Name: 非統合ソームプラスミドを用いて凍結軟膜から誘導多能性幹細胞の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 学ぶ凍結軟膜由来の末梢血単核球から非統合ソームプラスミドを用いて誘導多能性幹細胞を生成する方法。このウイルスフリーで費用対効果の高いプロトコルは、免疫蛍光法と遺伝子発現解析により多能性マーカーを確認し、患者特異的な組織生成や治療応用に有用です。

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この研究は、保健省とボルツァーノ自治州の教育支援・大学・研究局、および南チロリアン・スパークス財団の支援を受けました。

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nat. Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).</li>
<li>Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells--from+mechanisms+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Med.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications.</a> J. Mol. Med. (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).</li>
<li>Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technological+overview+of+iPS+induction+from+human+adult+somatic+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells).</a> Curr. Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Sommer, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+peripheral+blood+using+the+STEMCCA+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector.</a> J. Vis. Exp. (68), e4327(2012).</li>
<li>Zhou, W., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+gene+delivery+can+reprogram+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).</li>
<li>Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+with+CytoTune%2C+a+non-integrating+Sendai+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus.</a> Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).</li>
<li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nat. Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell. Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).</li>
<li>Warren, L., Ni, Y., Wang, J., Guo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+with+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA.</a> Sci. Rep. 2, 657(2012).</li>
<li>Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotency%3A+history%2C+mechanisms%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications.</a> Genes Dev. 24 (20), 2239-2263 (2010).</li>
<li>Chou, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+human+iPS+cell+derivation+by+a+non-integrating+plasmid+from+blood+cells+with+unique+epigenetic+and+gene+expression+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures.</a> Cell Res. 21 (3), 518-529 (2011).</li>
<li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+arrhythmogenic+right+ventricular+dysplasia+with+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs.</a> Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).</li>
<li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat. Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).</li>
<li>Streckfuss-Bomeke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+bone+marrow+cells%2C+hair+keratinocytes%2C+and+skin+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Comparative study of human-induced pluripotent stem cells derived from bone marrow cells, hair keratinocytes, and skin fibroblasts.</a> Eur. Heart J. 34 (33), 2618-2629 (2013).</li>
<li>Miyoshi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+mouse+and+human+cells+to+pluripotency+using+mature+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs.</a> Cell. Stem Cell. 8 (6), 633-638 (2011).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+from+human+hair+follicle+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell.+Rev%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells from human hair follicle mesenchymal stem cells.</a> Stem Cell. Rev. 9 (4), 451-460 (2013).</li>
<li>Beltrao-Braga, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+derivation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+immature+dental+pulp+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from human immature dental pulp stem cells.</a> Cell Transplant. 20 (11-12), 1707-1719 (2011).</li>
<li>Haase, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood.</a> Cell. Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).</li>
<li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nat. Protoc. 7 (11), 2013-2021 (2012).</li>
<li>Staerk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells.</a> Cell. Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).</li>
<li>Geti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+and+efficient+cellular+substrate+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+adults%3A+blood-derived+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">A practical and efficient cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells from adults: blood-derived endothelial progenitor cells.</a> Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 855-865 (2012).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr Protoc Immunol. , Appendix 3-Appendix 3B (2001).</li>
<li>Hasegawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+reprogramming+efficiency+between+transduction+of+reprogramming+factors%2C+cell-cell+fusion%2C+and+cytoplast+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparison of reprogramming efficiency between transduction of reprogramming factors, cell-cell fusion, and cytoplast fusion.</a> Stem Cells. 28 (8), 1338-1348 (2010).</li>
<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> J Vis Exp. (45), 2565(2010).</li>
<li>Fleige, S., Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+integrity+and+the+effect+on+the+real-time+qRT-PCR+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance.</a> Mol Aspects Med. 27 (2-3), 126-129 (2006).</li>
<li>Meraviglia, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chorionic+villus+mesenchymal+stromal+cells+reveal+strong+endothelial+conversion+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Human chorionic villus mesenchymal stromal cells reveal strong endothelial conversion properties.</a> Differentiation. 83 (5), 260-270 (2012).</li>
<li>Caspersson, T., Zech, L., Johansson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+human+metaphase+chromosome+set+by+aid+of+DNA-binding+fluorescent+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of human metaphase chromosome set by aid of DNA-binding fluorescent agents.</a> Exp Cell Res. 253 (2), 302-304 (1999).</li>
<li>Alikani, M., Munne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonviable+human+pre-implantation+embryos+as+a+source+of+stem+cells+for+research+and+potential+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell.+Rev%22%5BJournal%5D)">Nonviable human pre-implantation embryos as a source of stem cells for research and potential therapy.</a> Stem Cell. Rev. 1 (4), 337-343 (2005).</li>
<li>Tropel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+derivation+of+human+embryonic+stem+cell+lines+following+pre-implantation+genetic+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell.+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">High-efficiency derivation of human embryonic stem cell lines following pre-implantation genetic diagnosis.</a> In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 46 (3-4), 376-385 (2010).</li>
<li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+cell+reprogramming+is+a+stochastic+process+amenable+to+acceleration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration.</a> Nature. 462 (72-73), 595-601 (2009).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ink4%2FArf+locus+is+a+barrier+for+iPS+cell+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Ink4/Arf locus is a barrier for iPS cell reprogramming.</a> Nature. 460 (7259), 1136-1139 (2009).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).</li>
<li>Lindner, S. E., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasmid+replicon+of+Epstein-Barr+virus%3A+mechanistic+insights+into+efficient%2C+licensed%2C+extrachromosomal+replication+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">The plasmid replicon of Epstein-Barr virus: mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in human cells.</a> Plasmid. 58 (1), 1-12 (2007).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

