Name: ファージフェノミクス：小説のウイルスタンパク質を特徴づけるために、生理的アプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 学ぶファージ遺伝子の機能解析法。大腸菌でウイルスORFを発現させ、マルチフェノタイプアッセイプレートとガスクロマトグラフィー・質量分析を用いて代謝変化を評価し、細菌とファージの相互作用を解明します。

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この原稿に対する彼らの助けと建設的な意見に対して、Benjamin Knowles、Yan Wei Lim、Andreas Haas、そしてViral Dark Matterコンソーシアムのメンバーに感謝します。この研究は、全米科学財団(DEB-1046413)の資金提供を受けており、Dimensions: Shedding Light on Viral Dark Matterプロジェクトの一部です。

<ol><li>Wommack, K. E., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virioplankton%3A+Viruses+in+Aquatic+Ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 69-114 (2000).</li>
<li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recoding+in+Bacteriophages%5BTitle%5D)+AND+%22Recoding%3A+Expansion+of+decoding+rules+enriches+gene+expression%22%5BJournal%5D)">Recoding in Bacteriophages.</a> Recoding: Expansion of decoding rules enriches gene expression. 24, 249-258 (2010).</li>
<li>Breitbart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+uncultured+marine+viral+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of uncultured marine viral communities.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (22), 14250-14255 (2002).</li>
<li>Breitbart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+population+structure+of+a+near-shore+marine-sediment+viral+community%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings.+Biological+sciences+%2F+The+Royal+Society%22%5BJournal%5D)">Diversity and population structure of a near-shore marine-sediment viral community.</a> Proceedings. Biological sciences / The Royal Society. 271 (1539), 565-574 (2004).</li>
<li>Dinsdale, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+metagenomic+profiling+of+nine+biomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional metagenomic profiling of nine biomes.</a> Nature. 452 (7187), 629-632 (2008).</li>
<li>Vega Thurber, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+analysis+indicates+that+stressors+induce+production+of+herpes-like+viruses+in+the+coral+Porites+compressa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Metagenomic analysis indicates that stressors induce production of herpes-like viruses in the coral Porites compressa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18413-18418 (2008).</li>
<li>Pedulla, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+highly+mosaic+mycobacteriophage+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Origins of highly mosaic mycobacteriophage genomes.</a> Cell. 113 (2), 171-182 (2003).</li>
<li>Calendar, R., Abedon, S. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCalendar%2C+R+%22The+bacteriophages%22">The bacteriophages</a>. , Oxford Univeresity Press. (2006).</li>
<li>Breitbart, M., Miyake, J. H., Rohwer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+distribution+of+nearly+identical+phage-encoded+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+microbiology+letters%22%5BJournal%5D)">Global distribution of nearly identical phage-encoded DNA sequences.</a> FEMS microbiology letters. 236 (2), 249-256 (2004).</li>
<li>Klenk, H. -P., Palm, P., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-Dependent+RNA+Polymerases+as+Phylogenetic+Marker+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Systematic+and+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">DNA-Dependent RNA Polymerases as Phylogenetic Marker Molecules.</a> Systematic and Applied Microbiology. 16 (4), 638-647 (1993).</li>
<li>Breitbart, M., Thompson, L., Suttle, C., Sullivan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+Vast+Diversity+of+Marine+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Oceanography%22%5BJournal%5D)">Exploring the Vast Diversity of Marine Viruses.</a> Oceanography. 20 (2), 135-139 (2007).</li>
<li>Mann, N. H., Cook, A., Millard, A., Bailey, S., Clokie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+ecosystems%3A+bacterial+photosynthesis+genes+in+a+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Marine ecosystems: bacterial photosynthesis genes in a virus.</a> Nature. 424 (6950), 741(2003).</li>
<li>Mann, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+S-PM2%2C+a+%E2%80%9Cphotosynthetic%E2%80%9D+T4-type+bacteriophage+that+infects+marine+Synechococcus+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bacteriology%22%5BJournal%5D)">The genome of S-PM2, a “photosynthetic” T4-type bacteriophage that infects marine Synechococcus strains.</a> Journal of bacteriology. 187 (9), 3188-3200 (2005).</li>
<li>Lindell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+photosynthesis+genes+to+and+from+Prochlorococcus+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transfer of photosynthesis genes to and from Prochlorococcus viruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11013-11018 (2004).</li>
<li>Millard, A., Clokie, M. R. J., Shub, D. A., Mann, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+organization+of+the+psbAD+region+in+phages+infecting+marine+Synechococcus+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetic organization of the psbAD region in phages infecting marine Synechococcus strains.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11007-11012 (2004).</li>
<li>Sullivan, M. B., Coleman, M. L., Weigele, P., Rohwer, F., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+Prochlorococcus+cyanophage+genomes%3A+signature+features+and+ecological+interpretations%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Three Prochlorococcus cyanophage genomes: signature features and ecological interpretations.</a> PLoS biology. 3 (5), e144(2005).</li>
<li>Rohwer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+genomic+sequence+of+the+marine+phage+Roseophage+SIOI+shares+homology+with+nonmarine+phages%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%22%5BJournal%5D)">The complete genomic sequence of the marine phage Roseophage SIOI shares homology with nonmarine phages.</a> Limnology and Oceanography. 45 (2), 408-418 (2000).</li>
