新たに単離した糸球体の足細胞における単一チャネル分析とカルシウムイメージング

この手順の全体的な目標は、薬理学的薬剤に応答した細胞内カルシウム濃度の変化を測定することです。カルシウムの基礎レベルを推定し、新たに分離された糸球体全体の一部として足細胞の個々のチャネル活動を評価します。これは、最初に腹部大動脈を介して洗い流すことにより、ラットの腎臓から血液を浄化することによって達成されます。

次に、腎臓を採取し、腎臓皮質を分離してカミソリの刃でミンチにします。3番目のステップでは、皮質糸球体は差動cingによって分離されます。その後、分離された斬首された糸球体は、電気生理学的実験を受けるか、蛍光色素をロードして共焦点カルシウム濃度測定のために採取することができます。

最終的に、これらの手順により、研究者はさまざまな薬剤のアプリケーションに応じた細胞内カルシウム処理の急激な変化を解決し、単一イオンチャネルのレベルでカルシウムコンダクタンスを評価および操作することができます。この手法が既存の方法よりも優れている点は、単離された糸球体全体の一部として足細胞を研究できることです。私たちの調製物は、足細胞の機能的可能性を保持しています。

それらは毛細血管に付着したままで、実際に糸球体ろ過装置の主要部分を保存できる環境での恒常性に関与します。この技術の意味は、私たちの薬理学的スクリーニングを拡張します 正常および病理学的状態では、足細胞によるカルシウム処理のメカニズムは、糖尿病性腎症、限局性セグメントオメロ硬化症、高血圧などの疾患における腎合併症の発症と予防に不可欠な調節的役割を果たします。これらの細胞におけるカルシウム流入の薬物に対する応答性を観察することは非常に重要であり、これは簡単にスクリーニングできます。

この準備では、VLA Hunkaは、次の手順で腎臓を洗い流す方法を示します。糸球体分離とVクランプ電気生理学をご案内し、Dr.GaNが共焦点カルシウムイメージングをご案内します。この手順を開始するには、麻酔をかけたラットを温度制御された手術台に置きます顕微鏡下で、腹部に正中線を切開して静脈CVAと大動脈を明らかにします。

次に、腹腔動脈と上腸間膜動脈とその上の腹部大動脈の周りに結紮糸を挿入します。鈍く、腎動脈の下の腹部大動脈を解剖します。次に、その周りに2つの合字を置きますが、結紮しないでください。

結紮糸の上で大動脈を固定し、下の糸を結びます。その後、クランプの下のPBSで満たされたシリンジポンプに取り付けられたポリエチレンチューブで大動脈をカテーテルし、カテーテルを2番目の結紮糸で固定します。次に、クランプを取り外して固定します。

腸動脈と腹腔動脈です。予め冷やしたPBSを大動脈に3分間、毎分6ミリリットルの速度で注入します。同時に、腎静脈近くのカバの静脈を切開して圧力を和らげます。

3分後、灌流を停止し、腎臓を切除してカプセル化します。それらを氷上のPBS溶液に入れます。次に、RPMI 1640培地に30ミリリットルの新鮮な5%BSAを準備します。

かみそりの刃とはさみを使用して、両方の腎臓の皮質を分離し、均一になるまでMITします。次に、5%P-S-A-R-P-M-I溶液にあらかじめ浸した100メッシュのステンレス鋼ふるいに、ひき肉の組織を押し込みます。流れを収集し、140メッシュのsivを通過させます。

続いて、予め浸した200メッシュsivを使用して、140メッシュのふるいから収集された流れをろ過します。濾液を廃棄し、調製したB-S-A-R-P-M-I溶液の10〜15ミリリットルで上部ふるいを洗浄し、ふるいの上部から糸球体を収集します。次に、G糸球体を含むB-S-A-R-P-M-I溶液を15ミリリットルの2つのボン氷に入れ、糸球体沈殿物をチューブの底に最大20分間置きます。

この手順では、分子量70,000〜150,000ポリリジンで5×5ミリメートルのカバーガラスチップをコーティングし、加熱プレート上で乾燥させます。次に、実験溶液を室温まで温め、パッチクランプチャンバーとピペットを満たし、糸球体を含む溶液を穏やかに混合します。次に、ポリリジンコーティングされた各カバーガラスチップに約50マイクロリットルを塗布します。