過去には、唯一の方法は、特定の遺伝的変異を有するヒト多能性幹細胞を得るためには、着床前遺伝子診断を受けている親を募集し、その廃棄31,32胚盤胞から胚性幹細胞を生成することでした。再プログラミングのアプローチを使用して、研究者らは現在、事実上すべての遺伝子型を保有する患者からiPS細胞を生成することができます。それは障害および新規治療アプローチのその後の識別の病態生理の研究を可能にするため、患者特異的細胞株と簡単にアクセスできるソースから開始する可能性は非常に重要です。 本研究では、我々はすでに凍結軟膜PBMNCsから以前に密度勾配分離22後に凍結PBMNCsからiPS細胞と正常に生成ウイルスフリー性IPSCを生成するために適用される方法とのプラスミドアプローチ15を組み合わせます。代わりに、密度勾配分離PBMNCsすべてのバフィーコートの使用サンプル処理中にオペレータのための時間と手動の手順を作業、コストを削減するために私達にOWS。凍結したバフィーコートからPBMNCsを使用して、低コストのプロトコルのセットアッ...

2006年には、山中伸弥のグループが1 KLF-4、成体マウスおよびヒトからの体細胞は、4つの再プログラミング因子（Oct-4の、ソックス-2の異所性発現によって多能性状態に変換することができることを初めて実証し、 C-Mycの）、いわゆる人工多能性幹細胞（性IPSC）2を生成します。患者特異性IPSC密接形態、増殖、およびhESCの使用に関連する倫​​理的な問題を欠くと迂回し、三生殖細胞型（中胚葉、内胚葉及び外胚葉）に分化する能力の点でヒト胚性幹細胞（hESC）の似ています可能な免疫拒絶3。このように、性IPSCは、基礎研究、薬物スクリーニング、疾患モデリング、毒性の評価、および再生医療の目的のために4患者特異的細胞の最も重要な源の一つとして表示されます。 いくつかのアプローチは、iPS細胞の生成のために使用されている：ウイルスベクターを統合します（レトロウイルス5、レンチウイルス6）、ウイルス非組み込み型ベクター（アデノウイルス7）、センダイウイルス8、BACトランスポゾン9、エピソームベクター10、タンパク質11またはRNAの送達12。ウイルス媒介方法の使用は、高効率のリプログラミングにつながることができますが、ウイルスベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、したがって、潜在的なランダム挿入変異、遺伝子発現の永久的な変化、および分化の間沈黙導入遺伝子の再活性化は、13を除外することはできません。 再生医療用iPS細胞をより安全にするために、努力は携帯のゲノムへの外来DNAの組込みなしでiPS細胞を誘導するためになされています。切除可能なウイルスベクターおよびトランスポゾンが開発されているが、それは必然的に短く切除後に形質導入​​した細胞中に残存ベクター配列、およびトランスポザーゼの発現は、細胞内変化を誘発することができるかどうかまだ不明ですウラル機能13。その高い初期化効率にもかかわらず、センダイウイルスは、高価なアプローチを表し、このシステムを開発した会社でリーチスルーライセンスの懸念は、翻訳の研究でその用途を制限する可能性があります。さらに、タンパク質およびRNAの直接導入の必要性は、これが導入されて、固有の技術的な限界で分子を再プログラミングする複数の配信を必要とし、全体の再プログラミング効率は14非常に低いです。注目すべきは、エピソームプラスミドの使用に基づいて、費用対効果の高い無料のウイルスおよび非統合の方法は、正常皮膚線維芽細胞15の再プログラミングのために報告されています。具体的には、本研究で我々は、以前に10,15を報告したように、市販の統合フリーエピソームプラスミドを使用することにしました。 現在までに、皮膚線維芽細胞は、最も人気のあるドナー細胞型5を表します。しかし、他の細胞源は大成功していますsfullyケラチノサイト16、骨髄間葉系幹細胞17、脂肪間質細胞18、毛包19および歯髄細胞20を含むiPS細胞に再プログラム。これらの細胞の単離は、外科的処置を必要とし、数週間の初代細胞培養を確立するために、 インビトロ細胞増殖に必要とされます。 この観点から、細胞型の開始の選択は重要であり、それは、血液などの容易にアクセス可能で低侵襲性の組織からiPS細胞を生成することができることが同様に重要です。臍帯血単核細胞（CBMNCs）21,22と、末梢血単核細胞（PBMNCs）14,22-24両方が性IPSCの導出のための細胞の適切な供給源を表します。 成人PBMNCの再プログラミングの効率がCBMNCs 22のそれよりも20〜50倍低いが、それらは、サンプリング目的のために最も便利な細胞型のままです。で実際には、PBMNCサンプリングは低侵襲であるという利点があり、加えて、これらの細胞は、再プログラミング実験の前に、インビトロで広範な拡張を必要としません。現在までに、異なるプロトコルは、密度勾配分離後PBMNCsを凍結し、解凍した日数ヶ月に凍結後と性IPSC 22,23に再プログラミングする前に数日のために拡張することができることを報告しています。それにもかかわらず、限り我々が知っているように報告は凍結バフィーコートからPBMNCsの再プログラミングを説明していません。重要なことは、密度勾配分離することなく収集凍結軟膜は、このように、試料採取を回避するiPS細胞の製造のための材料の容易にアクセスできるプールを表す、集団研究から大規模なバイオバンクに保存されている最も一般的な血液サンプルを表します。 本明細書中で、私たちは以前に記載されたプロトコル22に基づいて、初めて人間の冷凍軟膜からのウイルスフリー性IPSCの生成を報告しています。でまた、性IPSCは、非密度勾配精製PBMNC結果の制御プロトコルとして、密度勾配分離後に得られた凍結PBMNCsから生成されました。