<li>Miller, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+the+broad-host-range+vibriophage+KVP40%3A+comparative+genomics+of+a+T4-related+bacteriophage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bacteriology%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of the broad-host-range vibriophage KVP40: comparative genomics of a T4-related bacteriophage.</a> Journal of bacteriology. 185 (17), 5220-5233 (2003).</li>
<li>Thompson, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+auxiliary+metabolic+genes+and+the+redirection+of+cyanobacterial+host+carbon+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phage auxiliary metabolic genes and the redirection of cyanobacterial host carbon metabolism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), E757-E764 (2011).</li>
<li>Paterson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+coevolution+accelerates+molecular+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antagonistic coevolution accelerates molecular evolution.</a> Nature. 464 (7286), 275-278 (2010).</li>
<li>Seguritan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+neural+networks+trained+to+detect+viral+and+phage+structural+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+computational+biology%22%5BJournal%5D)">Artificial neural networks trained to detect viral and phage structural proteins.</a> PLoS computational biology. 8 (8), e1002657(2012).</li>
<li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+Medium+for+Enterobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Culture Medium for Enterobacteria.</a> Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).</li>
<li>Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+expression+of+the+P%28BAD%29+promoter+in+Escherichia+coli+by+constitutive+expression+of+the+low-affinity+high-capacity+AraE+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+%28Reading%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Homogeneous expression of the P(BAD) promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter.</a> Microbiology (Reading, England). 147 (Pt 2), 3241-3247 (2001).</li>
<li>Cuevas, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+genomic+gaps+using+phenotypic+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Elucidating genomic gaps using phenotypic profiles.</a> F1000Research. , (2014).</li>
<li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van’t Riet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+the+bacterial+growth+curve%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Modeling of the bacterial growth curve.</a> Applied and environmental microbiology. 56 (6), 1875-1881 (1990).</li>
<li>Venables, W. N., Smith, D. M. An introduction to R. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://cran.r-project.org/doc/manuals/R-intro.pdf">http://cran.r-project.org/doc/manuals/R-intro.pdf</a> (2014).</li>
<li>Schmieder, R., Lim, Y. W., Rohwer, F., Edwards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TagCleaner%3A+Identification+and+removal+of+tag+sequences+from+genomic+and+metagenomic+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TagCleaner: Identification and removal of tag sequences from genomic and metagenomic datasets.</a> BMC bioinformatics. 11, 341(2010).</li>
<li>Schmieder, R., Edwards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+and+preprocessing+of+metagenomic+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics+%28Oxford%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Quality control and preprocessing of metagenomic datasets.</a> Bioinformatics (Oxford, England). 27 (6), 863-864 (2011).</li>
<li>Schmieder, R., Edwards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+identification+and+removal+of+sequence+contamination+from+genomic+and+metagenomic+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Fast identification and removal of sequence contamination from genomic and metagenomic datasets.</a> PloS One. 6 (3), e17288(2011).</li>
<li>Welch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+parameters+to+control+synthetic+gene+expression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Design parameters to control synthetic gene expression in Escherichia coli.</a> PloS One. 4 (9), e7002(2009).</li>
<li>Fiehn, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+for+plant+metabolomics%3A+reporting+MSI-compliant+studies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Quality control for plant metabolomics: reporting MSI-compliant studies.</a> The Plant journal: for cell and molecular biology. 53 (4), 691-704 (2008).</li>
<li>Zeng, Q., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+viruses+exploit+their+host%E2%80%99s+two-component+regulatory+system+in+response+to+resource+limitation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Marine viruses exploit their host’s two-component regulatory system in response to resource limitation.</a> Current biology: CB. 22 (2), 124-128 (2012).</li>
<li>Shindy, W. W., Smith, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+plant+hormones+from+cotton+ovules%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Identification of plant hormones from cotton ovules.</a> Plant physiology. 55 (3), 550-554 (1975).</li>
<li>Lee, H. I., Leon, J., Raskin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+and+metabolism+of+salicylic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis and metabolism of salicylic acid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (10), 4076-4079 (1995).</li>
<li>Chappell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biochemistry+and+Molecular+Biology+of+Isoprenoid+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Biochemistry and Molecular Biology of Isoprenoid Metabolism.</a> Plant Physiology. 107 (1), 1-6 (1995).</li>
<li>Kitagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+set+of+ORF+clones+of+Escherichia+coli+ASKA+library+%28a+complete+set+of+E.+coli+K-12+ORF+archive%29%3A+unique+resources+for+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+research%3A+an+international+journal+for+rapid+publication+of+reports+on+genes+and+genomes%22%5BJournal%5D)">Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (a complete set of E. coli K-12 ORF archive): unique resources for biological research.</a> DNA research: an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes. 12 (5), 291-299 (2005).</li>
