Name: 新たに単離した糸球体の足細胞における単一チャネル分析とカルシウムイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: 学ぶ単一チャネル分析とカルシウムイメージングを用いて、新たに単離した糸球体の足細胞における細胞内カルシウム濃度変化を測定する方法です。電気生理学的手法と共焦点顕微鏡を組み合わせ、薬理学的刺激に対するリアルタイムなカルシウム動態を評価できます。

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著者らは、顕微鏡実験で優れた技術支援のためにグレン·スローカム（ウィスコンシン医科大学）とコリーンA.ラビン（ニコンインスツルメンツ社）を感謝したいと思います。グレゴリー·ブラスは、原稿の重要な校正のために認められています。この研究は、（DVIに）米国腎臓学会から（ASに）1-15-BS-172を付与し、ベン·J·リップス研究員国立衛生研究所の助成金HL108880と米国糖尿病協会によってサポートされていました。

動物の使用と福祉制度動物実験委員会（IACUC）によってレビューされ、承認されたプロトコル以下の実験動物の管理と使用に関するNI​​Hガイドに付着する必要があります。 1.腎臓フラッシュ<ol><li> （ただし、異なる年齢や性別の他の株を適切に変更して使用することができ、スプラーグドーリー株である示唆）8から12週齢の雄ラットを使用してください。 </li><li> IACUCプロトコルによって許可された手順に従って、動物を麻酔。麻酔深度を監視し、動物を検査します。手術の詳細な説明は、1.3で実行される- 1.8 Ilatovskaya らに記載されています7。 </li><li>適切な麻酔の後、（長さ3インチまで）、腹部の正中切開を行い、温度制御手術台の上に動物を置き、大静脈と大動脈を発見。 </li><li>腹腔と腸間膜動脈と腹部周りに結紮糸を挿入これらの上記の大動脈。連結しないでください。 </li><li>腎動脈下の腹部大動脈を分析し、その周りに2合字を配置したが、合字の上に大動脈をクランプし、下糸を結ぶその後、​​連結していない鈍いです。 </li><li>クランプ以下（PBSを充填したシリンジポンプに取り付けられた）ポリエチレンPE50チューブを大動脈カテーテルを挿入し、第二の結紮糸でカテーテルを固定します。 、クランプを取り外し、ポンプをオンにし、腹腔動脈と大動脈および腸間膜を連結。すぐに圧力を緩和するために、腎静脈に切開します。 </li><li> /分6ミリリットルの速度で、2または3分間予備冷却PBSで大動脈を注入。 </li><li>灌流、消費税を停止し、7腎臓をデカプセル化し、PBS溶液中に氷の上に置きます。 IACUCによって承認されたプロトコルに従って、動物を安楽死させます。 </li></ol>ラット糸球体の2の単離<ol><li> RPMI 1640中の5％BSAの新鮮な溶液30mlを準備します。 </li><li>カミソリの刃やはさみを使用して、両方の腎臓の皮質を単離し、その後、均一になるまでミンチ。この手順は、以前に記載されている7。 </li><li>スパチュラを用いて（5％BSA / RPMI溶液に予備浸漬）100メッシュのステンレス鋼篩を通して、前のステップの間に細分化した組織を押してください。フロースルー及び重力によって収集し、フロースルーを140メッシュのふるいを通過することを可能にします。 </li><li> 、フロースルー予め浸漬200メッシュの篩を用いて、140メッシュのふるいから収集をフィルタろ液を捨て、そして10でふるいの上部を洗っ - で沈降糸球体を収集するために準備されたBSA / RPMI溶液15mlふるいです。 </li><li>最大20分間、チューブの底に糸球体の堆積物を15mlチューブに氷の上で糸球体を含むBSA / RPMI液を入れてみましょう。チューブの底に糸球体の濃縮が明らかに見られます。チューブ内の約2ミリリットルを残し、余分な溶液を除去します。 </li></ol> 3.シングルチャネルパッチクランプエルectrophysiology <ol><li> MW7万でそれらをコーティングすることにより、5×5ミリメートルのカバーガラスチップを準備 - 15万ポリʟリジン、および乾燥させてください。カバーガラスあたりの水に0.01％の滅菌濾過した溶液を約30μLを使用してください。 </li><li> RTへの実験的なソリューションをウォームアップし、パッチクランプ室とピペットを埋めます。 