Name: マウスにおける異子宮頸心臓移植 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 学ぶマウスの異子宮頸心臓移植モデル。カフ法による血管吻合で虚血再灌流障害や移植片拒絶反応のメカニズムを研究する実験的手法を解説。移植生物学の理解に貢献する。

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M.-A. Deutsch is supported by Dr. Rusche Forschungsprojekt (2014) Deutsche Stiftung für Herzforschung and Deutsche Gesellschaft für Thorax- Herz- und Gefäßchirurgie. M. Krane is supported by Deutsche Stiftung für Herzforschung (F/37/11), Deutsches Zentrum für Herz Kreislauf Forschung (DZHK B 13-050A;DZHK B 14-013SE) と Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR3770/7-1;KR3770/9-1)

全ての実験は、ドイツのハートセンターミ​​ュンヘン、バイエルン、ドイツ（Gzを。55.2-1-54-2532.3-17-13）の政府によって承認されました。動物は、特定病原体フリーの施設に収容し、医学研究のための国民の協会と全米科学アカデミーが提供する「実験動物の管理と使用に関する指針」が策定した「実験動物管理の原則」に準拠した人の治療を受けました科学と国立衛生研究所（NIH出版番号86から23は、1985年改訂）で発表しました。 注：2つの湾曲鉗子と血管dilatators含む無菌の顕微機器の完全なセットは、手順（ 図2a）のために必要です。周術期の抗生物質による予防は、日常的に必要ではないが、免疫不全動物で示すことができます。動物をイソフルラン吸入端末を使用して屠殺しました。 ドナーの調製および移植片の収穫 &lt;オール&gt; <li>腹腔内（ip）ミダゾラムの注射（5.0ミリグラム/キログラム）、メデトミジン（0.5ミリグラム/ kg）およびフェンタニル（0.​​05 mg / kg体重）によって動物を麻酔。術野に仰臥位にマウスを置き、ペダル引っ込め反射により外科的な許容範囲を確認してください。 </li><li>クロルヘキシジンで皮膚を3回消毒し、腹部正中切開を行います。下大静脈を露出させるために左に濡れたガーゼで腸を撤回。 </li><li>抗凝固のために下大静脈を通って0.4ミリリットルの生理食塩水で希釈したヘパリンの50 IUを注入。ヘパリン化した後、容器1分を切開。 </li><li>ダイアフラムを開き、心臓を露出するための二国間の開胸術を行います。前胸壁を上方に反射し、クランプで所定位置に保持されます。 </li><li>胸腺を取り外し、露骨大動脈と肺動脈幹の間の結合組織を解剖。右上大静脈を切開。 </li><li>のレベルで動員上行大動脈を穿刺30 G針で腕頭動脈を5 mlシリンジに取り付けられ、ゆっくりと4℃の冷たい心停止液3mlで過度の圧力なしretrogradually心を灌流。冠循環への空気の侵入を避けます。さらに心停止を強化するために、移植片の上に氷冷生理食塩水をドロップします。 </li><li>腕頭動脈の原点に近位大動脈を横断します。 </li><li> 8-0シルクで心臓に近い劣ると優れたvenaの複数形の両方cavaeを連結し、合字に遠位にそれらを横断します。 </li><li>遠位に可能な限り肺動脈幹を自由に解剖。 8-0絹糸で分岐に近い肺動脈を結紮し、遠位にそれらを横断します。 </li><li>単一8-0絹結紮とすべて一緒に肺静脈を結紮し、それらを横断します。 </li><li>ドナーから心臓を取り出し、移植まで氷冷心停止液に保管してください。 </li></ol> 2.受信者の準備<ol><li>準備11番メスまたは顕微鏡下ではさみでポリイミドチューブを切断することにより吻合のための袖口。