<li>Baran, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+footprinting+of+mutant+libraries+to+map+metabolite+utilization+to+genotype%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic footprinting of mutant libraries to map metabolite utilization to genotype.</a> ACS chemical biology. 8 (1), 189-199 (2013).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここでは、推定上のファージ遺伝子の機能解析のためのphenomicアプローチを提示します。技術は、監視ホスト同化代謝可能な開発されたアッセイを含む、マルチ表現型アッセイプレート（マップ）、異化代謝に効果を測定することができるメタボロミクスの確立された方法に加えて。我々は、高スループット処理および分析24を可能にする、これらの技術に起因する大規模なデータセットを管理するための追加のツールを提供しました。最後に、注釈付きファージキャプシドタンパク質、ファージチオレドキシン、2つの推定代謝ファージ遺伝子、平均実験的応答を比較して、我々は、表現型の傾向や異常値の識別の識別に重点を置いて、データセットと遺伝子クラスの両方を解釈する様々な戦略を提案します。 述べたように、両方のアプローチを定量宿主代謝の半分のみを測定します。のいずれかの相対的な機能を解釈するために、調査中の新規タンパク質は、両方の方法からのデータは、機能の証拠を提供する必要があります。これが私たちの現在の原稿の焦点では​​ありませんが、各phenomicメソッドからのデータ出力は、ランダム森林や主成分分析などのクラスタリング手法に焦点を当てコンビナトリアル分析を通して置かれます。また、複合解析から得られた仮説は、その後、伝統的な遺伝的方法によって検証されなければなりません。 最後に、提示される方法は、頻繁に細菌生理学の影響を受けているため、同じ基準に従います。どちらの方法を実施する場合、考慮事項がで実験している独立した、クローングループを確保するためになされる必要があります。汚染が防止されます。単一の変数をテストしています。および適切な制御を同時に実行されています。これらの点を考慮しないと、任意の生理学的アッセイと同様の不明瞭な結果をもたらすであろう。 マルチ表現型アッセイプレート（MAP）の MAPの開発は、（ 図5Aおよび表1,2）は、現在利用可能な技術と比較して高いスループットと適応性アッセイを提供します。アッセイは、消耗品、機器、およびすべての微生物学研究室で利用可能な基本的な技術を使用しています。その後のデータ処理および分析のための計算パイプライン、PMAnalyzer 24の組み込みは、迅速なデータ解釈を確保します。また、アプローチの実験と解析の両方の側面が容易に調整することができるか、またはカスタマイズされた目的のために調整。データの大部分は、セクション4で概説フィルタリングを通過しなかった場合、例えば、一方が手動で問題を識別するために成長曲線を取捨選択することができます。問題は厳しいフィルタパラメータに起因して生じる場合は、スクリプトの調整を行うことができます。あるいは、問題が実験的プロセスに関連付けられている場合（ すなわち、長期の縮合;不適切な細菌性セルの転送LSは、等）、追加の複製を容易に繰り返すことができます。 クエバスら 24に記載されているように、PMAnalyzerは凝集性、自動化されたパイプラインとして構文解析し、解析スクリプトを実行するラッパー·スクリプトとして記述された単一のbashのプログラムです。すべてのスクリプトは、3回のデータ全体の各時点で中央値をとることにより、25℃でのGitリポジトリから自由にアクセス可能であり、その後、遅れ時間を得るためにロジスティック曲線、最大増殖速度、漸近線、および新規の用語、成長レベルをパラメータ化。中央値を大きく外れ値の影響を低減するために我々の研究において、平均の上に選択された、しかし、スクリプトが容易に複製データの平均値を計算するように適合させることができます。原因レプリケート·データ全体に見られる減少変化（SE）（ 図2A）に、私たちはロジスティック曲線をフィッティングするためのPMAnalyzerにおける中央値の使用を維持しました。さらに、本研究では成長のためのカットオフ（GL≥0.4）はDETEましたデータは、成長レベルと最大増殖速度（ 図1A、B）を横切って分離する方法と比較することによってrmined。楽器とモデル·システムに応じて、この再定義がカットオフ値を必要とする、この用語は変更になる場合があります使用しました。 私たちの分析の主な利点は、我々は成長レベル（GL）として定義し、全体的な微生物の増殖を特徴付ける単一のパラメータを使用して表現型を比較す​​る機能です。 GLは調和平均であるため、データの大きな外れ値の影響を軽減します。成長の概要を提供するために、シフトロジスティック当てはめ値との調和平均を使用することは試行錯誤に到着しました。他の方法は、成長が含ま区別しようとした：それがかかった時間は、特定の曲線パラメータ（半μmaxを、μMAX、及び運搬能力）、決意（R 2）の係数、および特定の曲線パラメータを乗じたR 2の組み合わせに到達します。シフトと調和平均を使用してGLのためのロジスティックフィット値は、このように、それが選択の方法となり、成長を評価する際に最大の範囲を提供しました。注意すべき検討事項は、動的な成長曲線パターンは、単一のパラメータまたはフィットモデルを使用する場合に失われる可能性を有することです。例えば、ロジスティック曲線とGLの個々の曲線のパラメータは、二相の成長を表現することができません。単一の炭素の環境では、成長のこの効果は、基質利用中の基板やシフトのいずれかの変換にウイルスタンパク質の仲介を意味します。複数の成長パラメータを考慮していないときに、潜在的に失われた追加の効果は、次のとおりです。長期の遅れ時間を、ウイルスの機械や製品の負担増を提案。急速に、対数期の加速エネルギー産生経路をホストするように結合されたウイルスタンパク質を示唆しています。バイオマス形成のまたはより高いレベル、ホスト栄養摂取及び同化（データは示していない）におけるウイルスのサポートを意味します。したがって、（新生増殖曲線をプロット<stGLはクローンの全体的な成功を表すために、単一の定量的な数値を提供し、アカウントにロジスティックモデルの主要な変数をとるのに対し、栄&gt;図2A、B）は、時間の傾向に関する情報を提供します。 マップの構造および代謝遺伝子に寄与異なる応答を考慮するとき、それは、問題の異なる基板クラスがタンパク質機能の最大の証拠を提供することが観察されます。例えば、代謝性タンパク質は、多くの場合、中央代謝16,32をホストするために非特異的であり限定的な栄養素の買収に関連しています。 MAP予備実験は、中央代謝炭素源（ 図2A）上に成長した時、推定代謝ファージ遺伝子を保有するクローンが増加誘導期を有することを明らかにする。逆に、ホストのエネルギーとのdNTPプールの大きな割合を必要と推定される構造遺伝子を担持するクローンは、セントの成長に偽陽性応答をもたらしますRALおよびアミノ酸代謝の炭素基質。顕微鏡で観察されたように、これは（ 図2Aおよびデータは示さず）によるホストフィラメンテーションおよび/ ​​または封入体を生じる不溶性タンパク質の蓄積に起因する可能性が高いです。さらなる分析は、これらの予備的な結果を確認するために必要とされているが、MAPは、特異的ファージ遺伝子クラスの機能を仮定する相関表現型の応答を取得することが可能です。 未知のウイルスタンパク質の解明に加えて、MAPは、個々の細菌または細菌のコミュニティの機能および代謝の多様性を調査するための新規な資源です。 MAP成分が細菌の範囲の成長をサポートするために容易に改変するために設計されています。海洋、栄養要求性、及び嫌気性微生物を含みます。異なる細菌属は、マップでサポートすることができる前に、これらの取り組みを促進するために定義された基礎および前増殖培地は、追加または調整された化学種を必要とします。MAPのこの使用中のノートには、トリプトン、酵母エキス、ペプトンなどの成分の使用を禁止する、定義されたメディアを維持することです。 メタボロミクスメタボロミクスの分野は、質量分析により同定し単離した代謝産物を含む代謝物データベースに依存します。ここで選択した中核施設では最大のメタボロミクスのいずれかのデータベースを持っています。他の人が前に私たちのホストに記録されていなかったしながら興味深いことに、我々の実験法から得られた代謝物の半分以上は、（〜65％）識別不能であった、 大腸菌は、（例としては、インドール3酢酸33、サリチル酸34、及びジヒドロ酸を35）。この事実は、植物代謝物、または調査中の特定のタンパク質に向けたデータベースの強いバイアスのいずれかに起因する可能性があります。それにもかかわらず、結果は、データ表現および分析のために利用可能な既知の代謝物の、限られた数です。府でトゥーレ、各種データベースを使用して複数のメタボロミクス法が大きく代謝産物のカバレッジを可能にするであろう。 本発明の新規なウイルスタンパク質を比較し、対比するとき現在、既知および未知の両方の代謝産物が使用されます。このアプローチを使用して、我々は機能的に類似のタンパク質を保有するクローンは、完全なメタボロームプロファイルで増加した類似性を共有すると仮定しました。予備メタボロミクス分析は、構造と代謝遺伝子は明らかに互いから分離しないしながら（ 図6）を関連付けるか過剰発現された場合、それらの遺伝子は、ホスト上の同様の効果を発揮することが明らかになりました。例えば、本研究では、EDT2440とEDT2441で強調表示、推定代謝遺伝子と密接にキャプシド遺伝子クラスターを注釈付き。公的に利用可能な膜貫通トポロジーおよびシグナルペプチド予測プログラムを用いて調査の両方の推定上の代謝遺伝子は、単一の膜貫通ドメインを保有証拠を示しました。興味深いことに5番目のうち最初のクラスター·グループ（系統樹の最も左側の部分）で電子9クローンは、同じトポロジのプログラムを使用して、膜貫通ドメインを予測しています。さらなる調査が必要である、しかし、それは、これらのクローンの過剰発現の間に存在する代謝物が膜または構造負荷に起因する細胞ストレス応答と関連している可能性があります。この証拠は、メタボロミクスのデータは、ノイズの増加量を有しているが、この方法は、遺伝子のクラス内および間の両方、遺伝子の一般的な効果を区別する信号を強調することが可能であることを支持しています。この方法は、遺伝子機能の具体的な情報を抽出することができるかどうかを判断するには、代謝産物は、特定の代謝経路に分類しました。クローンは、単一の経路に特異的な代謝物に影響を与える場合である仮説は、その後、過剰発現した遺伝子は、その経路において活性です。私たちのメタボロミクスの品質保証·パイプラインの確立に先立って、予備データは、上にいることを明らかにしました過小評価D代謝産物は、それらが関連付けられている経路にほとんど情報を提供し、典型的には、「不明」であった（データは示さず）。前処理されたメタボロミクスデータは、しかし、代謝産物プロファイルの大部分が類似しており、唯一の未知および既知の代謝産物の存在量の選択された数は、インスタンスプトレシンおよびウラシル（ 図6）のために、クローン間で異なることが明らかになりました。タンパク質機能の努力のより高い解像度を提供するために、実験的に機能的な特徴付けをベース代謝産物の「穴」を埋めるために使用することができる公知のファージ遺伝子、ファージに対する新規遺伝子を比較するために行われています。この技術を使用して、既知のウイルス遺伝子の割り当てられた機能は、未知の遺伝子の機能のためのリファレンスを提供します。それにもかかわらず、メタボローム解析の制限要因は、データベースのサイズと関連性があります。これらの制限を補正するために、本研究に関係づけメタボロミクスのデータベースを開発する必要があります。そのようなEのASKAコレクションに特定の代謝物のデータベースとその存在量として大腸菌クローンは、1つのORFは、36を過剰発現されます。 Lawerenceバークレー国立研究所の研究者がモデル細菌37の全体の変異体のライブラリーに特有の代謝物の最初の包括的なデータベースをコンパイルした場合、データベースの必要性の証拠は、2013年に提供されました。本研究では、表現型と遺伝子型との間に明確な接続を明らかに、特定の代謝産物の利用のために必要な遺伝子に新たな洞察を提供しました。 ツールとしてメタボロミクスを考えると、それは、処理体制は中核施設で追跡定義することが重要です。ほとんどの実験手順のアーティファクトは、使用の機器に関連する日々の分散です。現在までに、すべてのGC-MS分析は、各分析の実行に含まれる内部標準の使用を実装しています。しかし、プロジェクト固有の内部のサンプルの追加&lt;/ em&gt;の実験のそれぞれの日には、追加の分散を削除しました。これらの考慮事項は、正規化の問題とバイアスを回避するために、早期に対処する必要があります。別の解決策は、同じマシン上の中核施設で、かつ単一のバッチ、任意の中核施設で利用可能なオプションとして、すべてのサンプルを処理することです。 この原稿に導入され、再調査し、両方のさまざまなツールは、新規の提供、機能未知のファージ遺伝子をスクリーニングし、特徴づけることを意味します。計算パイプラインの流線用いた実験手法の単純さと適応性は、これらの方法は、研究努力と幅広い分野に適用可能である保証します。私たちの目標は、ここに提示phenomicアプローチも同様に機能的に定義されていませんシステムに加えて、新規のファージタンパク質のさらなる研究を支援することです。