<table><tbody><tr><td>クエン酸ナトリウム緩衝液Venosafeプラスチックチューブテル</td><td>モ</td><td>VF-054SBCS07</td><td></td></tr>塩化<tr><td>アンモジウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr>重<tr><td>炭酸カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60339</td><td></td></tr><tr><td>EDTA二ナトリウム粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td>0.5 M溶液</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium&nbsp;</td><td>GEヘルスケアライフサイエンス</td><td>17-5442-02</td><td>密度勾配遠心分離用ポリスクロース溶液</td></tr><tr><td>Iscoveの修飾ダルベッコ培地(IMDM)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21056-023</td><td>フェノールレッドハム</td></tr><tr><td>F-12</td><td>Mediatech</td><td>10-080-CV</td><td></td></tr><tr><td>インスリン-トランスフェリン-セレン-エタノールアミン (ITS -X)</td><td>Gibco</td><td>51500-056&nbsp;</td><td>1X (ノーマル: 100X)</td></tr><tr><td>Chemically Defined Lipid Concentrate</td><td>Gibco</td><td>11905031</td><td>1X (Stock: 100X)</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸 2-リン酸セスキマグネシウム塩水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>1-チオグリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td>最終濃度 200 & micro;M</td></tr><tr><td>組換えヒト幹細胞因子 (SCF)</td><td>PeproTech</td><td>300-07</td><td>100 ng/ml (在庫:100 &micro;g/ml)&nbsp;</td></tr><tr><td>組換えヒトインターロイキン-3 (IL-3)</td><td>PeproTech</td><td>200-03</td><td>10 ng/ml (Stock: 10 & micro;g/ml)</td></tr><tr><td>組換えヒトインスリン様成長因子 (IGF-1)</td><td>PeproTech</td><td>100-11</td><td>40 ng/ml (Stock: 40 &micro;g/ml)</td></tr><tr><td>組換えヒトエリスロポエチン(EPO)</td><td>R&Dシステムズ&nbsp;</td><td>287-TC-500</td><td>2 U/ml (ストック:50 U/ml)</td></tr><tr><td>デキサメタゾン&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>D2915</td><td>1 &mu;M (ストック: 1 mM)</td></tr><tr><td>ヒトホロトランスフェリン</td><td>R&Dシステムズ&nbsp;</td><td>2914-HT</td><td>100 &MU;g/ml (在庫:20 mg/ml)</td></tr><tr><td>Amniomax II</td><td>Gibco</td><td>11269016</td><td>細胞遺伝学的解析用培地</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies</td><td>5850</td><td>iPSCフィーダーフリー培養用培地</td></tr><tr><td>ノックアウトDMEM</td><td>Gibco</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト血清補充</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸溶液 (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td>0.1 mM (ストック: 50 mM)</td></tr><tr><td>酪酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887</td><td>0.25 mM (ストック: 0.5 M)</td></tr><tr><td>組換えヒト FGF 基本、145 aa&nbsp;</td><td>R&Dシステムズ&nbsp;</td><td>4114-TC</td><td>10 ng/ml (在庫: 10 & マイクロ;g/ml)</td></tr><tr><td>Y-27632 二塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503&nbsp;</td><td>10 &micro;M (在庫: 10 mM)</td></tr><tr><td>胎児定義ウシ血清</td><td>Hyclone</td><td>SH 30070.03</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax 0.1% ゼラチン溶液</td><td>メルク・ミリポア</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル基底膜マトリックス 成長因子の減少</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ, IV型</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td>1 mg/ml (在庫: 10 mg/ml)</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>PAALaboratories GmbH</td><td>L11-007</td><td>細胞剥離液</td></tr><tr><td>マウス胚性線維芽細胞 (CF1)</td><td>Global Stem</td><td>GSC-6201G</td><td>1*106 cells/6 well