カフは、円筒状の本体と、血管クランプを配置するための拡張機能（円周の 1/3）、1ミリメートル（ 図2b）の各々の長さで構成されています。 </li><li>動物を麻酔し、上記のように外科的寛容性を確認します。水分補給のための0.25ミリリットル温かい生理食塩水を皮下（SC）を注入します。 </li><li>電気シェーバーを使用して、右頸部の毛を削除し、暖かいパッド上に仰臥位で動物を配置します。呼吸が損なわれる可能性がこのよう前肢を過延伸回避しながらテープのストランドと足を固定します。乾燥を防ぐために、眼軟膏を使用して、目を覆います。クロルヘキシジンで手術部位を3回消毒します。 </li><li>頸静脈ノッチに右下顎角から横皮膚切開を行います。 </li><li>ぶっきらぼうに内線を動員ernal頸静脈。バイポーラ鉗子で側枝を焼灼し、それらを横断します。 </li><li>顎下腺からの静脈との合流点のレベルで合字の間に外頸静脈を分割します。 </li><li>カフを介して外部頸静脈を引いて、カフの延長上に血管クランプを配置することによって、近位血管を閉塞。合字を削除し、1時10分、ヘパリン化生理食塩水で血管内腔を灌漑。 </li><li>カフの上に血管壁をエバート、プリセット周8-0絹糸結紮で固定します。 </li><li>胸鎖乳突筋の表面的な部分を削除します。 </li><li>右総頸動脈を動員し、頸動脈分岐下の合字間の血管を横断。 </li><li>カフを介して頸動脈を引いて、カフの延長上にYasargilクランプを配置することによって、近位血管を閉塞。合字を削除し、1時10分、ヘパリン化生理食塩水で血管内腔を灌漑。 </li><li>ゆっくりDILAT電子血管dilatatorと動脈内腔は、カフの上に血管壁を裏返すと、プリセット周8-0絹糸結紮で固定します。 </li><li>グラフト移植のための十分なスペースを得るために、顎下腺の右葉を削除します。 </li><li>移植まで湿った術野を保管してください。 </li></ol> 3.グラフト移植<ol><li>逆さまに内側に向い大動脈と横方向に肺動脈をレシピエント頸部におけるグラフトを配置します。 </li><li>頸動脈カフの上にグラフトの大動脈を引き、円周8-0シルク結紮で吻合を固定します。 </li><li>その前面に肺動脈幹を切開し、外頸静脈とカフの上に引き出します。再び周8-0絹糸結紮で吻合を固定します。 </li><li>頸動脈のアンクランプすることにより、以下、外頸静脈にクランプを取り外します。心臓は血液ですぐにいっぱいに。 Rを強化するために、eperfusionは、移植片に37℃の温かい生理食塩水をドロップします。通常、心臓は1分以内に洞調律を開発しています。静脈サイトでカフの拡張子を削除します。 </li><li>正しいグラフト位置を確認し、吻合は、ねじれのない緊張フリー、船でなければなりません。これは創傷治癒を損なう可能性があるため、皮膚の血管を焼灼しないでください。出血は通常、自然に停止します。シングル8-0連続縫合で皮膚を閉じます。 </li></ol> 4.術後ケア<ol><li>水分補給のための0.25ミリリットル温かい生理食塩水を皮下注射します。 </li><li>麻薬は、ナロキソン（1.2ミリグラム/キログラム）、フルマゼニル（0.​​5ミリグラム/ kg）を、それが胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで暖かいパッドの上に動物を左SC atipamezol（2.5 mg / kg体重）を注入拮抗します。任意の異常行動を登録するには、少なくとも1つの付加的な時間のための動物を観察します。完全にリ・まで、他の動物の会社に手術を受けた動物を返しません。赤。 </li><li>処置後72時間の最小持続時間のためのローカルの制度のプロトコルに従ってブプレノルフィン（1日に3回皮下0.05ミリグラム/ kg）または代替鎮痛で先制鎮痛を提供します。 </li><li>外科医と獣医師は動物を定期的に表示されるはずです。 &gt; 15％の体重減少の場合、無関心では、膨潤または外科側感染動物は、イソフルラン吸入端末を使用して安楽死させます。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