TRPCチャネルの監視の場合、mMの中で、浴溶液を使用します。126のNaCl、1のCaCl 2、10 HEPES、2のMgCl 2、10グルコース、pHが7.4;ピペット：126のNaCl、1.5のCaCl 2、10 HEPES、10グルコース; pHは7.4。 <ol><li>阻害すること（10mMのTEA、チャンネル） - 100μMのCaを遮断するニフルム酸またはDIDS（2+活性化Clで：推奨される（内因性チャネルの活性をブロックするためにピペット溶液に阻害剤を追加し、研究に関連されていません大コンダクタンスの Ca 2+ -依存性K +チャネル ）、10 nmのイベリオトキシン（のCa 2+活性化K +チャネルを遮断するために）、10μMのニカルジピン（N型Caをブロックします直接パッチクランプ実験前2+チャネル））。 </li></ol></li><li>静かに糸球体を含む溶液を混合し、次いでポリʟリジンコートカバーガラスチップに約50μLを適用します。糸球体は、約5分間添付してみましょう。 </li><li>浴溶液で予め充填されたパッチクランプ室に糸球体のガラスチップを移動します。付着していない糸球体の除去を確実にするために1分間、3ml /分の速度で室を灌流。 </li><li>セル接続モード7で、従来のパッチクランプ実験を行います。ガラスピペットを用いて（7から10MΩピペット抵抗）に、単離された糸球体の足細胞表面上に取り付けられたピペットは、 図2に示されている（穏やかな吸引を適用することにより、ピペットと足細胞膜との間に高抵抗シールを形成左）。 </li><li>セル付測定のために、8極ベッセルフィルタにより300 Hzの電流を低域通過。 </li><li> U6時間 - SEは最大4のパッチクランプ実験で糸球体を単離しました。氷の上で在庫糸球体の割合を保ちます。 </li></ol>足細胞の細胞内カルシウム濃度の4レシオメトリック共焦点蛍光測定<ol><li>コニカルチューブ0.5mlの（2.5で説明した）糸球体画分の500μLを置き、カルシウム色素のFuraレッド、AMとのFluo-4、AMを追加します。 2 mMのと（DMSOに溶解し、-20℃で保存）のFuraレッド、AMとのFluo-4、AM、それぞれの1 mMストック濃度を使用し、糸球体画分の500μlの各色素の2.5μLを使用します。直ちに染料の添加後、アルミニウムホイルでチューブを覆います。 </li><li> RTで1時間に少なくとも20分までのための回転シェーカー上に置いチューブ。 注：薬理学的薬剤は、この工程の間に加えることができます。 </li><li> 、カバーガラスを準備するポリʟリジンでそれらをカバーし、70℃に加熱されたプレートのセットを使用して乾燥を可能にします。 </li><li>カルシウム色素のロードはのcompletたらeは、ポリʟリジンコートカバースリップの解決策を含む糸球体の100μLを適用し、それらを約5分間、表面に固執しましょう​​。撮影室に糸球体付きカバースリップをマウントし、（（さ）mmで含む：145のNaCl、4.5のKCl、2のMgCl 2、10 HEPES、pHは7.35）浴溶液で灌流除去するために3ミリリットル/分の速度で付着していない糸球体、残りの染料。 </li><li> 488 nmの励起波長および発光フィルタ（それぞれのFluo-4及びフラ赤25分の525と25分の650ナノメートル）の共焦点レーザー走査顕微鏡を設定します。所望の周波数と解像度にイメージングソフトウェアを設定します。 </li><li>明視野で糸球体を検索し、その後、蛍光シグナルの検出をオンにします。信号の飽和を回避するために、各色素のためのレーザーの強さを調整します。直接ガラスに取り付けられている足細胞で焦点面を選択します。これは、薬物に応じて糸球体の収縮による影響を最小限に抑えますアプリケーション。希望の糸球体はよくガラスに接続されていることをダブルチェックしてください。 </li><li> 、選択の焦点面を撮像開始（高速のCa 2+過渡変化を可視化するために4秒に設定された周波数で512×512の画像を取る。高解像度画像のための60X / NA 1.4または類似の対物レンズを使用して）、関心のある薬物を適用および応答を記録します。 <ol><li> （糸球体の表面に足細胞のイメージングを確保するため、可能な限りガラスの表面に近い）は、所望の焦点面を選択します。 