同軸ノズルを用いて多能性幹細胞のアルギン酸カプセル化

この手順の全体的な目標は、幹細胞をアルギン酸、ヒドロゲルカプセルに安全かつ効果的に埋め込み、カプセル内でそれらを培養して制御することです 凝集と微小環境のために、これは最初にろ過された幹細胞懸濁液とアルギン酸ナトリウム溶液を混合することによって達成されます。次に、混合物をシリンジに移し、同軸ノズルをシリンジに取り付けてから、シリンジポンプにセットします。次に、液滴は、細胞懸濁液を共流窒素ガスで排出し、続いて収集および塩化カルシウム溶液を排出することによって調製されます。

その後、細胞の漏洩を防ぐためのポリLリジン処理と、内包の流動化のためのEDTA処理を行い、回転振とう状態で内包細胞を培養します。最後に、細胞はEDTAおよび膜の物理的破壊によってカプセルから収集されます。最終的に、多能性幹細胞のアルギン酸カプセル化は、細胞が過度に凝集するのを防ぎ、懸濁培養で細胞が経験する純粋なストレスを制限します。

この方法は、細胞移植の大幅な拡大や幹細胞ニッチの研究など、生物学および生物医学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。テキストプロトコルに記載されているように細胞を採取し、Gの160倍で3分間遠心分離することにより、細胞のカプセル化を開始する。誘導多能性幹またはIPS細胞ペレットをResusで洗浄し、緩衝生理食塩水をヒープに懸濁し、Resus後に3回遠心分離し、細胞を懸濁し、緩衝生理食塩水をヒープします。

40ミクロンのセルストレーナーでセル懸濁液をろ過し、ノズルを詰まらせる可能性のある大きな凝集体を除去します。次に、2ミリリットルの濾過細胞懸濁液と3ミリリットルの5%アルギン酸ナトリウム溶液を混合します。3%アルギン酸ナトリウム細胞密度で5ミリリットルの細胞懸濁液を得るためには、1ミリリットルあたり100万個以上の細胞をDIRします。

細胞懸濁液を5ミリリットルのシリンジに集めた後、シリンジに同軸ノズルを取り付け、シリンジポンプにセットして、同軸ノズルの外側の針から窒素ガスの流れを放出し、内側のノズルから細胞懸濁液を排出します。液滴を250ミリリットルの0.5%塩化カルシウム溶液に収集し、60〜90RPMで攪拌しながら10〜20分間観察します。ヒープ緩衝生理食塩水で洗浄した後、収集されたカプセルは、容量あたり0.05%重量のアルギン酸カルシウムカプセルをインキュベートするカプセルを処理するために裸のカプセルとして利用されます。

ポリLリジン溶液を摂氏37度、二酸化炭素5%で5分間振とうします。カプセルをチューブに集め、緩衝生理食塩水を山積みにして洗浄した後、10%FBSを含むDMEMでインキュベートします。その表面の電荷を中和するために、得られたカプセルをコーティングされたカプセルとして利用し、中空カプセルを生成します。

10ミリモルEDTAを含む緩衝生理食塩水の山にカプセルを5分間インキュベートします。EDTA処理されたカプセルは、中空カプセルとして利用されます。インキュベーション後10日間、37°Cおよび5%二酸化炭素で振とうしながら、カプセル化された細胞を75RPMでインキュベートし、カプセルを37°Cおよび5%二酸化炭素の10ミリモルEDTAに10分間回収してインキュベートします。

ポリリシン処理を行わずにアルギン酸カプセルから細胞を採取し、Gの1000倍で3分間遠心分離します。アルギン酸カプセルをポリLリジンで処理する場合は、シリンジに針を取り付けた状態でピペッティングで約10回上下させ、アルギン酸ポリLリジン膜を破砕します。針の直径はカプセルサイズよりも小さくする必要があり、この実験では25ゲージの針が使用されます。

1000〜5,000倍Gで5分間遠心分離した後、壊れたアルギン酸ポリLリシン膜から細胞ペレットを厳密に収集しますmRNAサンプルが細胞から収集される場合、残りのアルギン酸ポリLリシネ膜は、高速カメラで視覚化されるようにmRNAの精製を妨げる可能性があることに注意してください。排出されたアルギン酸溶液は、排出直後に球形を形成します。懸濁液が毎分1リットル未満の窒素流量で排出されると、液滴のサイズは均一になります。

しかし、窒素流量が1分あたり1リットルを超えると、液滴が壊れて液滴のサイズが不均一になります。そのため、この方法では500ミクロン未満の液滴を調製することは困難です。ゲル化プロセスでは、アルギン酸ナトリウム液滴が塩化カルシウム溶液中で球形のアルギン酸カルシウムカプセルを形成します。

しかし、アルギン酸ナトリウムの濃度が十分に高い場合、アルギン酸ナトリウムの濃度が低いと、カプセルの非、球形、および非形状が発生し、コーディングプロセスに問題が生じます。アルギン酸ナトリウムの濃度が十分でなくても、カルシウム濃度を上げることで球状のカプセルを形成することができます。ただし、約50ミリモルの塩化カルシウムは、高すぎると塩化カルシウムの濃度が高すぎると細胞の成長と生存率が低下するため、カプセル化に適しています。

カプセル化された細胞はカプセル内で増殖できますが、アルギン酸ポリLリジンコーティングのないカプセル内では細胞漏出が発生する可能性があります。マウスIPS細胞の場合、細胞は各アルギン酸カルシウムカプセル内で円盤状の凝集体を形成しますが、細胞は各中空カプセル内で凝集して単一の球状の凝集体を形成します。このビデオを見れば、細胞をカプセル化してサイズコントロールに培養する方法を十分に理解できるはずです。

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