新たに単離した糸球体の足細胞における単一チャネル分析とカルシウムイメージング

本手順の全体的な目的は、薬理学的剤に対する反応としての細胞内カルシウム濃度の変化を測定することです。新鮮に単離した糸球体全体の構成要素として、ポドサイトにおけるカルシウムの基底レベルを推定し、個々のチャネル活性を評価します。これは、まず腹大動脈経由でフラッシングを行い、ラット腎臓から血液を除去することによって達成されます。

次に、腎臓を採取し、腎皮質を単離してカミソリの刃で細切にします。第3ステップでは、差分的遠心分離により皮質糸球体を単離します。その後、単離された脱被膜糸球体を、電気生理学的実験に供するか、あるいは蛍光色素を導入して共焦点カルシウム濃度測定に用いることができます。

最終的に、これらの手順により、さまざまな薬剤の投与に応答した細胞内カルシウムハンドリングの急激な変化を解明し、単一イオンチャネルレベルでのカルシウム伝導性を評価および操作することが可能になります。既存の手法に対するこの技術の主な利点は、単離した糸球体全体の一部としてポドサイトを研究できることです。本調製法は、ポドサイトの機能的ポテンシャルを維持しています。

これらは毛細血管に付着したままであり、実際には糸球体濾過装置の主要部分を保存し得る環境の恒常性に寄与しています。この手法の意義は、我々の薬理学的スクリーニングを拡大させることにあります。正常および病態下において、ポドサイトによるカルシウムハンドリングのメカニズムは、糖尿病性腎症、局所分節性糸球体硬化症、または高血圧などの疾患における腎合併症の発症および予防において不可欠な調節的役割を果たしています。これらの細胞におけるカルシウム流入の薬剤に対する反応性を観察することは極めて重要であり、これは容易にスクリーニング可能です。

本準備において、VLA Hunkaが、以降の手順に向けた腎臓のフラッシング方法を実演します。私は糸球体の単離とVクランプ電気生理学について説明し、Dr.GaNが共焦点カルシウムイメージングについて解説します。まず、麻酔をかけたラットを温度制御された手術台の上に置きます。顕微鏡下で腹部正中切開を行い、下大静脈（CVA）と大動脈を露出させます。

次に、腹腔動脈、上腸間膜動脈、およびそれらの上方の腹大動脈を縛ります。腎動脈より下方で腹大動脈を鈍的に剥離します。その後、腹大動脈に2本の結紮糸を回しますが、結紮は行いません。

結紮部位より上端の大動脈をクランプし、下側の糸を結びます。その後、クランプより下端の大動脈に、PBSを満たしたシリンジポンプに接続したポリエチレンチューブを留置し、2つ目の結紮糸でカテーテルを固定します。次に、クランプを取り除き、結紮します。

腸動脈および腹腔動脈を処理します。あらかじめ冷却したPBSを、1分間に6 mLの速度で3分間大動脈に注入します。同時に、圧力を逃がすため、腎静脈付近の下大静脈を切開します。

3分後、灌流を停止し、腎臓を摘出して包封します。腎臓を氷上のPBS溶液に入れます。次に、RPMI 1640培地を用いて、新鮮な5% BSAを30 mL調製します。

カミソリとハサミを用いて、両腎臓の皮質を分離し、均質になるまで細切します。次に、5% P-S-A-R-P-M-I溶液で予め浸した100メッシュのステンレス製ふるいに、細切した組織を押し通します。ろ過液を回収し、さらに140メッシュのふるいに通します。

続いて、140メッシュのふるいで回収したろ液を、あらかじめ浸水させた200メッシュのふるいでろ過します。ろ液は廃棄し、上のふるいを調製済みのB-S-A-R-P-M-I溶液10～15 mLで洗浄し、ふるいの上面から糸球体を回収します。次に、糸球体を含むB-S-A-R-P-M-I溶液を15 mLの遠心チューブに入れ、糸球体がチューブの底に沈殿するまで最大20分間静置します。

この手順では、5 mm × 5 mmのカバーガラスチップを分子量70,000〜150,000のポリリジンでコーティングし、ホットプレート上で乾燥させます。次に、実験用溶液を室温まで温め、パッチクランプチャンバーとピペットを満たします。糸球体を含む溶液を静かに混合します。その後、ポリリジンコーティングした各カバーガラスチップに、その溶液を約50 µL滴下します。

