Name: in vitroおよびin vivoモデルでは血管壁の下でフローの状況に細菌付着を研究するために、 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 学ぶ 細菌の血管内皮細胞への接着メカニズムを、in vitroフローチャンバーとin vivo腸間膜灌流モデルを用いて、Staphylococcus aureusを蛍光標識してリアルタイム可視化する方法で解明します。

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この作品は、フォンVOOR Wetenschappelijk Onderzoe​​k（FWO）ブラーンデレンG0466.10、11I0113Nによってサポートされていました。小児循環器、UZルーヴェン、ベルギーのための「エディ·メルクス研究助成」と「Sporta研究グラント」（JC）。分子および血管生物学のためのセンターは、ルーベン大学の「Geconcentreerde Onderzoe​​ksacties」（GOA 13分の2009）とベーリンガーインゲルハイムからの研究助成金によって、Programmafinanciering KUルーベン（PF / 10/014）でサポートされています。

動物実験は、ルーヴェンカトリック大学の倫理委員会によって承認されました。 インビトロ灌流およびin vivo実験 1.準備細菌<ol><li>我々はSを使用しましたこの原稿に記載されているすべての実験のための黄色ブドウ球菌株ニューマン。S.黄色ブドウ球菌 Newmanのを-80℃で10％グリセロールにブレインハートインフュージョン（BHI）中に保存しました。 </li><li> （3 OD 600&gt;）、37℃でO / N凍結細菌を掻き落としおよび5に接種するために滅菌ループを使用mlのトリプシン大豆ブロス（TSB）。 </li><li>遠心分離によって細菌を洗浄し（2600グラム、室温、5分）、5mlのPBS（リン酸緩衝生理食塩水）中に細菌ペレットを再懸濁します。 </li><li>エタノール中の5（6） - カルボキシフルオレセインN-ヒドロキシエステル（カルボキシ - フルオレセイン）の1 mg / mlの溶液を調製します。実験室グレードの水で150μgの/ mlに1 mg / mlのカルボキシフルオレセイン溶液（ 例えば、ミリQ水）で希釈します。光からチューブを守ります-20℃でアルミ箔とストアと。 </li><li> （2,600×gで、室温、5分）細菌を遠心します。 800μlのPBS中に細菌ペレットを再懸濁し、200μlまたは150 / mlのカルボキシ-フルオレセイン溶液を400μl（最終濃度in vivo実験のために50μg/ mlの）（灌流実験のための30μg/ mlの最終濃度）を追加します。アルミホイルで光からチューブを保護し、シェーカー上で室温で30分間インキュベートします。 </li><li>標識後、PBS中に6％のウシ血清アルブミン（BSA）溶液でブロック。 </li><li>光学密度測定を用いて細菌（OD）、OD in vitro実験のための0.65の600を希釈し（とOD インビボ実験のための1.8の600（約3×10 8コロニー形成単位（CFU） 黄色ブドウ球菌用/ mlに相当します） PBS中の黄色ブドウ球菌では約1×10 9 CFU / mlの）に対応します。アルミホイルで光からチューブを保護し、氷の上に残します。 </li></ol> 2. インビトロ灌流実験<ol><li>ガラスカバースリップのコーティング<ol><li>実験室グレードの水でフォン·ヴィレブランド因子（VWF）（Haemate P、ストック濃度2,400μgの/ ml）に希釈し、50μg/ mlの最終濃度まで（蒸留脱イオン）。 </li><li> 160 / mlの最終濃度まで（製造業者によって供給されるSKF液、pHを2.7から2.9）、等張グルコース溶液中のコラーゲンを希釈。 </li><li>パラフィルム上のコーティングの200μLを滴下し、液滴の上にカバースリップを置くことにより、VWFまたはコラーゲンでコートしたカバーガラス（24×50ミリメートル）。液滴は、カバーガラスの表面に沿って拡散します。 </li><li>室温で4時間、加湿容器にカバースリップをインキュベートします。慎重に鈍い針でパラフィルムからカバーグラスを持ち上げます。フローチャンバーの底部にカバースリップをマウントします。 </li></ol></li><li>プラスチックのコーティングは、内皮細胞でスリップ<ol><li>コー​​トプラスチックスリップPBS中の1％ゼラチン溶液1ml（1ウェルPCA細胞培養チャンバー、ザルスタット、ドイツ）を、37℃で30分間インキュベートします。ゼラチンコーティングされたプラスチック製のスリップ上シードヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）および70〜80％の密集度にそれらを成長させます。フローチャンバーの底部にあるプラスチック製のスリップをマウントします。 </li></ol></li><li>かん流実験 注： インビトロ灌流モデルの概略図を図1に示されています。 <ol><li>異なる生理学的流れの条件をシミュレートするために2.5ダイン/ cm 2で20ダイン/ cm 2の間に層状剪断応力でマイクロ平行プレートフローチャンバーインビトロ細菌付着試験を行います。 </li><li>フローチャンバー（社内の設計）は、金属フレーム及びプレキシガラスで作られた灌流チャンバー（ポリ（メチル）メタクリレート（PMMA））からなります。高精度の注入ポンプ（PHD 2000輸液、ハーバード装置、USA）に接続することによって、我々は、RAの流れを生成することができ0.0001マイクロリットル/分、220.82ミリリットル/分のTES。 </li><li>フローチャンバーの上部にチューブを接続し、チューブに培地を注入します。静かに底部の上にフローチャンバの上部に配置し、フローチャンバーを組み立てます。気泡がないように注意してください。室内に漏れていないことを確認すると、過剰な塗布液を除去するために、チャンバを通って培地1mlを注入します。気泡を避けます。 </li><li>顕微鏡トレイに37℃の熱制御加熱パッドの上にマウスを置きます。これは、端末の手順であるため、厳密な無菌の手順は必要ありません。頸静脈の近くの切開を行い、そっと子宮頸部筋肉の右側を削除し、周囲の組織から頸静脈を分離します。 </li><li>輸液ポンプや蛍光顕微鏡を設定します。輸液ポンプの設定は、シリンジの直径と所望の流量（2.4節を参照）に依存しています。これからは、暗い部屋で働いています。 </li><li> VWFコーティング： <ol><li>蛍光標識された細菌と注射器を記入し、入口管に接続します。気泡を避けます。 10分間の注入ポンプを起動します。注入時間は、使用されるせん断速度およびコーティング、細菌やメディアに依存し、密着性の安定した状態を表している必要があります。 </li><li> 10分後、導入管にPBSで注射器を接続し、輸液ポンプを起動して、非結合細菌を洗い流します。 </li><li>洗浄工程の後に異なる場所で少なくとも15画像​​や動画を取ります。細菌は小さく、集中することが潜在的に困難です。 インビトロ流動実験の前に、適切な焦点面をカバースリップ上で蛍光標識された細菌の滴を配置し、フローチャンバー内にカバースリップを配置することによって取得することができます。次に、適切な焦点面を検索し、設定を保存します。 注：in vitroでの流動実験中に、洗浄工程（開始後±5分）の間に画像を捕捉することだけを保証します付着細菌のための信号が捕捉されます。 </li></ol></li><li>コラーゲンコーティング： <ol><li>ただ灌流を開始する前に、蛍光標識された細菌に60 / mlののVWFを追加します。 60 / mlのVWFを補充した蛍光標識細菌または蛍光標識された細菌を注射器を記入し、入口管に接続します。気泡を避けます。繰り返しの手順は2.3.5.3に2.3.5.2 </li></ol></li><li>内皮細胞： <ol><li>のCa 2+ -ionophore A23187の0.1 mM溶液で灌流による内皮細胞を活性化して灌流によって10分間細菌灌流と同じせん断速度でDMEM中（ストック溶液をジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解した10mMの） 0.1 mMの。繰り返して、2.3.5.3に2.3.5.2を繰り返します。 </li></ol></li></ol></li><li>次のようにせん断速度とせん断応力を計算します。 せん断速度= 6Q / WH 2 ：Q：流量W ml /分での速度、：センチ幅、H：cm単位の高さ せん断応力（τ）=せん断ラット元粘度（μ） どこμ：ミディアム：0.01ダインのx秒/ cm 2であり、全血：0.04ダインのx秒/ cm 2の </li><li>画像解析<ol><li>白黒カメラと倒立蛍光顕微鏡を使用してライブ画像を取得し、画像化ソフトウェアを使用して開発します。 1.5秒の露光時間を使用してください。ランダムフローチャンバーのコーティングされた表面上に広げ、適切なファイル形式で保存（少なくとも15）複数のスナップショットを取ります。 </li><li> ImageJので画像解析を実行します。と関心のある特徴にグレースケール画像をセグメント化、下側および上側のしきい値を設定するしきい値を定義 - 画像（Substractバックグラウンド·プロセス）からのスムーズな連続バックグラウンドを除去するためのバックグラウンドを減算します。閾値に制限された領域を測定します。 </li><li>細菌の付着を比較し、統計分析ソフトウェアを用いて、例えば 、蛍光領域として表さ。一方向ANOVAまたはTを使用してグループを比較しますWO-両側スチューデントt検定を。平均値の平均値±標準誤差（SEM）としてすべての値を報告します。重要な&lt;0.05のp値を考えてみましょう（* P &lt;0.05; ** P &lt;0.01; *** P &lt;0.001）。 </li></ol></li></ol> インビボ腸間膜灌流モデル3. <ol><li>マウスの作製/手術<ol><li>便通を制限するために、実験前の夜、マウスを絶食。 </li><li>ブプレノルフィンの皮下注射手術前に（0.1 mg / kg体重（BW））20〜30分まで6〜8週齢のマウス（C57BL / 6）手術前鎮痛を与えます。 </li><li>ケタミンの腹腔内注射（125 / kg体重）およびキシラジン（12.5 / kg体重）で、マウスを麻酔。ペダル反射により確認してください。乾燥を防ぐために、獣医軟膏を適用します。 </li><li>顕微鏡トレイに37℃の熱制御加熱パッドの上にマウスを置きます。これは、端末の手順であるので、厳密asceptiを必要としませんCプロシージャ。