plate</td></tr><tr><td>プラスミド pCXLE-hOCT3/4-shp53-F</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>27077</td><td>1 & マイクロ;g(ストック:1&micro;g/&micro;l)</td></tr><tr><td>プラスミドpCXLE-hSK</td><td>アドジェネ&nbsp;</td><td>27078</td><td>1 &micro;g(ストック:1&micro;g/&micro;l)</td></tr><tr><td>プラスミドpCXLE-hUL</td><td>アドジェネ&nbsp;</td><td>27080</td><td>1 & マイクロ;g(ストック:1&micro;g/&micro;l)</td></tr><tr><td>プラスミドpCXLE-EGFP</td><td>アドジェネ&nbsp;</td><td>27082</td><td>1 &マイクロ;g(ストック:1&micro;g/&micro;l)</td></tr><tr><td>アルカリホスファターゼ染色キット</td><td>Stemgent</td><td>00-0009</td><td></td></tr><tr><td>Anti-stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody</td><td>Merck-Millipore</td><td>MAB4304</td><td>1/250</td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-60 Antibody</td><td>Merck-Millipore</td><td>MAB4360</td><td>1/250</td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-81 Antibody</td><td>Merck-Millipore</td><td></td><td>MAB4381 1/250</td></tr><tr><td>Anti-Oct-3/4 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-9081</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Anti-Nanog Antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-33759</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Anti-Troponin I Antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-15368</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Anti-&alpha;-Actinin (Sarcomeric) Antibody</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7732</td><td>1/250</td></tr><tr><td>Neuronal Class III &szlig;-Tubulin (TUJ1) Antibody</td><td>Covanceリサーチプロダクツ株式会社&nbsp;</td><td>MMS-435P-100</td><td>1/500</td></tr><tr><td>抗チロシンヒドロキシラーゼ (TH) 抗体</td><td>Calbiochem</td><td>657012</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ヤギ 抗マウス&nbsp;</td><td>分子プローブ</td><td>A-11029</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 ヤギ抗ウサギ</td><td>分子プローブ</td><td>A-21429</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>超低接着細胞培養 6 ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Trizol Reagent</td><td>Ambion</td><td>15596-018&nbsp;</td><td>RNA抽出用試薬</td></tr><tr><td>SuperScript VILO cDNA 合成キット</td><td>Invitrogen</td><td>11754050</td><td>逆転写酵素キット</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5124</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 リアルタイム PCR 解析システム</td><td>Bio-Rad</td><td>185-5195</td><td></td></tr><tr><td>Experion 自動電気泳動システム</td><td>Bio-Rad</td><td>700-7000</td><td>RNA の完全性を確認する装置</td></tr><tr><td>Experion RNAHighsense分析キット</td><td>Bio-Rad</td><td>7007105</td><td>RNAの完全性をチェックするための試薬キット</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡(SteREO Discovery V12</td>)<td>Zeiss</td><td>495007</td><td></td></tr><tr><td>NeonTransfection System 100 &micro;l キット</td><td>Invitrogen</td><td>MPK10025</td><td>エレクトロポレーション用試薬キット</td></tr><tr><td>ネオントランスフェクションシステム</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000</td><td>エレクトロポレーション用機器</td></tr><tr><td>NanoDrop UV/Vis 分光光度計</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>DNA/RNA定量用機器</td></tr><tr><td>EndoFree プラスミド マキシキット</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>プラスミド精製キット</td></tr></tbody></table>

