マウスの脳の側脳室における上衣繊毛のライブイメージング
2015年6月1日
高解像度の微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡を用いて、マウス脳室の中に位置運動上衣繊毛の鼓動のex vivo観察ライブイメージングによって実証されます。技術はユニークな繊毛運動の周波数の記録や暴行角度ならびにそれらの細胞内カルシウム振動ペーシング特性を可能にします。
本手順の全体的な目的は、マウス脳室内に位置するMotr append CLIAの拍動をex vivoで観察することです。まず全脳を採取し、次に側脳室を含む薄い切片を作成することでこれを達成します。その後、実験中に組織を生かしておくため、高グルコース培地を入れたカスタム仕様のガラスボトムプレートを用いて、体温で切片をインキュベートします。
最後に、高解像度の微分干渉コントラスト顕微鏡を用いて繊毛の拍動を記録します。最終的に、免疫蛍光イメージングによって繊毛の構造とタンパク質の局在を可視化することができます。我々の既存の手法に対するこの技術の主な利点は、独自の繊毛拍動頻度と角度に基づいて、表皮細胞を3つの明確なグループに分類することを可能にした初めての技術である点にあります。
これは良好な結果です。この技術の意義は、水頭症の治療へと展開されます。なぜなら、心室周囲上皮細胞（CLIA）の機能異常は、脳内における脳脊髄液の蓄積を招くためです。
心室の手順を実演するのは、当研究室の非常に優秀な学生であるZaha AlamさんとHannahさんです。まず、成マウスの頭部を70% ethanolで洗浄します。次に、頭頂部から開始し、滅菌済みの剪刀とピンセットを用いて皮膚を取り除き、頭蓋骨を露出させます。
次に、後側から前側に向かって、骨を少しずつ接合します。頭蓋骨を取り除くため、脳全体を選択し、37 °Cの高グルコース培地を入れた100 mmのペトリ皿に置きます。鋭利な刃を用いて、脳を正中矢状面に沿って切断し、各半球から最初の100〜200 µmの切片を得ます。
その後、切片を37 °CのPBSで洗浄し、直ちに組織を37 °Cの高グルコース培地に置きます。切片のイメージングを行うため、脳切片を1 mLの高グルコース培地を含む30 mmガラスボトム培養皿に入れ、密閉型顕微鏡チャンバー内の環境を60倍油浸対物レンズを用いて37 °C、5% carbon dioxideに調整します。次に、通常のDIC透過光を用いて細胞にピントを合わせます。
次に、DMEMの気泡が移動する方向をガイドとして、運動性のependymal cilia（室管膜繊毛）の位置を特定します。DICフィルターを使用して、脳の側脳室において運動性CLIAを持つ健全な細胞を含む領域を選択してください。ependymal ciliaを特定した後、光量とフォーカスを調整し、十分な画像を取得します。
次に、イメージングソフトでライブイメージングのパラメータを設定します。例えばここでは、60x対物レンズを用い、カメラビンニングを1×1に設定して24bit画像を取得しており、露光時間は5〜10msに設定しています。露光時間を最小限に抑えるために顕微鏡の絞りを最適レベルまで開き、DIC画像を取得します。
遅延なく迅速かつ即座に画像を取得するため、カメラにストリーミングされるライブ画像を観察します。その後、カルシウムシグナリングを記録するために十分な画像コントラストを得るのに必要な最小露光時間に基づいて、心拍速度を算出します。脳をスライスした後、組織をPBSで軽くすすぎ、直ちにガラスボトムプレート内で、新しく調製した20 µg/mLのlu O2に切片をインキュベートします。
37°Cで30分間静置した後、キャプチャレート5ミリ秒で、最低1秒間のカルシウム振動を記録します。まず励起波長488nmで記録し、次に蛍光波長515nmで記録します。免疫蛍光顕微鏡により目的の細胞マーカーを可視化するため、サンプルをPBS中の4%パラホルムアルデヒドおよび2%スクロースで10分間固定します。
組織をPBSで5分間ずつ3回洗浄します。次に、脳切片を0.1% Triton Xで5分間インキュベートします。デモンストレーションした通りにサンプルを洗浄した後、マウス抗アセチル化α-チューブリン抗体でインキュベートします。
再度PBSで洗浄した後、サンプルをフルオレセイン標識抗US IgGで室温にて1時間インキュベートします。最後に、切片をDPIで5分間対比染色し、最短の露光時間で直ちに細胞を撮影します。penal CLIAの存在は、DPI対比染色を併用した繊毛マーカーのアセチル化α-tubulinにより確認します。核を特定し、penal CLIAの運動性の流れを解析するために、移動する細胞の拍動頻度と角度パターンをカウントします。
これらのデータに基づき、CLIAを3つのグループのいずれかに分類することができます。重要な点として、CLIAを0.25% Ethanolにさらすと、そのタイプに関わらずCLIAの拍動頻度が有意に抑制されます。さらにCLIAを屈曲させると、繊毛依存性の細胞内カルシウムシグナリングが誘発され、これにより脳室内の細胞内カルシウムシグナルの測定が可能になります。この手法を習得し、適切に実施すれば、1時間で完了させることができます。
この手順を行う際は、脳室の発達後にそれを破壊しないよう、脳組織を丁寧かつ効率的に扱うことが重要です。この手法により、神経科学分野の研究者が、生きたマウスの脳組織においてappend CLIAの機能を探索する道が開かれました。
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概要
本研究では、高解像度微分干渉コントラスト顕微鏡を用いて、マウス脳室における運動性室管膜繊毛の拍動をex vivoで観察する方法を提示します。この手法により、固有の繊毛拍動周波数と拍動角に加え、細胞内カルシウム振動の特性を捉えることが可能です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 顕微鏡技術
背景