頸静脈の近くの切開を行い、そっと子宮頸部筋肉の右側を削除し、周囲の組織から頸静脈を分離します。 </li><li>蛍光標識された細菌または他の溶液の注入のための右頸静脈に2フランス語静脈カテーテルを挿入します。腹部正中切開により腹腔を開き、腸間膜を広げるために綿棒を使用し、腸間膜動脈と細静脈循環を可視化します。 </li><li>透明板の右側にマウスを置き、テープでカニューレを固定します。低体温症を防ぐためにホットパックを使用してください。組織の脱水を防ぐために、腸に500μlの0.9％のNaClをドロップします。 </li></ol></li><li>腸間膜循環への細菌付着の蛍光顕微鏡<ol><li>暗い部屋で働いています。船を固定し、倒立顕微鏡下でそれらを視覚化するために綿棒を使用してください。 </li><li>局所的に10 mM溶液oの5μLを適用FのCa 2+ -ionophore A23187は、DMSOに溶解しました。 10秒後、頸静脈カテーテルを介して（ステップ1を参照）100μlの標識された細菌を注入します。タイムラプス画像を撮影します。実験が終了した後、機関承認ガイドラインに従ってマウスを安楽死させます。 </li></ol></li><li>画像解析<ol><li>倒立蛍光顕微鏡を使用してライブ画像を取得し、白黒カメラを用いて捕捉され、任意の画像処理ソフトウェアを使用して開発しました。自動露光時間と使用する機器に固有のコントラストの最適化を適用します。 </li><li>千枚/秒の40サイクルを使用して - ツールバー（時間多次元買収）の「取得」ツールを使用してタイムラプス画像を取得します。適切な画像ファイル形式で画像を保存します。 </li><li>画像あたりの蛍光シグナルの面積を測定するためにImageJの解析ソフトウェアを用いて処理画像。 Fにグレースケール画像をセグメント、下側及び上側のしきい値を設定するしきい値を定義します興味の特長。金利（血管）の領域を特定し、しきい値と関心領域に制限された領域を測定します。細菌の付着を比較し、いずれかの統計やグラフ作成ソフトウェアを使用して蛍光領域として表現。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

せん断応力は、血管壁への早期細菌付着および血管内または心臓内植生および転移性の感染症4,5の次の世代のための重要な要因です。我々は、生理的せん断応力下の血管内感染の病因を研究するためのin vitroおよびin vivoモデルで相補します。これらのモデルは、私たちは、主要なSとフォンビルブランド因子結合タンパク質（vWbp）を識別することができました球菌タンパク質はVWF 4を露出させ 、損傷した血管壁と流れの下で対話します。 血管内感染症、特に感染性心内膜炎は、だけでなく、ため、ローカルおよび遠隔（ &#39;転移&#39;）合併症の、ためだけでなく、敗血症誘発性の臓器不全と死の懸念されます。感染性心内膜炎および転移性の感染症を引き起こす細菌は、血管壁に付着し、したがって、血流の剪断応力に抵抗しなければなりません。最も細菌の研究が要因が静的な条件で行われてきた病原性。しかし、これらの確立された相互作用は、細菌宿主の相互作用に新たな、以前に認識されていない要因を明らかにすることができる流動条件下で剪断力と研究に耐えられない可能性があります。 マイクロパラレルフローチャンバーを用いて、他のものは血管接着用VWFの重要​​性を示しています。せん断応力下では、VWFは、次第にその静止球状構造から展開、およびそののGPIb受容体6を介して血小板と相互作用するA1ドメインを公開します。フローチャンバーは、広く血小板機能7を研究するために使用されています。 驚くべきことに、またS.流下球菌の付着は、剪断時に露出されるA1ドメインをVWFを必要とし、特に。我々は結合VWFを媒介するvWbpを同定しました。 vWbpは、Sに貢献コアグラーゼですホストのプロトロンビンを活性化することにより、 黄色ブドウ球菌の病態生理。 Staphylothrombin、RES細菌コアグラーゼとプロトロンビンとの複合体をulting、不溶性フィブリン8,9をフィブリンに変換します。我々の研究はvWbpがプロトロンビンを活性化するが、流れ4,10,11の下の血管への接着性を向上させる細菌フィブリン-血小板凝集物の形成をトリガするだけでなくことを示しました。 in vitroでのフローチャンバーモデルは、細胞またはマトリックスの構成要素に細菌付着で別の選手を研究することができます。細菌の毒性因子は、特定の表面タンパク質を発現する変異体または無害な細菌を用いて研究することができます。代替的に、薬理学的阻害剤または遮断抗体は、フローチャンバ内の培地に添加することができます。そのような細胞外マトリックスの種々の成分のような宿主因子の役割は、異なるコーティングでカバーガラスを使用して研究することができます。カバースリップは、また、活性化状態は、特定の刺激物質を添加することによって調節することができるそれらの内皮細胞で覆うことができます。アパ血管壁からのRTは、宿主の血液細胞および血漿タンパク質の寄与は流動媒体にこれらの要素を追加することによって調べることができます。したがって、複雑化の異なる条件は、細菌がin vivoで血管壁に付着することを可能にする相互作用を解明するために、層流の標準化された条件の下で研究することができます。 in vitroモデルで同定された相互作用は、その後、複雑な生物で、その妥当性をテストするために、動物モデルで研究されています。流れの下で動的な相互作用を研究するために、他のin vivoモデルは、ハムスターの背側皮下脂肪チャンバー12と精巣挙モデル13として、記載されています。対照的に、ここで説明する腸間膜灌流モデルは、可能性はマウスの遺伝的背景をホスト変えるためにおよび薬理学的介入を評価するために、その使いやすさのいくつかの利点を提供しています。 結論として、説明したモデルS.だけでなく表面タンパク質を研究する可能性を提供黄色ブドウ球菌が、別のホストの背景には多くの他の微生物の、より良い血管感染症の病因を理解します。