（バクテリオファージまたはファージ別名）細菌に感染するウイルスは、世界的に粒子（VLP）のように10以上31ウイルスに存在すると推定し、環境1,2内の他のすべての生物を上回っています。海洋環境に関連したウイルスのコミュニティを調査する最初のメタゲノム研究では、ウイルス画分3内に見られる多様性を定量化することに焦点を当てました。さらに、Breitbartらは、ウイルスコミュニティ配列の65％以上が公共のデータベースで利用可能な任意の配列と相同性を共有していないことがわかりました。その後のメタゲノム研究では、同様の証拠を発見した：サンディエゴの海洋堆積物からmetagenomes、カリフォルニア州は、4、75％の未知のウイルス配列が含まれています。ソルトン湖の過塩性の湖からmetagenomesは98％で、未知のウイルス配列5が含まれています。 98％の未知のウイルス配列6 -やサンゴ関連metagenomesは、95が含まれています。注釈のないこのような情報の蓄積がもたらしました7「生物学的宇宙の暗黒物質」であるファージの遺伝物質。 ファージのゲノムの特徴付けは、既存の核酸とタンパク質データベースとの比較を通して配列類似性を特定することに依存しています。ファージにコードされた遺伝情報は、主に不明であるため、相同性に基づく方法は効果がありません。転写及び複製遺伝子、代謝遺伝子、構造遺伝子：そのゲノム内に、ファージは、典型的には3つの主要な遺伝子型をコードします。転写および複製遺伝子（クラスI / II遺伝子8）ポリメラーゼ、プライマーゼ、エンド/エキソヌクレアーゼ、およびキナーゼを含みます。これらの遺伝子は、高度に転写し、ファージの遺伝物質を複製、ファージ感染におけるその重要性のために保存されています。ファージポリメラーゼは、容易に、それらの地球環境保全9に、従来の配列相同性の方法を用いて同定され、系統学的マーカーとして有効で10を提供するために示されています。これとは対照的に、ファージ代謝および構造遺伝子（クラスII / III遺伝子8）は 、ますます発散、しばしば架空の遺伝子として注釈されています。 ファージ代謝遺伝子は、宿主の代謝能力に影響を与え、必ずしもウイルスの複製に必要とされていません。これらの遺伝子は、多くの場合、補助代謝遺伝子11（AMGs）と呼ばれる、ホストの代謝を調節し、成熟ビリオンの感染及び成功の最適な進行を可能にするように思われます。 AMGsは栄養素を制限する利用及び取り込みまたはエネルギー産生経路に関連しています。いくつかの例は、種々の12-16シアノファージのゲノム中に見出さ光化学遺伝子、遺伝子に連結され、リン酸代謝17,18、およびファージのdNTP生合成18,19用のペントースリン酸経路の利用により調節が挙げられます。比較では、構造遺伝子は、感染中に生成後期遺伝子中旬の間であり、異なるファージ浩にわたって変化しますSTシステム。構造タンパク質の生産は、それらの転写、翻訳、およびアセンブリ8のためのウイルスのdNTP、およびエネルギー·プールの可用性に依存しています。カプシドと尾部繊維構造タンパク質は、すべてのウイルスタンパク質をコードする遺伝子の最も発散とみなされ、成功したビリオン産生のために必要とされます。その発散は、通常、彼らは、ウイルス-宿主共進化20の形成に果たして積極的な役割に起因します。伝統的な相同性および配列アラインメント技術を使用した場合発散タンパク質は関係なく、遺伝子クラスの、容易に見過ごされています。厳密な配列比較で見られる制限を補正するための努力は、人工ニューラルネット21との関連付けを決定するために、配列の特徴を使用することが可能なバイオインフォマティクスツールをもたらしました。人工ニューラルネット（のANN）の構造および代謝遺伝子の予測を可能にする、しかし、直接特徴づけるために、下流の実験的検証が必要遺伝子機能。 本稿の目的は、新規なファージ遺伝子の発現の間に宿主細菌の両方の異化と同化代謝を監視することができるphenomicプロトコルを提供することで、機能のANNを通じて予測しました。フェノミクスの分野では、細胞表現型に関連する生物学は、十分に不明または多面的な機能を有するタンパク質の研究を支援するためにシステム生物学で確立されています。 Phenomicツールは、遺伝子型情報に表現型情報をリンクするために使用されています。我々は、その機能（複数可）は、ファージ遺伝子発現時に宿主の生理学的効果を観察することによって決定することができる推定上のファージ遺伝子を仮定しました。この仮説を調べるために、2つの定量的な方法を選択しました。メタボロミクスは、特定の環境で成長中のホスト代謝産物の多様性と相対的な存在量を測定しながら、複数の表現型アッセイプレート（マップ）がホスト基質利用およびその後のバイオマス形成をモニターするために使用しました。精神状態。推定上の構造および代謝タンパク質が大腸菌内で過剰発現し、両実験からの代表的な結果が比較されます。多数の視覚技術および高スループット処理パイプラインは、実験の複製を容易にするために提示されています。最後に、提示される方法の再現性と精度は、注釈付きのキャプシドタンパク質およびファージ代謝タンパク質、チオレドキシン、プラス2つの推定AMGsの予想生理学的効果との関連で議論されています。