非統合ソームプラスミドを用いて凍結軟膜から誘導多能性幹細胞の生成

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

体細胞は、典型的には、ヒト胚性幹細胞（hESC）で表される、（KLF-4、Oct-4の、ソックス-2、及びc-Mycの）は、4つの転写因子の発現を強制することによって誘導多能性幹細胞（iPS細胞）に再プログラムすることができ。によるヒトES細胞との類似性のために、性IPSCは、ヒトES細胞に関連する倫​​理的な問題を回避し、潜在的な患者特有の再生医療のための重要なツールとなっています。臨床応用のために適切な細胞を得るために、導入遺伝子を含まないiPS細胞は、導入遺伝子の再活性化、遺伝子発現の変化と誤った分化を回避するために生成される必要があります。また、非常に効率的で安価な再プログラミング方法は、治療目的のために十分なiPS細胞を誘導するために必要です。この必要性を考えると、効率的な非統合エピソームプラスミドアプローチは、iPS細胞の誘導に好適な選択です。現在、再プログラミングのために使用される最も一般的な細胞型は、線維芽細胞、組織生検を必要とするの分離、Iであります患者のためのnvasiveの外科的処置。そのため、ヒト末梢血は、iPS細胞の生成のための最もアクセスし、最も侵襲性の組織を表します。 本研究では、非組み込み型エピソームプラスミドを用いてコスト効果およびウイルスフリープロトコルは、全血の遠心分離後に密度勾配分離せずに凍結バフィーコートから得たヒト末梢血単核細胞（PBMNCs）からのiPS細胞の生成のために報告されています。

本研究では、全血の遠心分離および密度勾配分離が報告された後に得られたPBMNCsの再プログラミングと比較した後に凍結したバフィーコートから単離したPBMNCsの再プログラミングによるウイルスフリー性IPSCを生成するための簡単で効果的なプロトコルです。 図1（a）は、の概略図を示します詳細なプロトコル。解凍後、典型的な丸みを帯びた形状を示す単離されたPBMNCsは、14日間の特定の血液培養培地（ 図1B）に展開され、その後、エピソームプラスミドでトランスフェクトしました。 10〜15日後にトランスフェクションした後、定義されたマージンと胚性幹細胞様の形態を有する小さな丸い明るいコロニーが（ 図1C）現れ始めます。約20〜30日、トランスフェクション後に、iPS細胞コロニーは、シャープなエッジで、非常にコンパクトになり、そのサイズを大きくして、ピッキングと拡張（ 図1D）の準備ができています。最初の継代工程（2-3継代）した後、iPS細胞のコロニーをそれらの未分化状態を維持し、典型的なヒト胚性幹細胞の形態...