血管内感染を確立するためには、病原体は血管壁と心臓の内面を覆う内皮に付着し、急速に流れる血液のせん断応力にさらされているにもかかわらず、持続して感染を確立するメカニズムを必要とします。 生命を脅かす血管内感染症や感染性心内膜炎を引き起こす最も頻度の高い病原体は、黄色ブドウ球菌(S. aureus)1です。
様々な細菌の表面結合接着分子は、細胞外マトリックス成分と相互作用することにより、宿主組織への接着を媒介します。これらのMSCRAMM(接着マトリックス分子を認識する微生物表面成分)は、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、コラーゲン、フォンヴィレブランド因子(VWF)などの分子を認識します。MSCRAMMは黄色ブドウ球菌の重要な病原性因子であり、宿主のコロニー形成と侵入に関与しています2。これらの病原性因子に関するほとんどの研究は静的な状態で行われており、したがって、細菌の初期接着が流れる血液で起こるヒト感染症を代表するものではない可能性があります。
血流感染症の場合、細菌は血管壁に付着するために、流れる血液のせん断力を克服する必要があります。したがって、流動条件下で細菌と内皮または内皮下皮との間の相互作用を調査するモデルは特に興味深いものです。
最近の研究では、せん断応力下での黄色ブドウ球菌の血管への接着がVWF3によって媒介されることが示されました。VWFは、せん断応力操作タンパク質であり、活性化時に内皮細胞から放出されます。循環VWFは、露出した内皮下マトリックスのコラーゲン線維に結合します。私たちのグループは、黄色ブドウ球菌のフォン・ヴィレブランド因子結合タンパク質(vWbp)がVWF4へのせん断を介した接着に重要であることを報告しました。
この記事では、細胞外マトリックスのさまざまな成分や内皮細胞への細菌の接着を評価できるin vitroフローチャンバーモデルを紹介します。この知見をin vitroで検証するために、マウスの腸間膜循環における細菌と血管壁との直接的な相互作用や細菌-血小板血栓の形成を、リアルタイムの生体内血管顕微鏡を用いて可視化・定量化するin vivoモデルを開発しました。

<table><tbody><tr><td>ブレインハートインフュージョン(BHI)</td><td>BDプラスチパック&nbsp;</td><td>237500</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン大豆ブロス (TSB)</td><td>Oxoid</td><td>CM0129</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-169</td><td>D-PBS</td></tr><tr><td>5(6)-カルボキシフルオレセイン N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21878-25MG-F</td><td>蛍光標識&nbsp;</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミンフラクションV(BSA)</td><td>Roch</td><td>10 735 086 001</td><td></td></tr><tr><td>Haemate-P</td><td>CSL Behring</td><td>PL 15036/0010</td><td>VWF</td></tr><tr><td>Hormコラーゲン</td><td>武田薬品</td><td>10500</td><td>コラーゲン</td></tr><tr><td>1ウェルPCA細胞培養チャンバー</td><td>Sarstedt</td><td>94.6140.102</td><td>プラスチックスリップ</td></tr><tr><td>Temgesic</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>283716</td><td>bruprenorphine</td></tr><tr><td>アネスケチン (ケタミン塩酸塩 115 mg/ml (100 mg/ml ケタミナム))</td><td>Eurovet</td><td>BE-V136516</td><td>ケタミン</td></tr><tr><td>XYL-M 2% (キシラジン塩酸塩 23.32 mg/ml (20 mg/ml キシラジン))</td><td>VMD アレンドンク</td><td>BE-V170581</td><td>キシラジン</td></tr><tr><td>2 フランス静脈内カテーテル 緑</td><td>Portex</td><td>200/300/010</td><td></td></tr><tr><td>0,9% 塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>Baxter