<table><tbody><tr><td>0.22 以上m Sterivex Filter</td><td>Fisher Scientific</td><td>SVGP01050</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>0.22 & マイクロ;m Millex Filters</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLGV033RS</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>0.22 & micro;m SteriCap</td>フィルター<td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>SCGPS02RE</td><td>ミリポア</td></tr><tr><td>0.22&micro;m オムニポア メンブレン フィルター</td><td>ミリポア</td><td>JHWP02500</td><td>ミリポア</td></tr><tr><td>96 ウェル マイクロタイター プレート</td><td>VWR</td><td>82050-764</td><td>標準 F-ボトム 96 ウェル マイクロプレート</td></tr><tr><td>2 ml 96 ウェル プレート</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td><td></td><td></td></tr>ック <tr><td>接着シール プレート フィルム</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>Z369667</td><td></td></tr><tr><td>2 L ナルゲン スクエア ボトル</td><td>コール パーマー</td><td>T-06040-70</td><td></td></tr><tr><td>125 ml Nalgene スクエア ボトル</td><td>コール パーマー</td><td>T-06040-50</td><td></td></tr><tr><td>1/4 インチパネルマウントロックナット、ブラックナイロン</td><td>コールパー</td><td>マーEW-45509-04</td><td></td></tr><tr><td>メスルアースレッドスタイルのパネルマウント、200シリーズバーブ、1/16インチ</td><td>コールパー</td><td>マーEW-45500-30</td><td></td></tr><tr><td>メスルアースレッドスタイルパネルマウント、200シリーズバーブ、1/8インチ</td><td>コールパー</td><td>マーEW-45500-34</td><td></td></tr><tr><td>オスルアー一体型ロックリング-500シリーズバーブ、1/16インチIDチューブ</td><td>コール・パーマー</td><td>EW-45505-31</td><td></td></tr><tr><td>ロックリング付きオス・ルアー x メス・ルアー・カプラー</td><td>コール・パーマー</td><td>T-45508-80</td><td></td></tr><tr><td>有刺鉄線バルクヘッド継手、1/4インチOD</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>6149-0002</td><td></td></tr><tr><td>サニピュアチューブ、1/16 インチID x 1/8 インチ外径</td><td>SaniPure</td><td>AR400002</td><td></td></tr><tr><td>Sanipureチューブ、1/4インチ外径 x 1/8 インチID</td><td>SaniPure</td><td>AR400007</td><td></td></tr><tr><td>可変流量ミニポンプ(蠕動ポンプ)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-876-1</td><td></td></tr><tr><td>マグネチックスターラー</td><td>ベルプサイエンティフィカ</td><td>F203A0160</td><td></td></tr><tr><td>フォーセプス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-512-141</td><td>ミリポア*フィルター</td></tr><tr><td>マルチプレート分光光度計 プレートリーダー</td><td>モレキュラーデバイスアナリスト GT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フィルターマニホールド</td><td>Fisher Scientific</td><td>XX10 025 02</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software:</td></tr><tr><td>Python version 2.7.5</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.python.org/" target="_blank">http://www.python.org/</a</td></tr><tr><td>>PyLab module</td><td></td><td></td><td><a href="http://wiki.scipy.org/PyLab" target="_blank">http://wiki.scipy.org/PyLab</A></td></tr><tr><td>R バージョン 3.0.1</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.r-project.org/" target="_blank">http://www.r-project.org/</a></td></tr><tr><td>reshape2 library</td><td></td><td></td><td><a href="http://had.co.nz/reshape" target="_blank">http://had.co.nz/reshape</a></td></tr><tr><td>ggplot2 library</td><td></td><td></td><td><a href="http://ggplot2.org/" target="_blank">http://ggplot2.org/</a</td></tr><tr><td>>Gene Composer</td><td>PSI Tech Portal</td><td></td><td><a href="http://www.genecomposer.net" target="_blank">http://www.genecomposer.net</a></td></tr><tr><td colspan="4">Services:</td></tr><tr><td>西海岸メタボロミクスセンター</td><td>UCデービス</td><td></td><td>校<a href="http://metabolomics.ucdavis.edu/" target="_blank">http://metabolomics.ucdavis.edu</a></td></tr><tr><td>DNA 2.0</td><td></td><td></td><td><a href="https://www.dna20.com" target="_blank">https://www.dna20.com</a></td></tr></tbody></table>