FLUO4とFuraRedチャネル上の蛍光の強度を確認し、糸球体は明らかに明視野で見ていることを確認してください。 </li><li>撮影を開始します。いずれかの薬剤の適用前に、レコードベースライン蛍光の少なくとも1分信号が安定していることを確認するために、（そこには突然のスパイクがされていないか、信号のフェージング）。 </li><li>マイクロピペットの助けを借りて、所望の薬を適用します。注意して、薬剤がよく拡散し、glomerに到達することができました確認してくださいウルス。必要に応じて静かに浴溶液を混合し、選択された焦点面を監視し、それがために薬物適用の焦点の外に移動しなかったことを確認してください。 </li><li> FLUO4とFuraRed信号用の蛍光強度の変化を記録します。記録信号がプラトーレベルに達するか、ピークに達し、その後ベースラインに戻るまで待機することにより、十分な長さであることを確認してください。必要に応じて任意の他の薬剤の溶液の変更や追加を行います。 </li><li>記録を停止し、ソフトウェアのネイティブ形式でファイルを保存します。 </li></ol></li></ol>カルシウム測定5.画像解析<ol><li>ネイティブND2形式で画像をインポートすることができNDユーティリティのプラグインを搭載したImageJのオープンソフトウェアで画像解析を実行します。 </li><li>イメージシーケンスをインポートします。チャンネルを分割し、hyperstackのグレースケールモードを使用するようにしてください。 </li><li> OへのImageJソフトウェアで分析→ツール→ROIマネージャパスに従ってくださいペンROIマネージャウィンドウ。 ROI Managerの楕円形選択ツール、「追加（T）」関数を使用して、興味のあるいくつかの領域（足細胞）を選択します。最後のROIとしては、バックグラウンドでエリアを選択します。 （保存→詳細）選択したROIを保存します。 </li><li>分析のために選択されたチャンネルを含むウィンドウを強調表示します。 、ROI Managerでマルチ測定機能→詳細を使用して飛び出すの対話で「1行あたりのスライス」のボックスに印を付け、[OK]をクリックします。結果は結果ウィンドウで設定可能な形式で表示されます。→設定測定メニューオプションの結果に入り、「グレー値の平均」と各ROIのための画素強度値を計算選択し、で表示されます各ROIのための別々の列に結果ウィンドウ。 </li><li>好適なデータ解析ソフトウェアに各チャネルの測定されたROIの輝度値（のFluo-4とのFuraレッド）をコピーします。各DATからのバックグラウンド強度値を減算しますポイント。 </li><li>各時点でのFuraレッドチャネルへのFluo-4の強度の比を計算します。各ROIのためのCa 2+トランジェントのプロット散布/ラインポイント時間の変更。選択された糸球体の平均/ SE値を計算します。 注：時間列は4.5で選択した撮影頻度に応じて設定する必要があります。 </li></ol>フルオ4蛍光シグナルを使用した6細胞内カルシウム濃度の計算<ol><li>糸球体のサンプルを取り、4.7のステップに実験プロトコルを実行します。バックグラウンド蛍光を記録した後に浴溶液に、レコード蛍光強度の増加（10μMであるべき浴室中の最終濃度）イオノマイシンを加えます。強度が最大に達し、崩壊が始まると、蛍光8をクエンチする（最終濃度が5 mMのでなければならない）のMnCl 2を追加します。 </li><li> 6.1で得られたデータを分析します。従っのFluo-4 ROI信号強度値が得られるコピー好適な解析ソフトウェアによって5.1から5.5に記載されているプロトコルに。 </li><li>式を使用して、ROIに対応する足細胞で（NMで）細胞内カルシウム濃度を計算します。 <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/52850/52850equation1.jpg" /> K dはフルオ4（345 nM）をするための一定の予め決め解離であり、Fは、あなたが（ベースライン）のためのカルシウム濃度を計算している時点での強度であり、F min及びF maxはでの強度値であり、 （イオノマイシン適用後）と（のMnCl 2を有する）蛍光の消光後の最大カルシウム負荷の点、それぞれ（ 図3参照 ）。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