Healthcare</td><td>W7124</td><td></td></tr><tr><td>綿綿棒</td><td>国際医療製品</td><td>300230</td><td></td></tr><tr><td>Ca2 +-イオノフォア溶液A23187</td>シ<td>グマ-アルドリッチ</td><td>C7522-10 MG</td><td></td></tr><tr><td>26ゲージ1mlシリンジ&nbsp;&nbsp;</td><td>BDプラスティパック&nbsp;</td><td></td><td></td>300013</tr><tr><td>26ゲージ1mlシリンジ&nbsp; ニードルBD</td><td>プラスチパック付き&nbsp;</td><td>300015</td>腹腔<td>内注射</td></tr><tr><td>遠心分離機 5810-R</td><td>エッペンドルフ</td><td>5811 000.320</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ (24x50)</td> <td>VWR</td><td>BB02405A11</td><td>厚さ No, 1</td></tr><tr><td>PHD 2000 輸液</td><td>ハーバード装置</td><td>702100</td><td>高精度ハーバード輸液ポンプ</td></tr><tr><td>Axio-observer DI</td><td>カールツァイス</td><td>倒立蛍光顕微鏡</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>国立衛生研究所</td><td>解析ソフト</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism 5,0</td><td>Graphpad 解析</td><td>ソフト</td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRm</td><td>Carl-Zeiss&nbsp;</td><td>白黒カメラ</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitroおよびin vivoモデルでは血管壁の下でフローの状況に細菌付着を研究するために、

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

血管内感染症および感染性心内膜炎を引き起こすために、細菌は、血液の流れのせん断応力にさらされながら、血管壁に付着することができる必要があります。 微生物の血管接着に寄与する細菌と宿主因子を同定するために、生理学的剪断条件下で、これらの相互作用を研究する適切なモデルが必要とされています。ここでは、細胞外マトリックスの異なるコンポーネントに細菌の付着を調査するか、内皮細胞を可能にするインビトロフローチャンバーモデル、およびin vivoで直接内臓循環への細菌の初期接着を可視化するために開発された生体顕微鏡のモデルを記述します。これらの方法は、流れの下の細菌の付着のために必要な細菌と宿主因子を同定するために使用することができます。我々は、せん断応力の妥当性とStaphyの接着のためのフォンビルブランド因子の役割を示していますlococcus球菌の両方のin vitroおよびin vivoモデルで使用して。

VWFへの黄色ブドウ球菌の接着、内皮下マトリックスおよび内皮細胞は、せん断応力に依存する現象であります S.との間の相互作用におけるせん断応力の役割を強調するために、 黄色ブドウ球菌およびVWF、我々 は、in vitro灌流モデルを図1に示されているの概略図（異なるせん断速度でVWFの上にコーティングされたカバースリップを灌流を行った。 黄色ブドウ球菌の付着VWFに250秒からせん断速度を増加させる-1 2,000に伴って増加しました秒-1（ 図2）、高剪断力は、VWFへの細菌の付着を阻害するが、強化しないことを示します。 コラーゲンへの内皮下マトリックスの主成分を細菌付着に対するVWFの寄与を調べるために、我々は、蛍光標識されたS.を潅流VWFの存在下または非存在下でのコラーゲンの上に黄色ブドウ球菌 。 VWF、S.の付着がない場合Aコラーゲンへのureusはせん断速度の増加に伴って減少しました。しかし、VWFは、Sの密着性媒体中に存在したとき黄色ブドウ球菌は、剪断速度を（ 図3）の増加とともに増加しました。 in vitroでのフローモデルはまた、私たちは流れの下で内皮細胞への細菌の付着を調べることができます。我々は、蛍光標識されたSでのHUVECを灌流せん断速度で500〜2000秒球菌 -1。示される場合には、HUVECをVWFの放出を引き起こすためにはCa 2+ -ionophoreで活性化しました。内皮細胞の活性化およびその後のVWFのリリース、Sの増加接着リニア延伸VWF分子に沿って細菌の結合を示唆し、せん断力（ 図4B）の方向に整列した細菌のクラスタを蛍光標識の典型的な「紐状」パターンを形成球菌 （ 図4A）。 生体内での最初の内臓静脈内細菌の付着はVWFによって媒介されます S.ので、 生体内で活性化され、血管壁への細菌の付着を調査するために（ - - / VWF）球菌は VWFに付着することができ、我々は（VWF + / +）とVWF欠損マウス野生型マウスを使用していました。