ファージフェノミクス：小説のウイルスタンパク質を特徴づけるために、生理的アプローチ

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

ファージ - 宿主相互作用への電流の研究は、（メタ）ゲノムから知識を外挿することに依存しています。興味深いことに、60 - すべてのファージ配列の95％が現在の注釈付きタンパク質に相同性を共有しません。その結果、ファージ遺伝子の大部分は、仮定としてアノテートされています。この現実は頻繁に両方の構造および補助代謝遺伝子の注釈に影響を与えます。ここでは、これらの未知のファージ遺伝子のいずれの発現時に選択された宿主の生理学的応答（複数可）を捕捉するように設計phenomic方法を提示します。メタボロミクスは、代謝物質の存在量および多様性を監視することにより、副生成物の分析を提供しながら、複数の表現型アッセイプレート（マップ）が、ホスト基質利用およびその後のバイオマス形成の多様性を監視するために使用されます。両方のツールは、単一の推定上のファージのオープンリーディングフレーム（ORF）の発現に関連する表現型のプロファイルを提供するために同時に使用されます。両方の方法のための代表的な結果を、highl比較します推定上の構造的または代謝ファージ遺伝子のいずれかを有する宿主の表現型プロファイルの違いをighting。また、実験的な分析を容易に可視化技術と高スループットの計算パイプラインが提示されています。

ここでは、推定ファージ遺伝子の機能的特徴付けのための現象的アプローチを提示します。技術には、宿主の同化代謝を監視できる開発されたアッセイ、マルチ表現型アッセイプレート(MAP)、確立されたメタボロミクスの方法に加えて、異化代謝への影響を測定することができます。