誘導多能性幹細胞（iPS細胞）が臨床応用および基礎研究のための患者特有の組織のソースを表します。ここでは、非組み込みエピソームプラスミドを用いてウイルスを含まないiPS細胞に凍結バフィーコートから得たヒト末梢血単核細胞（PBMNCs）を再プログラムするために詳細なプロトコルを提示します。

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

この手順の全体的な目的は、コスト効率が高くウイルスフリーなプロトコルを用いて、凍結バフィーコートから得られたヒト末梢血単核細胞から人工多能性幹細胞を樹立することです。まず、密度勾配を用いない全血遠心分離後にバフィーコートからPB MNCsを分離し、次いで特定の血液培養培地で拡大培養することでこれを達成します。第2のステップでは、エレクトロポレーションによりエピソーマルプラスミドをバフィーコート由来PB MNCsに導入します。次に、トランスフェクションしたPB MNCsを、新鮮なマウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞上に播種します。最終ステップとして、培養物から人工多能性幹細胞を手作業でピックアップし、増殖のために新しいフィーダー細胞プレートに移植します。最終的に、PB MNCsが典型的なヒトの形態を持つ人工多能性幹細胞へと効率的に初期化したことは、免疫蛍光染色および遺伝子発現の測定によって示すことができます。この手法の既存の方法に対する主な利点は、凍結保存されたOTからウイルスフリーのIPCを分化させることで、試料処理中のオペレーターのコスト、作業時間、および手作業のステップを削減できることです。もう一つの利点は、集団研究から収集され大規模バイオバンクに保存されている凍結OTを、iPS細胞製造のソース材料として利用できることです。まず、クエン酸ナトリウム緩衝プラスチックチューブに8 mLの静脈末梢血を採取することから始めてください。血液を25 °Cで保存し、12時間以内に処理してください。最初の処理ステップとして、血液を4 °Cで2000 Gsで15分間遠心分離します。スイングバケットローターを使用し、分離後に遠心ブレーキをかけないでください。白濁したバフィーコートを回収します。これは上層の血漿相と下層の間の層です。バフィーコートは濃縮されたP-B-M-N-C分画です。8 mLの各サンプルから約500 µLをクライオバイアルチューブに移します。次に、2倍濃度の凍結保存液を等量加えてバフィーコートを再懸濁し、制御凍結容器を用いて−80°Cで最大1週間凍結させます。より長期の保存が必要な場合は、細胞を液体窒素中で保存できます。解凍を開始するには、凍結保存されたバフィーコート由来のPB MNCs 1mL懸濁液を37°Cのウォーターバスで融解させます。その後、PBSを用いて細胞を2mLに希釈します。次に、希釈液を50 milliliterチューブに移し、10 millilitersの赤血球溶解バッファーを加えます。この混合液を室温で約10分間インキュベートします。10分後、滅菌PBSを用いて全量を50 millilitersまで増やします。次に、室温で 300 Gs、10 分間遠心分離します。遠心後、上清を捨て、ペレットを 50 milliliters の PBS で洗浄します。その後、再び細胞を遠心分離し、1 milliliter の PBM および C medium に再懸濁します。再懸濁した細胞の一部を分注し、計数盤を用いて細胞密度を測定します。その後、細胞密度を1mLあたり200万個に調整します。これで浮遊培養を開始します。標準的な12ウェルプレートのウェルに細胞を播種し、48時間インキュベートします。培地を1日おきに交換し、ピペットを用いて細胞を吸引し、15 mLコニカルチューブに移します。充填したチューブを室温で300 ×g、10分間遠心分離します。その後、上清を捨て、1 mLの新鮮なP-B-M-N-C培地で細胞を再懸濁します。PB MNC培養の初期段階では、赤血球の混入が一般的に見られます。細胞を新しい容器に戻す前に、倒立顕微鏡で細胞の状態を確認し、コンフルエンシーが約80%に達した時点で、継代時に培養物を分割してください。PB MNC培養の開始から2週間後になると、細胞はトランスフェクション可能な状態になります。T3、T4、およびP53に対するS-H-R-N-Aを搭載したプラスミド1種類、SOX2およびKLF4を搭載したプラスミド1種類、lmicおよびlin28を搭載したプラスミド1種類、そしてEGFPを搭載したプラスミド1種類の計4種類のプラスミドを準備します。まず、PB MNCを15 mLコニカルチューブに回収し、トリパンブルーを用いて生存細胞数を計測します。