内臓血管のリアルタイムビデオ顕微鏡は、蛍光標識されたS.循環のインビボでの可視化を可能にしました球菌（in vivoでの灌流モデルの概略図を図5に示されています）。 のCa 2+ -ionophoreによる内皮の薬理学的活性化の後、我々は、WTマウスの血管壁への個々の細菌や細菌の凝集体の迅速な局所的蓄積を観察した（補足ビデオ1及び2）。ほとんどの細菌の付着は、VWF -deficieの活性化血管壁に見られませんでした。NTマウス（補足ビデオ3）WTマウスにおける接着と比較した（ 図6）。 VWFの非存在は、Sの能力を低下させます活性化した血管壁に付着する黄色ブドウ球菌 。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig1.jpg" /> 図1. インビトロ流モデルの略図。 インビトロ流モデルは、内皮下マトリックスへの細菌の付着などの異なるせん断依存機構の研究を可能にするだけでなく、形成を血栓多機能モデルです。マイクロパラレルフローチャンバーは、タンパク質および内皮細胞の異なるコーティングを有するカバースリップ（プラスチックまたはガラス）上に配置されます。異なる細菌（オレンジ、グレードット）の付着を分析することができ、血漿タンパク質、血小板、全血の存在の影響を評価することができます。血小板のための蛍光マーカー（青楕円）またはfibrinogEN（青ストリング）は、細菌と宿主因子を区別するために別の阻害剤（黒色楕円）と組み合わせて使用​​することができます。 Sの細菌付着の代表的な画像VWFの存在（下）中のコラーゲンコーティングまたは非存在下（上）に黄色ブドウ球菌が （スケールバーは100μmである）が示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig2.jpg" /> Sの図2.接着増加せん断速度とVWFの増加に黄色ブドウ球菌。S.蛍光標識でコーティングされたVWF（50μg/ mlの）上のマイクロパラレルフローチャンバー灌流250〜2,000秒-1培地中で（秒-1）（N&gt; 5）のせん断速度で球菌ニューマン。全ての結果は平均±SEMとして表されます。 * P &lt;0.05、** p &lt;0.01。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig3.jpg" /> S.図3接着内皮下層への黄色ブドウ球菌は 、せん断およびVWF依存している。と、蛍光標識したS.コーティングされたコラーゲン（160 / mlの）上のマイクロパラレルフローチャンバー灌流培地中の250秒〜2000 -1のせん断速度（nは&gt; 5）で球菌ニューマン。示されている場合VWF（60μgの/ ml）を培地中に存在しました。全ての結果は平均±SEMとして表されます。 ** P &lt;0.01。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig4.jpg" /> Sの図4.接着活性化内皮細胞へ球菌は、内皮細胞上の依存せん断。マイクロパラレルフローチャンバー灌流あります 。 （A）ヒト臍帯静脈内皮細胞のCa 2+を-ionophore Aで活性化しましたS.蛍光標識の10分間の灌流に続いて23187（0.1ミリモル）培地中の500秒〜2000 -1のせん断速度（nは&gt; 5）で球菌ニューマン。全ての結果は平均±SEMとして表されます。 * p &lt;0.05。 S.と活性化されたHUVECを超えるマイクロパラレルフローチャンバー灌流の（B）イメージ千秒-2。S.のせん断速度で、 黄色ブドウ球菌黄色ブドウ球菌は、VWF多量体との密着性を（スケールバーは100μmである）を示唆し、±200ミクロンの長さの文字列を形成している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig5.jpg" /> 図5 の生体内腸間膜灌流モデルの概略図。右頸静脈カテーテルは、（黄色の線）フッ素を投与するために挿入され、escently標識された細菌（オレンジドット）、追加の麻酔薬またはそのような医薬阻害剤および抗体などの他のコンポーネント。腹腔を開き、腸間膜は、蛍光顕微鏡下での血管（静脈および動脈）を可視化するために広がっています。 VWFの放出を誘導したCa 2+ -ionophoreによる内皮細胞の薬理学的活性化の後、細菌は、頸静脈カテーテルを介して注入することができます。リアルタイム血管内ビデオ顕微鏡は、蛍光標識された細菌や細菌血小板血栓の形成得られた循環の in vivo可視化を可能にする。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig6.jpg" /> 図6. Sの初期接着球菌in vivoでの活性化内皮にはVWFが介在する C57BL / 6 VWF + / +およびC57BL / 6 VWFとのインビボ静脈腸間膜灌流モデル- / -マウス。蛍光標識されたSの接着局所的に活性化された血管壁に球菌VWFに有意に低い- / -マウス。全ての結果は平均±SEMとして表されます。 *** P &lt;0.001、n&gt;は7。 <img alt="ビデオ図1" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV1.jpg" /> ビデオ1：Sのリアルタイム接着VWF + / +マウスにおいて、活性化された血管壁に黄色ブドウ球菌 。