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

本実験の全般的な目的は、機能未知のファージ遺伝子をスクリーニングし、その特性を解析することです。まず、ファージ由来の推定ウイルスオープンリーディングフレーム（ORF）をE. coliで発現させます。ファージOrffを発現するE. coliのクローンを、培地と各種基質を含むマルチフェノタイプアッセイプレートまたはマップに接種します。次に、分析の第2の手法として、分光光度計を用いて細菌の増殖を経時的にモニタリングします。ファージ遺伝子を発現するE. coliは、連続培養または逐次バッチ培養のいずれかで育成します。得られた増殖代謝物を回収し、ガスクロマトグラフィー飛行時間型質量分析法によるメタボローム解析に供します。得られたデータは、単一の推定ファージオープンリーディングフレームの発現に関連する表現型プロファイルを提供します。この手法は、当初、未知のウイルスタンパク質の機能を解明するために開発されました。本手法は、遺伝子型と表現型の関連性を調べる研究や、バイオーム間における細菌、ファージ、および宿主の相互作用の解析にも適用可能です。まず、滅菌済みの96ウェルマイクロタイタープレートに、E. coliクローンの識別番号と、アッセイでテストする基質を示すマップスキマティックタイプを記入します。その後、滅菌水をリキッドリザーバーに無菌的に移します。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、マイクロタイタープレートの各ウェルに 60 µL の水を分注します。続いて、3X basal medium を無菌的にリキッドリザーバーに移します。その後、マルチチャンネルピペットを用いて、マイクロタイタープレートの各ウェルに 50 µL ずつ分注します。同じ手法を用いて、マップの概略図で使用されている各基礎培地を50 µLずつ分注します。次に、各基質を適切なウェルに30 µLずつ転送します。その後、マルチチャンネルピペッターを使用して、各ウェルに細菌細胞を10 µLずつ転送します。培養ストックにピペットを戻す前に、必ずチップを交換してください。各プレートを粘着プレートフィルムで覆います。プレートのウェルの上と縁に沿ってフィルムをしっかりと押し付け、均一に密閉してください。滅菌済みのカミソリを用いて、マイクロタイタープレートの端にある余分なフィルムを取り除きます。準備したマップをマルチプレート分光光度計の投入スリーブにセットします。プレートリーダーのソフトウェアを起動し、30分ごとに吸光度を測定し、計32時間にわたって測定を行うプロトコルを作成します。リード間に60秒間の振盪を挟み、装置の温度を37°Cに設定します。マップが設定温度に平衡状態に達したら、32時間後にプロトコルを開始し、プレートリーダーの出力スリーブからマップを取り出します。各データファイルに、e coone識別番号、日付、およびマップの概略図タイプを記載してください。付属文書に記載されている通りにデータを解析し、増殖および生物学的に関連のある増殖を評価します。代謝物分析のパラメータから、細胞は連続継代または継代バッチ培養のいずれかで培養されている可能性があります。定常状態を維持するためです。ここでは、連続培養について実演します。付属の文書に従い、75 mLの連続培養リアクターの構成部品と2 Lのフィードボトルを滅菌します。滅菌後、オートクレーブ済みのすべての資材をバイオセーフティキャビネット内に置き、培地が冷却されるまで紫外線灯を点灯させます。培地が冷却されたら、0.1% L-アラビノースと100 µg/mLを添加します。0.5 XLB 液体培地 75 milliliters にアンピシリンを加え、連続培養装置に移します。連続培養装置のキャップの包装を解き、装置にねじ込んで固定します。サンプリングチューブに触れないように注意しながら、供給ボトルのキャップの包装を解き、供給ボトルにねじ込んで固定します。サンプリングチューブに触れないようにし、ポートepsilonに接続された18 inchのチューブの無菌状態を維持します。18 inchのチューブとペリスタルティックポンプ用チューブの包装を解きます。18 inchのチューブの一端をペリスタルティックポンプ用チューブアダプターの一端に接続し、ペリスタルティックポンプ用チューブアダプターのもう一端を18 inchのチューブに接続します。フィーディングボトルキャップのポートepsilonに接続し、連続培養リアクターのポートbetaおよびdeltaに0.22 µmフィルターユニットを取り付けます。ポートalphaのアダプターに0.22 µmフィルターユニットを取り付けます。さらに、バイオセーフティフード内で18インチのチューブをそれに接続します。付属のドキュメントに従って調製したE. coliのオーバーナイト培養液100 µLを、連続培養リアクターに接種します。リアクターと供給ボトルの蓋をしっかりと締め、システムを37 °Cのインキュベーターに移動させます。マグネチックスターラーと小型ペリスタルティックポンプを備え、ペリスタルティックポンプのチューブアダプターをポンプに取り付けます。供給ボトルからのチューブをポンプに通し、リアクターへと繋ぎます。ポンプの設定を「fast」にし、開始させます。「forward」に切り替えて、チューブ内を培地が流れ始めていることを確認してください。リアクターをマグネティックスターラー上に設置し、撹拌を開始します。翌日のサンプリングまで、連続培養リアクターを24時間平衡化させます。連続培養液をサンプリングするには、5 mLのルアーロックシリンジをポートγに取り付け、4.5 mLの培養液を採取します。培養液500 µLを用いて、600 nmにおける光学密度を測定します。次に、残りの分注液を用いて、OD 600を0.35とした1 mLの培養液を4つ作成し、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析（GC-TOFMS）のサンプル調製のために1.7 mLのマイクロ遠心チューブに移します。細胞を16,900 ×gで2分間遠心分離し、ペレット化させます。遠心分離後の上清を除去し、500 µLのPBSで洗浄します。この洗浄工程を2回繰り返し、最後に上清を除去した後、細胞ペレットの入ったマイクロ遠心チューブを液体窒素に浸します。気泡が出なくなるまで、サンプルを-80 °Cのフリーザーで保存します。すべてのサンプルの回収後、4日間にわたり12時間ごとにサンプリングを繰り返します。クローンあたり3つのサンプルをドライアイスでメタボロミクス・コアファシリティに送付し、サンプルの処理、分析、およびGC-MSの標準化を行い、ウイルスのオープンリーディングフレームを解析します。スターバック島および南ライン諸島のキャロラインAOLにおいて、サンゴ境界層下から海水を採取した。47種類のクローンについて、72種類の炭素源特異的条件下での細菌増殖をMAPsを用いて評価した。得られたデータに基づき、各クローンを「期待通りの増殖」、「機能獲得」、「機能喪失」、「増殖なし」の表現型に分類した。機能的に類似したタンパク質を保持するクローンが、同様のメタボロミクスプロファイルを持つという仮説を検証しました。連続培養で育成した84種類のクローンのメタボライト存在量の中央値をGC TOF msで測定しました。得られたデータを用いて、相対的なメタボライト存在量（色で表示）に基づいたクローンの階層的クラスタリングを行いました。最も豊富に存在する代謝物は赤色で、最も存在量が少ないものは濃い青色で示されています。予備的なメタボロミクス解析により、構造遺伝子と代謝遺伝子は互いに明確に分離していない一方で、宿主に対して同様の効果を示す遺伝子同士は相関していることが明らかになりました。例えば、アノテーションされたカプシド遺伝子は、本研究で強調した推定代謝遺伝子EDT 24 40およびEDT 24 41と密接にクラスターを形成しています。公開されている膜貫通トポロジーおよびシグナルペプチド予測プログラムを用いた調査により、これら両方の推定代謝遺伝子が単一の膜貫通ドメインを有している根拠が示されました。興味深いことに、第1クラスター群の9つのクローンのうち5つが、同一のトポロジーを用いて膜貫通ドメインを持つと予測されました。以上のデータから、本手法によってクローンの代謝物プロファイル、機能が関連している可能性のあるクローン、および代謝物の外れ値に関する情報を得られることが示されました。なお、この手順を試みる際は、提示された手法が細菌の生理学的状態に強く影響されることを念頭に置くことが重要です。クローナルに独立したグループを用いて実験が行われ、コンタミネーションが防止され、適切なコントロールを用いて単一の変数が検証されるように考慮する必要があります。

