処理して細胞の漏出を防ぎ、さらにEDTAで処理して内部のカプセルを流動化させた後、封入された細胞を回転振盪条件下で培養します。最終的に、EDTAによる処理と膜の物理的破壊によって、カプセルから細胞を回収します。結論として、多能性幹細胞のアルギン酸封入は、細胞の過度な凝集を防ぎ、懸濁培養において細胞が受けるせん断応力を制限します。この手法は、細胞移植のための大量拡大や幹細胞ニッチの研究など、生物学および生物医学分野における重要な課題の解決に役立ちます。まず、160 ×gで3分間遠心分離した後、テキストプロトコルに従って細胞を回収し、細胞封入を開始します。誘導多能性幹細胞（iPS細胞）ペレットを、リン酸緩衝生理食塩水に懸濁して遠心分離し、再懸濁とリン酸緩衝生理食塩水による洗浄を3回繰り返して洗浄します。ノズルの詰まりの原因となる大きな凝集体を除去するため、細胞懸濁液を40 micronのセルストレーナーでろ過します。次に、ろ過した細胞懸濁液2 mLと5%アルギン酸ナトリウム溶液3 mLを混合します。3%アルギン酸ナトリウム中での細胞密度が1 million cells/mL以上の細胞懸濁液5 mLを得るための手順です。細胞懸濁液を5 mLのシリンジに回収した後、シリンジに同軸ノズルを取り付けてシリンジポンプにセットし、同軸ノズルの外針から窒素ガスを流し、内ノズルから細胞懸濁液を排出させます。液滴を250 mLの0.5%塩化カルシウム溶液に回収し、60～90 RPMで攪拌しながら、ゲル化のために10～20分間待ちます。リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、回収したカプセルを裸のカプセルとして利用します。カプセルを処理するには、アルギン酸カルシウムカプセルを0.05% w/vの溶液中でインキュベートします。37 °C、5% carbon dioxide の条件下で、振盪しながら 5 分間 Poly L lysine 溶液で処理します。カプセルをチューブに回収し、HEPES buffered saline で洗浄した後、10% FBS 含有 DMEM 中でインキュベートします。表面の電気電荷を中和するため、得られたカプセルをコーティングカプセルとして利用し、ホローカプセルを作製します。10 mM EDTAを含むHEPES緩衝生理食塩水中でカプセルを5分間インキュベートします。このEDTA処理したカプセルを中空カプセルとして使用します。カプセル化した細胞を37 °C、5% CO2の条件下で75 RPMで振盪しながら10日間インキュベートします。インキュベーション後、カプセルを回収し、10 mM EDTA中で37 °C、5% CO2の条件下で10分間インキュベートします。ポリLリシン処理を行っていないアルギン酸カプセルから、1000 ×gで3分間の遠心分離により細胞を回収します。アルギン酸カプセルにポリLリシン処理を施している場合は、シリンジに装着した針を用いて10回程度ピペッティングし、アルギン酸-ポリLリシン膜を破壊します。針の直径はカプセルのサイズより小さい必要があります。本実験では25ゲージの針を使用しています。1,000〜5,000 ×gで5分間遠心分離した後、破壊したアルギン酸ポリL-リシン膜から厳密に細胞ペレットを回収します。細胞からmRNAサンプルを回収する場合、高速カメラで観察されるように、残存するアルギン酸ポリL-リシン膜がmRNAの精製を妨げる可能性があることに注意してください。排出されたアルギン酸溶液は、排出直後に球状になります。窒素流量を1 L/min未満にして懸濁液を排出すると、液滴のサイズが均一になります。しかし、窒素流量が1 L/minを超えると、液滴が崩壊し、液滴サイズが不均一になります。そのため、この方法で500 µm未満の液滴を調製することは困難です。ゲル化プロセスにおいて、アルギン酸ナトリウム液滴は塩化カルシウム溶液中で球状のアルギン酸カルシウムカプセルを形成します。しかしながら、アルギン酸ナトリウムの濃度が十分に高い場合、低濃度のアルギン酸ナトリウムではカプセルが非球形または非卵形となり、コーティングプロセスにおいて問題が生じます。アルギン酸ナトリウムの濃度が不十分であっても、カルシウム濃度を上げることで球形カプセルを形成することが可能です。ただし、塩化カルシウム濃度が高すぎると細胞の増殖と生存率が低下するため、封入には約50 millimolarの塩化カルシウムが適切です。カプセル化した細胞はカプセル内で増殖できますが、アルギン酸ポリLリシンコーティングを施していないカプセルでは、細胞の漏出が発生することがあります。マウスiPS細胞の場合、細胞は各カルシウムアルギン酸カプセル内でディスク状の凝集体を形成しますが、中空カプセルでは細胞同士が凝集し、各カプセル内に単一の球状凝集体を形成します。このビデオを視聴することで、細胞をサイズ制御してカプセル化し、培養する方法について十分に理解できるはずです。特殊な装置や有機吸収剤を用いることなく、水素を捕捉します。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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このプロトコルは、エッチングされたトポグラフィーガイダンスキューとハイドロゲルバイオインクを持つ細胞の精密な堆積を組み込んだ自動ロボット堆積システムを使用したバイオプリンティング方法論を説明しています。印刷されたセルは、エッチングされた形状に直接送達され、それらを使用して感知し、方向付けすることができます。...