ここで説明する手法は、げっ歯類の糸球体の足細胞によるカルシウム処理の分析を可能にします。この技術は、パッチクランプ単一チャンネル電気生理学、蛍光レシオメトリック共焦点イメージングの適用を可能にします。しかしながら、両方のアプローチは、それ自体で、別々に使用することができます。提案されたプロトコルは、1）腎フラッシュなど、いくつかの比較的単純なステップを、持っています。 2）差動ふるい分けによって糸球体の単離; 3）パッチクランプ電気生理学的実験を実施する、または細胞内カルシウムの変化のレシオメトリック共焦点イメージングのための蛍光カルシウム標識色素と糸球体のインキュベーション。 糸球体、Gloyに基づいて修正されたプロトコルを単離するためにら 5を用いました。差動ふるいの現在の技術の主な利点は、ボーマン嚢を剥奪糸球体を生成するため、洗練された、時間のかかる工程を必要としないことですマニュアルデカプセルの。単離された画分中の糸球体の大部分は、しかし、研究者は、あまりにも、カプセルの糸球体があることに注意する必要があり、カプセル化が解除されます。...

腎臓は、様々な物質のための恒常性バランスを維持し、総血圧を決定するようにして血液量を調節します。ハイパーまたは低血圧に至るまでに腎臓濾過、再吸収や分泌リードの障害または付随する病理学的状態は、最終的に腎臓移植を必要とする末期腎疾患を終了します。毛細血管内皮、基底膜および上皮細胞の単電池層- -スリットダイアフラムの完全性と機能1の維持に重要な役割を果たし足細胞、腎フィルタリング部（糸球体）は、3つの層からなります。選択透過性糸球体フィルタにおける機能不全は、蛋白尿などの巨大分子の尿損失の原因となります。種々の薬剤は、糸球体濾過障壁の完全性を決定し、それらの足細胞足突起の構造に影響を及ぼし得ます。 足細胞は、逮捕されるの維持に関与していますeruli濾過機能。これは、足細胞による不適切なカルシウム処理は、細胞損傷につながり、腎2,3の様々な形の進行に重要な役割を果たしていることが確立されています。したがって、細胞内カルシウム濃度の変化の直接測定を可能にするモデルの開発は、足細胞の機能の研究のための手段になります。単離された糸球体は、以前アルブミン反射係数の測定4および全細胞電気生理学的パッチクランプ測定5,6の積分携帯電流の評価を変更するなど、多くの研究で使用しました。本論文では、研究者は、薬剤の用途に応じて、細胞内カルシウム濃度の変化を測定し、細胞内カルシウムの基礎レベルを推定し、個々のカルシウムチャネルの活性を評価することを可能にするプロトコルを記述します。 Ratometricカルシウム濃度の測定値とパッチクランプelectrophysiologyはそれぞれ、足細胞及びチャネル内の活性細胞内カルシウム濃度の変化を決定するために使用しました。

<table><tbody><tr><td>Fluo4 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F14217</td><td>500 &amp;micro;l in DMSO</td></tr><tr><td>FuraRed AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-3020</td><td></td></tr><tr><td>Poly-&amp;#671;-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-68</td><td>溶液</td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3909-1ML</td><td></td></tr><tr><td>チューブローテーター</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-090-753</td><td>ドイツ</td></tr><tr><td>ニコン共焦点顕微鏡（倒立）</td><td>Nikon</td><td>Nikon A1R</td><td>レーザー励起 488 nm。放出フィルター 500-550 nm および 570-620 nm</td></tr><tr><td>対物レンズ</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>Thermo Scientific</td><td>6661B52</td><td></td></tr><tr><td>高真空グリース</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>シリコンコンパウンド</td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td>Nikon</td><td>Nikon NIS-Elements</td><td></td></tr><tr><td>記録/灌流チャンバー</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>パッチクランプアンプリファイア</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>データ収集システム</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td>Axon Digidata&amp;reg; System</td></tr><tr><td>ローパスフィルター</td><td>Warner Instruments</td><td>LPF-8</td><td>8ポールベッセル</td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスキャピラリー</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットプラー</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td>火炎/ブラウン型マイクロピペットプラー</td></tr><tr><td>マイクロフォージ</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>日本</td></tr><tr><td>電動マイクロマニピュレーター</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>微振動隔離台</td><td>TMC</td><td></td><td>ファラデーケージ搭載</td></tr><tr><td>マルチチャンネルバルブ灌流システム</td><td>AutoMake Scientific</td><td>Valve Bank II</td><td></td></tr><tr><td>記録/灌流チャンバー</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10.2</td><td></td></tr><tr><td>ニカルジピン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7510</td><td></td></tr><tr><td>イベリオトキシン</td><td>Sigma</td><td>I5904-5UG</td><td></td></tr><tr><td>ニフルム酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0630</td><td></td></tr><tr><td>DIDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3514-25MG</td><td></td></tr><tr><td>TEA chloride</td><td>Tocris</td><td>T2265</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11835030</td><td>抗生物質なし</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8327</td><td>30% アルブミン溶液</td></tr><tr><td>温度制御手術台</td><td>MCW core</td><td></td><td>げっ歯類用</td></tr><tr><td>ステンレス製ふるい：</td><td></td><td></td><td>#100 (150 &amp;mu;m), 140 (106 &amp;mu;m)</td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-316</td><td></td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-318</td><td></td></tr><tr><td>Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400</td><td>Fisher Sci</td><td>50-871-320</td><td></td></tr><tr><td>メッシュ 200</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s4145</td><td>CD-1用スクリーン</td></tr><tr><td>双眼顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>双眼顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプ式灌流システム</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレンチューブ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PE50</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン麻酔器</td><td><a href="http://www.vetequip.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> VetEquip, Inc.</a></td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>その他の基本試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