その後、糸球体を含むガラスチップをパッチクランプチャンバーに移動します。Bethソリューションがあらかじめ充填されています。細胞付着モードで従来のパッチクランプ記録を行う前に、1分間あたり3ミリリットルの速度でチャンバーを灌流し、付着していない糸球体を除去します。

次に、各0.5ミリリットルの円錐管に500マイクロリットルの糸球体画分を配置し、カルシウム染料の純粋な赤とインフルエンザを午前4時00分に追加します。次に、チューブを回転式シェーカーに常温で最大1時間置きます。次に、ガラスカバースリップをポリリジンで準備し、70°Cで加熱したプレートで乾燥させます。カルシウムダイスの装填が完了したら、ポリリジンを塗布したカバースリップに糸球体含有溶液100μLを塗布し、表面に約5分間貼り付けます。

次に、糸球体に取り付けられたカバースリップをイメージングチャンバーに取り付け、毎分3ミリリットルの速度で浴液で灌流して、付着していない糸球体と残りの色素を取り除きます。その後、共焦点レーザー走査型顕微鏡を488ナノメートルの励起波長に設定します。次に、イメージングソフトウェアを目的の周波数と解像度に設定します。

次に、明視野で糸球体を見つけます。その後、蛍光シグナルの検出をオンにします。その後、目的の焦点面を選択し、flu oh fourおよびfiro redチャネルの蛍光強度を確認します。

糸球体が明視野ではっきりと見えることを確認してください。次に、インフルエンザの oh four 信号と furor red 信号の蛍光強度の変化を記録します。画像シーケンスをインポートするには、チャネルを分割し、ハイパースタックグレースケールモードを使用します。

Image Jソフトウェアで、分析ツールのROIマネージャーパスに従ってROIマネージャーウィンドウを開きます。楕円選択ツールとROIマネージャーの「Add T」機能を使用して、1つ以上の関心領域を選択します。次に、バックグラウンドの領域を選択し、選択したROIを保存します。

次に、ダイアログでスライスごとに1行のボックスにマークを付け、メニューオプションの結果で[OK]をクリックします。測定値を設定します。平均グレー値を選択し、各ROIのピクセル強度値を計算します。これは、結果ウィンドウの別々の列に表示されます。

次に、各ROIについて、各チャネルで測定されたROI強度値を優先データ解析ソフトウェアにコピーし、各時点の各データポイントからバックグラウンド強度値を減算します。そのプロットの後、インフルエンザ OH 4 と URA の赤チャネルの強度の比率を計算し、各 ROI のカルシウム過渡現象のポイント時間変化を計算します。この画像は、ラット糸球体の表面の酸化物体に取り付けられたパッチクランプピペットを示しています。

電気生理学的記録中、カプセル化された糸球体の一部が画像の右下隅に見えます。これは、細胞内カルシウム濃度を測定するために足細胞上に作られた細胞付着パッチからのトリピー様チャネル活性の代表的な電流トレースです。糸球体には、細胞内カルシウムを標識するために、午前4:00にインフルエンザがロードされています。

このビデオは、糸球体へのカルシウム流入に対するCINと塩化マンガンの影響を示しています。このグラフは、CINと塩化マンガンに応答して単一の足細胞から記録されたインフルエンザOH4シグナル強度の変化を定量化しています。予想通り、CINは最大の蛍光を生成し、塩化マンガンが色素をクエンチし、蛍光強度が最も低くなります。

これらの薬剤の適用により、研究者は後で細胞内の正確なカルシウム濃度を定義することができます。このビデオでは、糸球体内のカルシウム濃度に対する10マイクロモルのTPの効果を示しています。緑色のインフルエンザO four蛍光の増加とred fu red蛍光の低下があり、これが細胞内カルシウム濃度の増加を説明していることに注意してください。

この技術は、薬理学的治療やその他の操作後の単一イオンチャネルおよび個々の細胞レベルでのカルシウム流入の変化をモニタリングするユニークな機会を提供します。したがって、このアプローチは、利用可能な複数の遺伝子改変げっ歯類モデルを考慮した非常に強力なツールを表しています。このビデオを見れば、足細胞のカルシウム測定を行う方法や、クランプ実験を単独で使用する電気生理学的方法についてよく理解できるはずです。

これらの技術は、正常および病理学的状態における足細胞によるカルシウム取り扱いの調節に関する詳細かつ機構的な洞察を提供します。