次に、生存細胞2 million個を用意し、遠心分離した後に、100 µLの再懸濁バッファーTと4種類のプラスミドを各1 µg含むトランスフェクションミックスで細胞を再懸濁します。続いて、トランスフェクション容器に3 mLの電解質バッファーを充填します。その後、トランスフェクションミックスを100 µLチップで吸引し、用意したエレクトロポレーションチューブに垂直に分注します。その後、3回のパルスを用いて細胞に電気穿孔を行います。電気穿孔後、0.25 mMの酪酸ナトリウムを含む、あらかじめ加温したPBMおよびC培地 2 mLで細胞を再懸濁します。次に、前述と同様に生存細胞数をカウントし、懸濁液をコートされていない6ウェルプレートの1ウェルに移します。プレートを設置し、緩やかに撹拌しながら24時間インキュベートします。トランスフェクション当日を除き、3日間は細胞を分割せずに維持します。共培養を開始する前日に、培地を0.25 mMの酪酸ナトリウムを含む新鮮に調製したP-B-M-N-C培地 2 mLに交換します。MES初回コートを準備し、6ウェルプレートの各ウェルに基底膜マトリックス 1 mLを分注し、37 °Cで15分間インキュベートします。その後、基底膜マトリックスを吸引除去し、10% FBSを含むDMEM 2 mLを用いてMEF 200,000個を各ウェルに播種します。翌日、PB MNCsを1 mLチップで回収します。それらを15 milliliterのコニカルチューブに移し、遠心分離します。上清を捨て、ペレットを2 milliliterの新鮮な培地で再懸濁します。その後、細胞をmethコーティングしたウェルに播種し、プレートを2日間インキュベートします。培地を0.25 mMの酪酸ナトリウムを含むiPSC培地2 mLに交換し、以後2日ごとにiPSC培地を交換し続けます。約22〜25日後に最初のiPSCコロニーが現れ、30〜35日までに確認できるはずです。iPSCコロニープレートを12ウェルプレートのフィーダー細胞上に播種する前日に、コロニーをピックアップして再播種できる状態になります。ウェルプレートに1ウェルあたり125,000個の細胞を播種し、一晩インキュベートします。翌日、meth細胞の培地を1 mLのサプリメント添加iPSC培地と交換します。その後、解剖顕微鏡下で、小さな塊を形成して成長した大きなコロニーを、針を用いて1つずつ採取します。ピペットを用いて個別に移し、メチルセルロース（meth）コートプレートの各ウェルに1コロニーずつ移して、継代のためにプレートをインキュベートします。iPSCコロニーには当初、同様のピッキング手法を用いますが、2〜3回継代した後は、酵素ベースの手順を使用します。典型的な円形を示した単離PB MNCsを、特定の血液培養培地で14日間拡大培養し、その後エピソーマルプラスミドでトランスフェクションしました。トランスフェクション後10〜15日で、境界が明確で胚性幹細胞様の形態を持つ、小さく円形で明るいコロニーが、トランスフェクションから約20〜30日後に現れ始めました。境界が明瞭で非常にコンパクトなiPSCコロニーが出現し、最初の数回の継代操作でピックアップ可能な大きさになるまで増大しました。iPSCコロニーは未分化状態を維持し、典型的なヒト胚性幹細胞の形態を示しました。倍率を上げると、コロニー内の個々の細胞と、核細胞質比が高いことが確認できます。選択したIPSEクローンをさらに10～15回ほど継代した。複数の独立した培養液から約20個のメタフェーズを回収し、遺伝的安定性を解析した。すべてのサンプルにおいて、in vitroでの継代を5～10回行った後も正常な核型が示された。これらのクローンの幹細胞性と多能性を評価した。その結果、各クローンでアルカリフォスファターゼ染色の陽性反応が認められた。定量R-T-P-C-Rにより、これらのクローンが元のPB MNCsよりもはるかに高いレベルで内因性多能性遺伝子を発現していることが確認された。内因性cmicおよびKLA fourのレベルはおおむね同様に維持されましたが、外因性のエピソーマル・トランスジェンの発現はIPCでは検出されず、これにより内因性多能性遺伝子が正常に活性化されたことが示されました。最終的に、免疫蛍光分析により、IPCがOC three four、SSEA four、TRA 180 1、SOX two、およびTRA one 60などの多能性マーカーを発現していることが明らかになりました。このビデオを視聴することで、ヒト末梢血から分離したkoから、非統合型エピソーマルプラスミドを用いて、コスト効率の高い方法でIPCを作製する方法について十分に理解できるはずです。