phage-phenomics-physiological-approaches-to-characterize-novel-viral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

単一のウイルスゲノム（SVG）は、単一のビリオンのゲノムを分離して増幅する方法である。混合された集合体のウイルス懸濁することにより、ビリオンを捕捉し、下流の処理中にゲノムせん断を低減、アガロースを含む個別のウェルを有する顕微鏡スライド上にフローサイトメトリーを用いてソートされる。全ゲノム増幅は、配列決定のために適しているゲノム材料をもたらす複数の置換増幅（MDA）を用いて達成される。...

&#39;シングルウイルスゲノミクス&#39;を使用してシングルビリオンの単離とゲノム解析

無細胞転写・翻訳プラットフォームの新世代は、生化学システムの in vitro遺伝子回路の実行を構築するために設計されています。この記事で私たちはすべて大腸菌無細胞 TXTL システムを使用して彼らのゲノムからのバクテリオファージ MS2、ΦΧ174、T7...

大腸菌の伝染性のバクテリオファージの合成による無細胞発現系

このプロトコルの目標は、具体的にはタグし、関連付けられているウイルスのゲノムのタンパク質のキャラクタリゼーションのため感染細胞からウイルス DNA...

関連付けられているウイルスおよび細胞タンパク質の同定のウイルス DNA の精製

説明されているプロトコルは、建設、特性および DNA の任意のソースから作られた"domainome"ライブラリの (好みのターゲット) に対して選択を許可します。さまざまな技術を組み合わせた研究パイプラインにより、これ: バクテリオファージの表示、折りたたみ記者とシークエンサー データ解析のための web...

インタラクトーム Seq: Domainome ライブラリーの構築、検証およびバクテリオファージの表示と次世代シーケンシングによる選択のプロトコル

このプロトコルにより、宿主に対するプロファージの影響を明らかにすることができます。細菌培養は、溶解原性状態を最もよくサポートする条件を使用して同期され、自発的な誘導が制限されます。RT-qPCRは、増殖抑制遺伝子およびファージ制御から切り離された遺伝子を、溶解性複製サイクル中に発現する遺伝子と明確に区別します。...

トランスクリプトミクスによる温帯バクテリオファージの溶解原体への影響の理解

放線菌および他の成長の遅い細菌に適した、バクテリオファージの存在下での長期的な細菌増殖を定量化するための光学密度ベースのマイクロプレート法が記載されている。この方法には、蒸発と蓋の結露を減らすための変更と、曲線下面積、最大成長、相対病原性などのウイルス感染メトリックを計算するためのRコードが含まれています。...

アクチノバクテリオファージ感染の特性評価に適応した光学密度ベースのマイクロプレートアッセイ(英語)

細菌に感染するウイルスであるバクテリオファージ(ファージ)は、腸内細菌叢の不可欠な構成要素です。これらの共生生物は細菌の適応度と個体群動態を促進しますが、腸の恒常性や疾患にどのような影響を与えるかについてはほとんどわかっていません。このプロトコルは他のバクテリオファージ細菌の組に適応可能なマウス...

マウス腸におけるT4バクテリオファージと 大腸菌 の相互作用:宿主-バクテリオファージ動態をIn vivoで研究するためのプロトタイプモデル

ここでは、デュアルレポーターフローサイトメトリーシステムを使用して、アンジオテンシン変換酵素-2結合磁気マイクロスフェアによって捕捉された無傷の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)ウイルス粒子上の2つのユニークなスパイクタンパク質エピトープを同時に検出する、新たに開発されたマルチプレックス蛍光免疫測定法について説明します。...

マルチプレックスデュアルレポーター法によるウイルス粒子上の表面タンパク質エピトープのプロファイリング

ここでは、シアノファージ(およびその宿主)を単離するための海洋および淡水生態系のユーフォティックゾーンからのサンプリング方法と、単一の遺伝子型を濃縮し、ウイルスと宿主の相互作用ダイナミクスを特徴付けるサンプリング後のプロセスについて説明します。...

光合成微生物とそのウイルスの環境サンプリング:フィールドからラボまで

Virochipは同時に保存された配列の相同性に基づいてすべての既知のウイルスだけでなく、新たなウイルスを検出するように設計されたパンウ​​イルスマイクロアレイです。ここでは、既知および未知のウイルスの存在のために臨床サンプルを解析するVirochipアッセイを実行する方法を示しています。...

ウイルス性病原体のために臨床サンプルをスクリーニングするためにパンウイルスマイクロアレイアッセイ（Virochip）を使用して、

学ぶファージ遺伝子の機能解析法。大腸菌でウイルスORFを発現させ、マルチフェノタイプアッセイプレートとガスクロマトグラフィー・質量分析を用いて代謝変化を評価し、細菌とファージの相互作用を解明します。

ファージフェノミクス：小説のウイルスタンパク質を特徴づけるために、生理的アプローチ

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