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video1JorienClaes.mov" target="_blank">このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。</a> ビデオ2：Sのリアルタイム凝集体形成および塞栓VWF + / +マウスにおける黄色ブドウ球菌 。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video2JorienClaes.mov" target="_blank">このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="ビデオ図3" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV3.jpg" /> ビデオ3：Sのリアルタイム接着 - / -マウス- / - 。VWF + / +およびVWFを有するマウス においてインビボ腸間膜灌流モデル球菌VWF中の活性化血管壁へ 。のCa 2+ -ionophore（10ミリモル）の5μlをアプリでした可視化血管床の領域とエド。カルボキシ-フルオレセイン標識Sのサスペンション黄色ブドウ球菌は、頸静脈カテーテルを介して注入しました。腸間膜循環が倒立顕微鏡下で可視化した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video3JorienClaes.mov" target="_blank">このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。</a>

せん断応力下での細菌と血管との相互作用を研究するために、血管接着に寄与する細菌と宿主因子を解剖することを可能にするフローチャンバーとin vivo腸間膜生体内顕微鏡モデルが説明されています。

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

本実験の全体的な目的は、せん断応力下における細菌と内皮および内皮下組織との相互作用を調査することです。これは、第2ステップとして、細菌を蛍光標識し、ビデオ顕微鏡を用いてリアルタイムで可視化することで達成されます。流動細菌の細胞成分またはマトリックス成分への接着に関与するさまざまな要因を研究するために、in vitroフローチャンバーが使用されます。次に、in vitroモデルで特定された相互作用をin vivo腸間膜灌流モデルで検討し、複雑な生体内における関連性を検証します。その結果、staphylococcus reusはせん断応力下において、活性化された内皮細胞および内皮下に付着できることが示されました。既存の手法に対するこの技術の主な利点は、in vitroおよびin vivoの両モデルを含んでいることであり、これらはせん断応力下における血管内感染の病態生理を研究する上で相補的な役割を果たします。これらの手法は、感染性心内膜炎や転移性感染が生理的なせん断応力下でどのように成立するかなど、感染症および血管生物学の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。ここでは、当研究室の動物実験専門技術者であるbe Malinによる手順を実演します。まず、細菌の追跡に使用する蛍光染料を調製することから始めてください。ストックのカルボキシ蛍光溶液 150 µL を、研究用グレードの水 850 µL に加えて混合します。この溶液を遮光し、使用時まで －20 °C で保存します。次に、5 mL の S. reus 培養液をペレット化します。tryptic soy brothで一晩培養した細菌をPBSで1回洗浄し、再懸濁します。得られたペレットを800 µLのPBSで再懸濁し、in vitro灌流実験の場合は再懸濁した細胞に200 µLの染色液を、in vivo実験の場合は400 µLの染色液を加えます。in vivo実験では、染料の光退色を防ぐためにチューブをアルミホイルで覆い、室温のシェーカーで30分間インキュベートします。次に、非特異的結合をブロックするために、PBSで調製した6%牛血清アルブミン溶液を混合物に加えます。光学サイトメトリーを用いて細胞濃度を確認し、用途に応じて細菌をPBSで様々な濃度に希釈します。希釈後、チューブを遮光し、氷上に置きます。von Vand因子を実験室グレードの水で希釈し、最終濃度を50 µg/mLにします。同様に、コラーゲンを等張グルコース溶液で希釈し、最終濃度を160 µg/mLにします。その後、それぞれのコーティング液を200 µLずつパラフォームのストリップ上に滴下します。カバーガラスを液滴の上に置き、タンパク質でコーティングします。加湿容器に入れ、室温で4時間インキュベートします。次に、鈍針を用いてパラフィルムからカバーガラスを慎重に剥がし、内皮細胞を用いた実験用にフローチャンバーの底部にマウントします。プラスチック製スリップを1 mLの1%ゼラチンPBS溶液でコーティングし、37 °Cで30分間インキュベートします。次に、ゼラチンでコーティングしたプラスチックスリップにヒト臍帯静脈内皮細胞を播種し、コンフルエンシーが 70 ～ 80% になるまで培養します。タンパク質をコーティングしたカバースリップ、または内皮細胞をコーティングしたプラスチックスリップを、フローチャンバーの底部に取り付けます。