細胞の表面のガイダンスとBioprintingための自動ロボット調剤技術

このビデオと原稿は、簡単な撹拌容器を用いて大きなバッチで製造することができるアルギン酸ビーズ0.5％〜10％の哺乳動物細胞をカプセル化するエマルジョンベースの方法を記載しています。カプセル化された細胞は、インビトロで培養され得るか、または細胞治療用途のために移植され得る。...

シンプルな攪拌槽を用いたアルギン酸ビーズにおける哺乳類細胞のカプセル化

ここに提示される、血管および他の管状構造のティッシュ工学のために適した中空足場の1ステップの製造のための簡単な使用、コア/シェル、三次元バイオプリンティングの組み立てである。...

管状構造の組織工学のためのコア/シェル印刷足場

ここでは、化学的エピジェネティック消去と機械化関連の手がかりを組み合わせて、遺伝子トランスフェクションやレトロウイルスベクターを必要とせずに哺乳類の多能性細胞を効率的に生成する方法を紹介します。したがって、この戦略はトランスレーショナル医療にとって有望であり、幹細胞オルガノイド技術の顕著な進歩を表しています。...

エピジェネティック修飾と生体力学的手がかりを組み合わせて哺乳類多能性細胞を生成する2段階戦略

この記事では、同軸流集束装置を用いたヒト多能性幹細胞(hPSC)のカプセル化について説明する。我々は、このマイクロ流体封止技術がhPSCスフェロイドの効率的な形成を可能にすることを実証する。...

ヒト多能性幹細胞スフェロイドを担持したコアシェル型マイクロカプセルのマイクロ流体作製

本プロトコルは、3Dプリントされたスタンプ様デバイスを使用して、大規模かつ費用対効果の高い方法で組織スフェロイドを作製する技術を記載している。...

3Dプリントされたスタンプ状デバイス による 組織スフェロイドの生成

この研究では、自己修復アニーリング可能な粒子-細胞外マトリックス複合材料内の神経幹細胞の自由形状埋め込み3D印刷のプロトコルについて説明します。このプロトコルは、相互接続されたヒト神経組織構築物のプログラム可能なパターニングを高い忠実度で可能にします。...

ヒト神経構築物の埋め込み3D印刷のためのミクロゲル-細胞外マトリックス複合サポート

学ぶ 同軸ノズルを用いた多能性幹細胞のアルギン酸カプセル化法。細胞凝集とせん断応力を低減し、ステムセルニッチ研究や大量培養に適した技術です。

同軸ノズルを用いて多能性幹細胞のアルギン酸カプセル化

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