新たに単離した糸球体の足細胞における単一チャネル分析とカルシウムイメージング

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Podocytes(腎糸球体上皮細胞)は、糸球体透過性を調節し、糸球体構造を維持することが知られています。足細胞の損傷がタンパク尿と足の突起の衰退につながるため、さまざまな腎疾患の病因におけるこれらの細胞の重要な役割が確立されています。以前に報告されたように、さまざまな内因性物質が足細胞の細胞内Ca2+濃度に劇的な過負荷を引き起こし、おそらくアルブミン尿を引き起こす可能性があり、これはカルシウム伝導性イオンチャネルを介して起こる可能性があります。したがって、正常状態とさまざまな病理学的状態の両方で、足細胞のカルシウムの取り扱いを研究することが重要であるように思われました。しかし、利用可能な実験的アプローチは、培養細胞とトランスフェクション細胞にやや限定されたままです。それらはそのような研究のための優れた基本モデルを表していますが、本質的には糸球体の本来の環境から抽出されます。ここでは、新たに分離された全糸球体の一部として足細胞を研究する方法論について説明します。この調製物は、まだ毛細血管に付着している足細胞の機能的電位を保持しています。したがって、足細胞は糸球体ろ過装置の主要部分を保存する環境に留まります。本稿では、1)レシオメトリック共焦点蛍光顕微鏡によるカルシウム濃度変化のリアルタイム検出、および2)新たに単離された糸球体の足細胞における単一イオンチャネル活性の記録を可能にする2つの実験的アプローチについて詳しく説明します。これらの方法論は、糸球体の天然環境の利点を利用して、研究者がさまざまな薬剤の適用に応じた細胞内カルシウムの取り扱いの急激な変化を解決し、細胞内のカルシウムの基礎濃度を測定し(たとえば、疾患の進行を評価するため)、および単一イオンチャネルのレベルでカルシウムコンダクタンスを評価および操作することを可能にします。

ここでは、足細胞内カルシウム濃度の急激な変化を測定するという問題に取り組んだ。 図1は、新しくの足細胞での高解像度ライブ蛍光共焦点イメージングおよび単一のイオンチャネル活性の記録を行うために設計された実験プロトコルの概略図を示します分離されたげっ歯類糸球体。ラットを麻酔した後に簡単に説明すると、腎臓は血液のそれらをクリアするためにPBSでフラッシュする必要があります。その後、腎臓を摘出し、デカプセル化し、糸球体は、差動ふるいにより腎皮質から分離されているされています。試料の一部がパッチクランプ分析のために採取することができ、残りは蛍光カルシウム色素のFluo-4、AMおよびフラレッドを装填することができ、共焦点レシオメトリックカルシウムイメージングを行うために、AM。 単一のイオンチャネル活性の電気生理学的測定は、糸球体を単離した後すぐに行うことができます。イオン茶の活動nnels両方の細胞付着したパッチクランプ法のホールセル構成で測定することができます。示されたアプローチの実現可能性を実証するには、単一のTRPCのようなカルシウムイオン伝導チャネ...

