2015年6月1日
高解像度の微分干渉コントラスト(DIC)顕微鏡を用いて、マウス脳室の中に位置運動上衣繊毛の鼓動のex vivo観察ライブイメージングによって実証されます。技術はユニークな繊毛運動の周波数の記録や暴行角度ならびにそれらの細胞内カルシウム振動ペーシング特性を可能にします。
本手順の全体的な目的は、マウス脳室内に位置するMotr append CLIAの拍動をex vivoで観察することです。まず全脳を採取し、次に側脳室を含む薄い切片を作成することでこれを達成します。その後、実験中に組織を生かしておくため、高グルコース培地を入れたカスタム仕様のガラスボトムプレートを用いて、体温で切片をインキュベートします。
最後に、高解像度の微分干渉コントラスト顕微鏡を用いて繊毛の拍動を記録します。最終的に、免疫蛍光イメージングによって繊毛の構造とタンパク質の局在を可視化することができます。我々の既存の手法に対するこの技術の主な利点は、独自の繊毛拍動頻度と角度に基づいて、表皮細胞を3つの明確なグループに分類することを可能にした初めての技術である点にあります。
これは良好な結果です。この技術の意義は、水頭症の治療へと展開されます。なぜなら、心室周囲上皮細胞(CLIA)の機能異常は、脳内における脳脊髄液の蓄積を招くためです。
心室の手順を実演するのは、当研究室の非常に優秀な学生であるZaha AlamさんとHannahさんです。まず、成マウスの頭部を70% ethanolで洗浄します。次に、頭頂部から開始し、滅菌済みの剪刀とピンセットを用いて皮膚を取り除き、頭蓋骨を露出させます。
次に、後側から前側に向かって、骨を少しずつ接合します。頭蓋骨を取り除くため、脳全体を選択し、37 °Cの高グルコース培地を入れた100 mmのペトリ皿に置きます。鋭利な刃を用いて、脳を正中矢状面に沿って切断し、各半球から最初の100〜200 µmの切片を得ます。
その後、切片を37 °CのPBSで洗浄し、直ちに組織を37 °Cの高グルコース培地に置きます。切片のイメージングを行うため、脳切片を1 mLの高グルコース培地を含む30 mmガラスボトム培養皿に入れ、密閉型顕微鏡チャンバー内の環境を60倍油浸対物レンズを用いて37 °C、5% carbon dioxideに調整します。次に、通常のDIC透過光を用いて細胞にピントを合わせます。
次に、DMEMの気泡が移動する方向をガイドとして、運動性のependymal cilia(室管膜繊毛)の位置を特定します。DICフィルターを使用して、脳の側脳室において運動性CLIAを持つ健全な細胞を含む領域を選択してください。ependymal ciliaを特定した後、光量とフォーカスを調整し、十分な画像を取得します。
次に、イメージングソフトでライブイメージングのパラメータを設定します。例えばここでは、60x対物レンズを用い、カメラビンニングを1×1に設定して24bit画像を取得しており、露光時間は5〜10msに設定しています。露光時間を最小限に抑えるために顕微鏡の絞りを最適レベルまで開き、DIC画像を取得します。
遅延なく迅速かつ即座に画像を取得するため、カメラにストリーミングされるライブ画像を観察します。その後、カルシウムシグナリングを記録するために十分な画像コントラストを得るのに必要な最小露光時間に基づいて、心拍速度を算出します。脳をスライスした後、組織をPBSで軽くすすぎ、直ちにガラスボトムプレート内で、新しく調製した20 µg/mLのlu O2に切片をインキュベートします。
37°Cで30分間静置した後、キャプチャレート5ミリ秒で、最低1秒間のカルシウム振動を記録します。まず励起波長488nmで記録し、次に蛍光波長515nmで記録します。免疫蛍光顕微鏡により目的の細胞マーカーを可視化するため、サンプルをPBS中の4%パラホルムアルデヒドおよび2%スクロースで10分間固定します。
組織をPBSで5分間ずつ3回洗浄します。次に、脳切片を0.1% Triton Xで5分間インキュベートします。デモンストレーションした通りにサンプルを洗浄した後、マウス抗アセチル化α-チューブリン抗体でインキュベートします。
再度PBSで洗浄した後、サンプルをフルオレセイン標識抗US IgGで室温にて1時間インキュベートします。最後に、切片をDPIで5分間対比染色し、最短の露光時間で直ちに細胞を撮影します。penal CLIAの存在は、DPI対比染色を併用した繊毛マーカーのアセチル化α-tubulinにより確認します。核を特定し、penal CLIAの運動性の流れを解析するために、移動する細胞の拍動頻度と角度パターンをカウントします。
これらのデータに基づき、CLIAを3つのグループのいずれかに分類することができます。重要な点として、CLIAを0.25% Ethanolにさらすと、そのタイプに関わらずCLIAの拍動頻度が有意に抑制されます。さらにCLIAを屈曲させると、繊毛依存性の細胞内カルシウムシグナリングが誘発され、これにより脳室内の細胞内カルシウムシグナルの測定が可能になります。この手法を習得し、適切に実施すれば、1時間で完了させることができます。
この手順を行う際は、脳室の発達後にそれを破壊しないよう、脳組織を丁寧かつ効率的に扱うことが重要です。この手法により、神経科学分野の研究者が、生きたマウスの脳組織においてappend CLIAの機能を探索する道が開かれました。
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本研究では、高解像度微分干渉コントラスト顕微鏡を用いて、マウス脳室における運動性室管膜繊毛の拍動をex vivoで観察する方法を提示します。この手法により、固有の繊毛拍動周波数と拍動角に加え、細胞内カルシウム振動の特性を捉えることが可能です。
室管膜細胞の繊毛ダイナミクスを理解することは、水頭症などの神経疾患における重要な要因である脳脊髄液の調節に関するメカニズム的な洞察をもたらします。このex vivoでのライブイメージング手法により、繊毛の拍動周波数およびカルシウムシグナリングの定量的な評価が可能となり、中枢神経系(CNS)の創薬におけるターゲットバリデーションを支援します。本技術は、構造的および機能的な繊毛表現型を生理学的アウトカムに結びつけることで、治療仮説のリスク低減に寄与します。
この手法は、ターゲット仮説の検証から前臨床検証に至る創薬の連続的なプロセスに適合するものであり、特に脳室機能や体液恒常性に関わるCNSターゲットに有用です。