generation-induced-pluripotent-stem-cells-from-frozen-buffy-coats

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

我々は、人的要因Oct4は、レトロウイルスベクター、Nanogの、そしてLin28のレンチウイルスを介した配信を用いてヒトの体細胞から誘導多能性幹細胞の生成のためのプロトコルを示す。多分化能は、形態と胚性幹（ES）細胞特異的マーカーの存在によって確認された。...

StemgentヒトTFのレンチセットでヒト線維芽細胞を再プログラムすることによって誘導多能性幹細胞の生成

ここでは、単一のレンチウイルスベクターを用いたプログラミング末梢血の3-4...

STEMCCAレンチウイルスベクターを用いた末梢血からのヒト人工多能性幹細胞の生成

ここでは、再プログラミング戦略とヒス​​トンデアセチラーゼ阻害剤ベースのエピソームを用いて末梢血からのヒト人工多能性幹細胞を生成するためのプロトコルを記述している。...

エピソームおよびHDAC阻害剤を用いて血液からの効率的なiPS細胞の生成

この原稿は、抜毛された髪の毛からのヒトケラチノサイトの誘導と維持、およびその後のエピソームベクターによる統合フリーのヒト人工多能性幹細胞（hiPSCs）の生成のための段階的な手順を提供します。...

髪の由来ケラチノサイトを使用した統合フリーヒト誘導多能性幹細胞の生成

このプロトコルは、リプログラミング因子を含むマトリゲルとセンダイウイルスベクターの組み合わせを使用して、フィーダーフリーの状態でヒト末梢T細胞から人工多能性幹細胞(iPSC)を生成する方法を説明しています。...

フィーダーフリー条件にセンダイウイルスを用いてヒト末梢T細胞から人工多能性幹細胞の生成

末梢血単核細胞(PBMC)を人工多能性幹細胞(iPSC)に再プログラミングするためのプロトコルを提案します。形質導入した血液細胞をマトリックスコーティングプレートに遠心分離で播種することにより、浮遊細胞からiPS細胞を成功裏に誘導します。この技術は、PBMCやCBMCなどの細胞に対するシンプルで効果的なリプログラミングプロトコルを示唆しています。...

センダイウイルスや遠心分離を用いて血液細胞から誘導多能性幹細胞の生成

このプロトコルは、ヒトの成人末梢血細胞から統合フリーのiPS細胞を効率的に生成するための詳細な方法を説明しています。4つのoriP/EBNAベースのエピソームベクターを使用してリプログラミング因子(KLF4、MYC、BCL-XL、またはOCT4およびSOX2)を発現させることで、1...

エピソームベクトルを用いたヒト末梢血単核細胞からの統合フリー人工多能性幹細胞の生成

細胞リプログラミングでは、多能性細胞状態を調節し維持する主要遺伝子の導入が必要です。記載されたプロトコルは、ウイルス/統合方法なしでヒト皮膚線維芽細胞からの誘導多能性幹細胞(iPSC)コロニーの形成を可能にするが、非修飾RNA(NM-RNA)を免疫回避因子と組み合わせて細胞防御機構を低下させる。...

腹部皮膚からの成人ヒト皮膚線維芽細胞の分離と非積分法を用いた人工多能性幹細胞の生成

現在のプロトコルでは、製造元の指示に従って再プログラムが困難な患者の末梢血単核細胞(PBMC)から誘導多能性幹細胞(iPSC)を誘導するトラブルシューティング手順が詳細に記載されています。このプロトコルは凍結バフィー被毛サンプルに特有ですが、精製PBMCの再プログラミングにも適用されることがあります。...

凍結バフィーコートサンプルからの誘導多能性幹細胞株の再プログラミング

ここでは、フィーダー細胞なしでレンチウイルス系を用いて、患者由来の線維芽細胞様滑膜細胞から誘導された多能性ヒト幹細胞を生成するためのプロトコルを説明します。...

関節リウマチ患者の関節から分離された線維芽細胞様滑膜細胞を用いて誘導多能性幹細胞の生成

学ぶ凍結軟膜由来の末梢血単核球から非統合ソームプラスミドを用いて誘導多能性幹細胞を生成する方法。このウイルスフリーで費用対効果の高いプロトコルは、免疫蛍光法と遺伝子発現解析により多能性マーカーを確認し、患者特異的な組織生成や治療応用に有用です。

非統合ソームプラスミドを用いて凍結軟膜から誘導多能性幹細胞の生成

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