足細胞の細胞内カルシウムレベルの変化は、糸球体の濾過機能を制御する最も重要な手段の一つです。ここでは、新たに単離された糸球体の足細胞におけるカルシウムの取り扱いと単一イオンチャネル活性をリアルタイムで検出できるハイスループットアプローチについて説明します。

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

本手順の全体的な目的は、薬理学的剤に対する反応としての細胞内カルシウム濃度の変化を測定することです。新鮮に単離した糸球体全体の構成要素として、ポドサイトにおけるカルシウムの基底レベルを推定し、個々のチャネル活性を評価します。これは、まず腹大動脈経由でフラッシングを行い、ラット腎臓から血液を除去することによって達成されます。次に、腎臓を採取し、腎皮質を単離してカミソリの刃で細切にします。第3ステップでは、差分的遠心分離により皮質糸球体を単離します。その後、単離された脱被膜糸球体を、電気生理学的実験に供するか、あるいは蛍光色素を導入して共焦点カルシウム濃度測定に用いることができます。最終的に、これらの手順により、さまざまな薬剤の投与に応答した細胞内カルシウムハンドリングの急激な変化を解明し、単一イオンチャネルレベルでのカルシウム伝導性を評価および操作することが可能になります。既存の手法に対するこの技術の主な利点は、単離した糸球体全体の一部としてポドサイトを研究できることです。本調製法は、ポドサイトの機能的ポテンシャルを維持しています。これらは毛細血管に付着したままであり、実際には糸球体濾過装置の主要部分を保存し得る環境の恒常性に寄与しています。この手法の意義は、我々の薬理学的スクリーニングを拡大させることにあります。正常および病態下において、ポドサイトによるカルシウムハンドリングのメカニズムは、糖尿病性腎症、局所分節性糸球体硬化症、または高血圧などの疾患における腎合併症の発症および予防において不可欠な調節的役割を果たしています。これらの細胞におけるカルシウム流入の薬剤に対する反応性を観察することは極めて重要であり、これは容易にスクリーニング可能です。本準備において、VLA Hunkaが、以降の手順に向けた腎臓のフラッシング方法を実演します。私は糸球体の単離とVクランプ電気生理学について説明し、Dr.GaNが共焦点カルシウムイメージングについて解説します。まず、麻酔をかけたラットを温度制御された手術台の上に置きます。顕微鏡下で腹部正中切開を行い、下大静脈（CVA）と大動脈を露出させます。次に、腹腔動脈、上腸間膜動脈、およびそれらの上方の腹大動脈を縛ります。腎動脈より下方で腹大動脈を鈍的に剥離します。その後、腹大動脈に2本の結紮糸を回しますが、結紮は行いません。結紮部位より上端の大動脈をクランプし、下側の糸を結びます。その後、クランプより下端の大動脈に、PBSを満たしたシリンジポンプに接続したポリエチレンチューブを留置し、2つ目の結紮糸でカテーテルを固定します。次に、クランプを取り除き、結紮します。腸動脈および腹腔動脈を処理します。あらかじめ冷却したPBSを、1分間に6 mLの速度で3分間大動脈に注入します。同時に、圧力を逃がすため、腎静脈付近の下大静脈を切開します。3分後、灌流を停止し、腎臓を摘出して包封します。腎臓を氷上のPBS溶液に入れます。次に、RPMI 1640培地を用いて、新鮮な5% BSAを30 mL調製します。カミソリとハサミを用いて、両腎臓の皮質を分離し、均質になるまで細切します。次に、5% P-S-A-R-P-M-I溶液で予め浸した100メッシュのステンレス製ふるいに、細切した組織を押し通します。ろ過液を回収し、さらに140メッシュのふるいに通します。続いて、140メッシュのふるいで回収したろ液を、あらかじめ浸水させた200メッシュのふるいでろ過します。ろ液は廃棄し、上のふるいを調製済みのB-S-A-R-P-M-I溶液10～15 mLで洗浄し、ふるいの上面から糸球体を回収します。次に、糸球体を含むB-S-A-R-P-M-I溶液を15 mLの遠心チューブに入れ、糸球体がチューブの底に沈殿するまで最大20分間静置します。この手順では、5 mm × 5 mmのカバーガラスチップを分子量70,000〜150,000のポリリジンでコーティングし、ホットプレート上で乾燥させます。次に、実験用溶液を室温まで温め、パッチクランプチャンバーとピペットを満たします。糸球体を含む溶液を静かに混合します。その後、ポリリジンコーティングした各カバーガラスチップに、その溶液を約50 µL滴下します。その後、糸球球を含むガラスチップを、Beth溶液で満たしたパッチクランプチャンバーへ移動させます。