その後、糸球球を含むガラスチップを、Beth溶液で満たしたパッチクランプチャンバーへ移動させます。セルアタッチモードでの従来的なパッチクランプ記録を行う前に、チャンバー内を3 mL/minの速度で1分間灌流し、付着していない糸球球を除去してください。

次に、各0.5 mLコニカルチューブに糸球体画分を500 µLずつ分注し、カルシウム染料のpure red AMおよびfluo-4 AMを添加します。続いて、チューブを回転シェーカーに設置し、室温で最大1時間攪拌します。その間に、ガラスカバースリップにポリリジンをコーティングし、70 °Cの加熱プレート上で乾燥させます。カルシウム染料によるローディングが完了したら、ポリリジンコーティングしたカバースリップに糸球体を含む溶液を100 µL滴下し、約5分間静置して表面に接着させます。

次に、糸球体が付着したカバーガラスをイメージングチャンバーに装着し、分当たり3 mLの速度でバス溶液を灌流させ、付着していない糸球体と残留した染料を除去します。その後、共焦点レーザー走査顕微鏡の励起波長を488 nmに設定します。続いて、イメージングソフトウェアで任意の周波数と解像度を設定してください。

次に、明視野で糸球体を確認します。続いて、蛍光信号の検出をオンにします。その後、任意の焦点面を選択し、flu oh fourおよびfiro redチャネルの蛍光強度を確認します。

明視野で糸球体がはっきりと見えていることを確認します。次に、flu oh fourおよびfuror red信号の蛍光強度の変化を記録します。画像シーケンスを取り込むには、チャンネルを分割し、ハイパースタック・グレースケールモードを使用してください。

Image Jソフトウェアにて、[Analyze] ツールから [ROI Manager] のパスに従い、ROIマネージャーウィンドウを開きます。楕円選択ツールとROIマネージャーの [Add T] 機能を使用して、1つ以上の関心領域（ROI）を選択します。次に、背景領域を選択し、選択したROIを保存します。

次に、ダイアログの「one row per slice」ボックスにチェックを入れ、メニューオプションの「results」で「okay」をクリックします。「Set measurements」を選択し、「mean gray value」を指定して、各ROIのピクセル強度値を算出します。これにより、結果ウィンドウに各値が別々の列で表示されます。

次に、各ROIについて、各チャネルで測定されたROI輝度値を推奨のデータ解析ソフトウェアにコピーし、各タイムポイントの各データポイントから背景輝度値を差し引きます。その後、Fluo-4チャネルとURA redチャネルの輝度比を算出し、各ROIにおけるカルシウム・トランジェントの経時変化をプロットします。この画像は、ラット糸球体表面の酸化物体に装着されたパッチクランプピペットを示しています。

電気生理学的記録中、画像の右下隅に被膜に包まれた糸球体の一部が確認できます。ここでは、細胞内カルシウム濃度を測定するためにポドサイト（足細胞）に形成したセルアタッチドパッチからの、TRP様チャネル活性の代表的な電流トレースを示します。糸球体には、細胞内カルシウムを標識するためにfluo-4 AMが充填されています。

このビデオでは、糸球体におけるカルシウム流入に対するCINおよび塩化マンガンの影響について説明します。このグラフは、CINおよび塩化マンガンに応答して単一の足細胞から記録されたfluo-4信号強度の変化を定量化したものです。予想通り、CINによって蛍光が最大となり、塩化マンガンによって色素が消光され、蛍光強度が最低となります。

これらの薬剤を適用することで、研究者は後に細胞内の正確なカルシウム濃度を定義することができます。このビデオでは、10 µMのATPが糸球体内のカルシウム濃度に及ぼす影響を実演しています。緑色のFluo-4蛍光の増加と赤色のFura-Red蛍光の減少に注目してください。これは、細胞内カルシウム濃度の上昇を示しています。

この手法は、薬理学的処置やその他の操作後における、単一イオンチャネルおよび個々の細胞レベルでのカルシウム流入の変化をモニタリングするユニークな機会を提供します。したがって、利用可能な複数の遺伝子改変げっ歯類モデルを考慮すると、このアプローチは非常に強力なツールとなります。このビデオを視聴することで、ポドサイトにおけるカルシウム濃度の測定方法に加え、それ単独で、あるいは併用して用いられる電位固定法（voltage clamp）などの電気生理学的な実験方法について十分に理解できるはずです。

これらの手法により、正常および病理学的条件下におけるポドサイトのカルシウムハンドリング調節について、詳細かつメカニズムに基づいた知見が得られます。