- 脳室膜細胞の繊毛は、脳脊髄液の循環において重要な役割を果たしています。
- 繊毛のダイナミクスを理解することは、脳機能への洞察を得ることにつながります。
- 細胞構造の研究には、高解像度イメージング技術が不可欠です。
- 本研究では、繊毛の特性に基づいて脳室膜細胞を分類することを目的としています。
研究の目的
- motile ependymal cilia（運動性脳室上衣細胞繊毛）の拍動をex vivoで観察すること。
- 繊毛の拍動周波数および拍動角を記録すること。
- 細胞内カルシウム振動の特性を調査すること。
使用方法
- マウス脳全体の採取および薄切切片の作製。
- 高グルコース含有培地を用い、体温条件下で切片をインキュベートする。
- 高解像度微分干渉顕微鏡を用いてイメージングを行う。
- 免疫蛍光染色により、繊毛構造およびタンパク質の局在を可視化する。
主な結果
- 生体組織における繊毛拍動ダイナミクスの記録に成功。
- 上衣細胞を3つの異なるグループに分類。
- 固有の繊毛拍動周波数および拍動角を同定。
- 繊毛運動とカルシウム振動の関係に関する知見を提示。
結論
- この技術により、脳室帯細胞の繊毛の詳細な解析が可能になります。
- これにより、脳における繊毛機能の理解が深まります。
- 得られた知見は、より広範な神経科学研究に寄与する可能性があります。
よくある質問
産業界における重要性
室管膜細胞の繊毛ダイナミクスを理解することは、水頭症などの神経疾患における重要な要因である脳脊髄液の調節に関するメカニズム的な洞察をもたらします。このex vivoでのライブイメージング手法により、繊毛の拍動周波数およびカルシウムシグナリングの定量的な評価が可能となり、中枢神経系（CNS）の創薬におけるターゲットバリデーションを支援します。本技術は、構造的および機能的な繊毛表現型を生理学的アウトカムに結びつけることで、治療仮説のリスク低減に寄与します。
バイオ製薬R&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：脳脊髄液の恒常性と脳室機能に関する治療的仮説の検証を可能にする。
- 科学的価値：拍動周波数と角度パターンの基づく上衣細胞サブタイプの分類により、生物学的リスクの低減（de-risking）を支援する。
- 科学的価値：繊毛の運動性と細胞内カルシウム振動の相関関係を通じて、機能的ターゲットのバリデーションを促進する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 実用的価値： 繊毛ダイナミクスの再現性のある定量的なイメージングのため、検証済みの脳組織切片を調製する。
- 実用的価値： イメージング中の繊毛の生存能を維持するため、生体組織のインキュベーション条件の標準化を可能にする。
- 実用的価値： エタノールやその他の薬剤を用いて繊毛拍動の抑制を評価する、薬理学的変調研究のためのアッセイ準備を支援する。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 翻訳的価値： 繊毛構造とタンパク質局在（例：アセチル化α-tubulin）を、疾患関連モデルにおける機能的な読み取り値へと結びつけます。
- 翻訳的価値： カルシウム振動および拍動周波数に対する薬理学的薬剤の評価を可能にし、作用機序研究に情報を供します。
- 翻訳的価値： 脳室病変に脳室帯細胞の機能不全が寄与する遺伝的モデルまたは損傷モデルにおいて、表現型解析をサポートします。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、ターゲット仮説の検証から前臨床検証に至る創薬の連続的なプロセスに適合するものであり、特に脳室機能や体液恒常性に関わるCNSターゲットに有用です。
- 探索生物学： 組織内で繊毛の運動性とカルシウムシグナリングを直接観察することを可能にし、メカニズム解析におけるリスク軽減を支援します。
- スクリーニング： 化合物スクリーニングに向けて、繊毛拍動数および角度パターンの定量的で再現性のあるリードアウトを提供します。
- 分析： 多次元的なデータ解釈のため、フレームごとのビデオ解析および蛍光ベースのカルシウム振動指標を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ： 構造イメージング（免疫蛍光染色）と機能アッセイを連携させ、ターゲットへの結合から表現型への結果までの連続性を確保します。
- エンタープライズ再利用： さまざまな疾患モデルや治療的介入における繊毛機能の研究に活用可能な、再利用可能なプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：室管膜 cilia（繊毛）の構造的、運動的、およびシグナル伝達上の表現型を相関させることで、メカニズム的な曖昧さを低減する。
- 運用的価値：組織調製、インキュベーション、およびイメージングパラメータを標準化することで、再現性を確保する。
- 戦略的価値：脳室生理学に関連するCNSターゲットの早期機能検証を提供し、Go/No-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響：繊毛拍動およびカルシウムダイナミクスへの影響に基づいた、リスク調整後の化合物優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- マイクロサージェリー、組織切片作成、およびガス・温度制御条件下でのライブイメージングの専門知識が必要です。
- 環境チャンバー制御を備えた高解像度DICおよび蛍光顕微鏡システムに依存します。
- 切片の厚さ、インキュベーション時間、および画像取得設定を統一するため、チーム間での標準化が必要です。
- 適応に関する検討事項として、マウスの系統、年齢、および疾患モデルによる繊毛挙動の変動が挙げられます。
- 実用的制限：組織の生存能低下に伴い時間経過とともに信号が減衰するため、切片作成後速やかに実験を行う必要があります。