その後、フローチャンバーの上部に注入口と排出口のチューブを接続し、排出口のチューブを廃棄容器に接続します。フローチャンバーの上部を底部にそっと重ねて組み立てます。気泡の混入に注意しながら、1 mLの培地をチャンバーに注入し、漏れがないことと、過剰なコーティング溶液が除去されていることを確認します。次に、1 mL用シリンジを使用して、流速が75 µL/minになるように輸液ポンプを設定します。暗室で、1 mL用シリンジに1 mLの蛍光標識細菌を満たし、輸液ポンプに装着します。シリンジの出口をフローチャンバーの入口に接続します。気泡が入らないように注意しながら、注入ポンプを75 µL/minの速度で10分間作動させます。10分後、最初のシリンジを取り外し、PBSまたはDMEMを入れた1 mLシリンジを入口チューブに接続します。注入ポンプを作動させ、10分間洗浄して、未結合の細菌を洗い流します。すすぎが終わったら、注入ポンプをオンにしたまま、フローチャンバーのコーティング表面上のランダムな位置で、露光時間を1.5秒に設定して白黒画像を少なくとも15枚撮影します。Image Jなどの画像解析プログラムを用い、バックグラウンド減算を行って画像からなめらかな連続背景を除去し、しきい値を定義して下限値と上限値を設定することで、グレースケール画像を関心領域の機能へとセグメント化します。次に、新しく作成されたしきい値で限定された領域を測定し、この値を各サンプルの蛍光面積として保存します。排便を減らすため、実験前夜に生後8週齢のマウスを絶食させた。実験当日、まず鎮痛剤としてbuprenorphineを体重1kgあたり0.1mg投与する。次に、マウスを麻酔し、眼に軟膏を塗布する。マウスを解剖顕微鏡下の温度制御加熱パッドの上に置き、パテラ反射（膝蓋腱反射）がないことを確認します。頸静脈に平行に1 cmの切開を加えます。頸部の右側の筋肉を取り除き、周囲の組織から頸静脈を分離します。2 Frenchの静脈留置カテーテルを右頸静脈に挿入し、縫合して固定します。次に、腹部正中切開を行い、腹腔を開きます。マウスを透明プレート上に右側を下にして置いた状態で、カニューレをテープで固定します。綿棒を用いて腸管をそっと引き出し、腸間膜を広げます。これは、腸間膜動脈および細動脈の血流を可視化するためです。マウスにホットパックを当てて低体温症を防ぎ、組織の脱水を防ぐために30分ごとに0.9% NACLを500 µL 腸管に滴下します。綿棒を用いて血管を固定し、倒立顕微鏡下で観察します。次に、DMSOに溶解した10 mMのカルシウム・イオノフォア溶液を5 µL局所的に投与します。これにより、血管内皮細胞からのフォン・ヴィレブランド因子（von Willebrand factor）の放出が活性化されます。10秒後、蛍光標識した細菌 100 µL を頸静脈カテーテルから注入します。このタイミングでタイムラプス画像の撮影を開始し、ツールバーの取得ツールを用いて、1秒間に1000枚の画像を40サイクル取得します。画像の取得が完了したら、施設指針に従ってマウスを安楽死させます。画像を適切な画像ファイル形式で保存し、前述の通りImageJ解析ソフトウェアを用いて画像を処理します。せん断応力が細菌の接着に果たす役割を強調するため、Von Willebrand因子をコーティングしたカバースリップを用い、異なるせん断速度で黄色ブドウ球菌（staphylococcus aureus）の灌流を行いました。せん断速度が増加するにつれて細菌の接着も増加し、高いせん断力が細菌のタンパク質への接着を抑制するのではなく、むしろ強化することが示されました。Von Willebrand因子が存在しない場合、コラーゲンへの黄色ブドウ球菌の接着は、せん断速度の増加に伴い減少しました。しかし、培地中にVon Willebrand因子が存在する場合、剪断速度の増加に伴い細菌の接着が増加した。カルシウム・イオノフォアで活性化しVon Willebrand因子を放出させた内皮細胞は、非活性化細胞よりも有意に多くの細菌接着を示した。さらに、細菌は剪断力の方向に沿って整列した、蛍光標識細菌クラスターによる典型的な紐状のパターンを形成し、これは直線的に伸展したVWF分子に沿って細菌が結合していることを示唆している。Von Willebrand因子のin vivoでの効果を検証するため、腸間膜循環の内皮細胞を活性化させてVon Willebrand因子を放出させ、次いで蛍光標識した細菌細胞を血流に導入した。その結果、細菌は活性化した血管壁に局所的に接着し、凝集体を形成した。このビデオを視聴することで、細菌を蛍光標識し、in vitroフローチャンバーおよびin vivo腸間膜灌流モデルの両方で可視化することにより、せん断応力における細菌と血管壁の相互作用をどのように調査するかについて、より深い理解を得ることができます。この手法は、心血管感染症分野の研究者が、感染性心内膜炎や転移性感染症における病原体と血管壁の相互作用を探索するための道を開くものです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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in vitroおよびin vivoモデルでは血管壁の下でフローの状況に細菌付着を研究するために、

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