セルアタッチモードでの従来的なパッチクランプ記録を行う前に、チャンバー内を3 mL/minの速度で1分間灌流し、付着していない糸球球を除去してください。次に、各0.5 mLコニカルチューブに糸球体画分を500 µLずつ分注し、カルシウム染料のpure red AMおよびfluo-4 AMを添加します。続いて、チューブを回転シェーカーに設置し、室温で最大1時間攪拌します。その間に、ガラスカバースリップにポリリジンをコーティングし、70 °Cの加熱プレート上で乾燥させます。カルシウム染料によるローディングが完了したら、ポリリジンコーティングしたカバースリップに糸球体を含む溶液を100 µL滴下し、約5分間静置して表面に接着させます。次に、糸球体が付着したカバーガラスをイメージングチャンバーに装着し、分当たり3 mLの速度でバス溶液を灌流させ、付着していない糸球体と残留した染料を除去します。その後、共焦点レーザー走査顕微鏡の励起波長を488 nmに設定します。続いて、イメージングソフトウェアで任意の周波数と解像度を設定してください。次に、明視野で糸球体を確認します。続いて、蛍光信号の検出をオンにします。その後、任意の焦点面を選択し、flu oh fourおよびfiro redチャネルの蛍光強度を確認します。明視野で糸球体がはっきりと見えていることを確認します。次に、flu oh fourおよびfuror red信号の蛍光強度の変化を記録します。画像シーケンスを取り込むには、チャンネルを分割し、ハイパースタック・グレースケールモードを使用してください。Image Jソフトウェアにて、[Analyze] ツールから [ROI Manager] のパスに従い、ROIマネージャーウィンドウを開きます。楕円選択ツールとROIマネージャーの [Add T] 機能を使用して、1つ以上の関心領域（ROI）を選択します。次に、背景領域を選択し、選択したROIを保存します。次に、ダイアログの「one row per slice」ボックスにチェックを入れ、メニューオプションの「results」で「okay」をクリックします。「Set measurements」を選択し、「mean gray value」を指定して、各ROIのピクセル強度値を算出します。これにより、結果ウィンドウに各値が別々の列で表示されます。次に、各ROIについて、各チャネルで測定されたROI輝度値を推奨のデータ解析ソフトウェアにコピーし、各タイムポイントの各データポイントから背景輝度値を差し引きます。その後、Fluo-4チャネルとURA redチャネルの輝度比を算出し、各ROIにおけるカルシウム・トランジェントの経時変化をプロットします。この画像は、ラット糸球体表面の酸化物体に装着されたパッチクランプピペットを示しています。電気生理学的記録中、画像の右下隅に被膜に包まれた糸球体の一部が確認できます。ここでは、細胞内カルシウム濃度を測定するためにポドサイト（足細胞）に形成したセルアタッチドパッチからの、TRP様チャネル活性の代表的な電流トレースを示します。糸球体には、細胞内カルシウムを標識するためにfluo-4 AMが充填されています。このビデオでは、糸球体におけるカルシウム流入に対するCINおよび塩化マンガンの影響について説明します。このグラフは、CINおよび塩化マンガンに応答して単一の足細胞から記録されたfluo-4信号強度の変化を定量化したものです。予想通り、CINによって蛍光が最大となり、塩化マンガンによって色素が消光され、蛍光強度が最低となります。これらの薬剤を適用することで、研究者は後に細胞内の正確なカルシウム濃度を定義することができます。このビデオでは、10 µMのATPが糸球体内のカルシウム濃度に及ぼす影響を実演しています。緑色のFluo-4蛍光の増加と赤色のFura-Red蛍光の減少に注目してください。これは、細胞内カルシウム濃度の上昇を示しています。この手法は、薬理学的処置やその他の操作後における、単一イオンチャネルおよび個々の細胞レベルでのカルシウム流入の変化をモニタリングするユニークな機会を提供します。したがって、利用可能な複数の遺伝子改変げっ歯類モデルを考慮すると、このアプローチは非常に強力なツールとなります。このビデオを視聴することで、ポドサイトにおけるカルシウム濃度の測定方法に加え、それ単独で、あるいは併用して用いられる電位固定法（voltage clamp）などの電気生理学的な実験方法について十分に理解できるはずです。これらの手法により、正常および病理学的条件下におけるポドサイトのカルシウムハンドリング調節について、詳細かつメカニズムに基づいた知見が得られます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

免疫組織化学プロトコルは、網膜中の特定のタンパク質の局在化を研究するために使用される。カルシウムイメージング技術は、網膜神経節細胞および軸索のカルシウム動態を研究するために使用される。...

ホールマウントラット網膜における免疫組織化学的およびカルシウムイメージング法

ここで説明するには、セルに接続されたパッチクランプ技術を用いて1イオンチャネルから現在の記録の長いストレッチを取得するための手順です。この方法は、リアルタイムで、観察するための生体信号の基礎となる開閉チャネルコンフォメーションのパターンを可能にする。これらのデータは、邪魔されずに生体膜におけるチャネルのプロパティをお知らせ。...

一チャネルセル付パッチクランプ法

カルシウムは、多くの生理学的および病態生理学的なシグナル伝達経路に関与している。生細胞イメージングは​​、特殊な設備を必要とし、時間がかかる可能性がある。懸濁液中に持ち込ま付着上皮細胞における細胞質カルシウムの相対的変化を決定するために、フローサイトメーターを使用して迅速に、簡単な方法を最適化した。...

フローサイトメトリーによる腎上皮細胞における細胞質ゾルカルシウム測定

ここでは、Ca2+インジケーターをロードした無傷の哺乳類細胞で蛍光顕微鏡を使用して、局所的なIP3媒介Ca2+イベントをイメージングする技術と、これらのイベントの識別と分析を自動化するアルゴリズムを紹介します。...

イメージングローカルCA<sup&gt; 2+</sup&gt;培養哺乳動物細胞内シグナル

尿細管上皮細胞で発現するイオンチャネルは、多発性嚢胞腎疾患の病理において重要な役割を果たす。ここでは、新たにげっ歯類の腎臓から単離された胆嚢上皮におけるパッチクランプ分析を行うために使用される実験プロトコルおよび細胞内カルシウムレベルの測定を説明します。...

新たに単離したPKD上皮の機能的特性を監視するためにパッチクランプし、ライブ蛍光顕微鏡を実装

ここでは、膵島細胞などの異種細胞集団におけるカルシウム動態をイメージングおよび定量するためのプロトコルを提示する。蛍光レポーターは、イヌビレット内の細胞の末梢層に送達され、次いで固定化および画像化され、蛍光強度のダイナミクスの細胞単位分析が行われます。...

マウス膵島細胞の亜集団におけるカルシウムダイナミクスのイメージング

このプロトコルの目的は、ビブラートメの切断を使用してマウス腎盂の無傷のペースメーカー領域を分離することです。これらのセクションは、その後、ビブラート細胞内のペースメーカー細胞および他の間質細胞のCa2+一過性特性を解明するために、Situ...

ビブラートーム切除によるマウス腎盂の分離とイメージングライブ、無傷のペースメーカー領域

この提示方法は、従来の顕微鏡で70nmの分解能を導く拡大顕微鏡による蛍光標識された細胞タンパク質の可視化を可能にする。...

拡張顕微鏡によるポドサイクタンパク質のイメージングニーフリン、アクチン、ポドシン

細胞カルシウムイメージングは、ユニークな機能的シグネチャを与えるカルシウム透過性チャネル/受容体の発現に基づいて、培養中の混合集団、または覚醒した動物でさえも、個々の細胞の動的シグナル伝達を研究するための汎用性の高い方法論です。...

カルシウムイメージング技術によるニューロン-グリア回路の変化の可視化

このプロトコルは、後根神経節(DRG)の外科的曝露とそれに続くGCaMP3(遺伝的にコードされたCa2+ インジケーター;緑色蛍光タンパク質-カルモジュリン-M13タンパク質 3)Pirt-GCaMP3マウスを用いて、同側後肢に様々な刺激を加えながら神経細胞集合体をCa2+...

インビボ 無傷の背根神経節における一次感覚ニューロンのネットワークにおけるニューロンアンサンブルのカルシウムイメージング

この記事では、Fura-2/AM色素を用いたシングルセルCa2+イメージングを使用して、細胞内のカルシウムイオン(Ca2+)濃度をリアルタイムで定量的にモニタリングする方法を紹介します。この技術により、効率的な色素ローディングと、蛍光強度比によるCa2+レベルの正確な計算が可能になり、研究アプリケーションのためのシンプルで迅速なアプローチが可能になります。...

カルシウムイオンチャネルの活性化を研究するためのシングルセルカルシウムイメージング

学ぶ単一チャネル分析とカルシウムイメージングを用いて、新たに単離した糸球体の足細胞における細胞内カルシウム濃度変化を測定する方法です。電気生理学的手法と共焦点顕微鏡を組み合わせ、薬理学的刺激に対するリアルタイムなカルシウム動態を評価できます。

新たに単離した糸球体の足細胞における単一チャネル分析とカルシウムイメージング

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