我々は、様々な実験的な設定で、90％以上の成功率で200以上の心臓移植を完了しました。ここに記載された技術では、完全な手順は、経験豊富な外科医によって60分以内に行うことができます。臓器獲得の前に子宮頸部の容器を調製することにより、総グラフト虚血時間は20分に制限することができます。移植のための時間（ウォーム虚血時間）縫合技術16に比べカフ技術を使用して大幅に短くなっています。 代わりに、単に以前に5,17に記載されているように 、我々は臨床的に使用された心停止液で移植片を灌流によって、および低体温症により心停止を引き起こす心臓を切除します。晶質Custodiol HTK溶液は、10ミリモル/ lのカリウム、ナトリウム、カルシウム及びマグネシウムの低濃度を含有し、効果的に心臓を停止させます。添加剤のヒスチジン、トリプトファン及びケトグルタルは、アシドーシスを低減し、ATPを提供し、細胞膜を保護デュリング虚血。これは、心臓切開手術中に制御の心停止の臨床症状に似ており、心筋I / R傷害の調査のためのこのモデルに最適です。また、冷たい虚血の開...

心臓移​​植モデルは、頻繁にI / R傷害、同種移植片拒絶反応、移植後血管障害および免疫調節剤の効果を調査するために使用されます。マウスモデルは、既知の免疫学的および遺伝的背景、多くの近交系およびトランスジェニック株および比較的低い実験コストの可用性のような多くの利点を兼ね備えています。 1973年には、マウスでの腹部心臓移植の技術は、最初のコリーら 1で説明しました。このモデルでは移植片は、レシピエントの腹部大動脈へと下大静脈への主肺動脈の上行大動脈の端側吻合によって血管再生されます。 1991年には、マウスでの子宮頸心臓移植のための縫合技術は、Chenら2によって説明されました。このモデルでは、逆行性冠動脈灌流は、GRの上行大動脈に受信者の頸動脈の吻合によって確立されました後方。静脈血の右心房、右心室に冠状静脈洞を介したドレインとは、レシピエント外頚静脈（ 図1）への肺動脈を通って排出されます。腹部グラフト移植と比較して、子宮頸モデルは、低侵襲性であり、移植片の表面的な場所は、追加のフォローアップ検査（ 例えば、触診、心エコー検査、生体蛍光顕微鏡）3,4のために非常に容易にアクセスが可能になります。 技術改良5,6にもかかわらず、このモデルのより広範な使用は、吻合漏れや血栓症の発生率が高いと小血管の縫合吻合を実行するための技術的な難しさに限定されていました。 1991年に、松浦ら 。血管壁が大幅に子宮頸心臓移植7のモデルを容易に合成シリンダー、上で裏返されたカフ技術を導入しました。技術はFUましたrtherは腎8、膵臓9、手足10、肝11,12、肺13,14および血管移植15を含む様々な実験移植モデルに採用。縫合技術と比較して、吻合のための所要時間と、従って、暖かい虚血時間が短く、カフ法16を用いて、より少ない血管合併症が大幅にあります。また、高い成功率を使用して操作を実行するためにマイクロサージェリーに少しのトレーニングで外科医を可能にします。カフ技術の欠点は、脳灌流を変更することができる総頸動脈の前提条件ライゲーションです。 このビデオの論文では、マウスの子宮頸心臓移植のための改良されたと単純化されたカフ手法を提示します。

<table><tbody><tr><td>鉗子 JFC-7.2</td><td>S&T</td><td>P-00036</td><td>カーブチップ 0.20mm</td></tr><tr><td>ベッセルダイレーター D-5a</td><td>S&T</td><td>S-00124</td><td></td></tr><tr><td>アドベンティータシザー</td><td>S&T</td><td>S-00102</td><td></td></tr><tr><td>血管クランプ B-1V</td><td>S&T</td><td>S-00396</td><td></td></tr><tr><td>Yasargil クリップ</td><td>Peter Lazic</td><td>65,097</td><td>3.5 mm 長さ</td></tr><tr><td>バイポーラ鉗子</td><td>Micromed</td><td>148-100-011</td><td>チップ 0.25 mm</td></tr><tr><td>ポリイミドチューブ</td><td>River Tech Medical</td><td></td><td>19-24 ゲージ</td></tr><tr><td>8.0 シルク結紮糸</td><td>Catgut</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Custodiol HTK ソリューション</td><td>エッセンシャル医薬品</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウスにおける異子宮頸心臓移植

Heterotopic Cervical Heart Transplantation in Mice

マウスにおける異所性子宮頸部心臓移植は、移植および心血管研究における貴重なツールです。カフ技術は、小さな血管の困難な縫合吻合を回避し、それによって暖かい虚血時間を短縮することにより、このモデルを大幅に簡素化します。腹部移植片移植と比較して、子宮頸部モデルは侵襲性が低く、移植された移植片はさらなるフォローアップ検査のために簡単にアクセスできます。吻合は、移植片の上行大動脈をレシピエントの総頸動脈でカフ上に引っ張り、主肺動脈を外頸静脈でカフの上に引っ張ることによって行われます。適切なカフサイズの選択と血管の完全な動員は、血行再建術を成功させるために重要です。虚血再灌流(I / R)損傷は、心筋麻痺液で移植片を灌流し、低体温症によって最小限に抑えることができます。この記事では、基本的な顕微手術のスキルを持つ外科医が高い成功率で手術を行うことを可能にする、簡素化され改良されたカフ技術の技術的な詳細を提供します。

私たちのチームは成功し、約20のトレーニング手術後に記載された技術を実行することができます。最も挑戦的な部分は、それが簡単にバックフリップと複数の試みが壁の引き裂きにつながる可能性があるため、カフの上に頸動脈の血管壁を裏返すことです。訓練期間の後、平均総手術時間は60±8分でした。 20分ごろ、ドナーの収穫のために、子宮頸部の血管と吻合し、皮膚閉鎖のための15分の調製のための25分を必要としています。 心筋I / R傷害の調査のために我々は92％の手術の成功率で様々な実験設定で、同系C57BL / 6マウスでは200以上の操作を行いました。早期の死亡は吻合を行う際に困難を引き起こした（n = 3）を、吻合部の漏れ（N = 2）、心肺障害（N = 10）しました。一つの動物は、神経学的障害に起因する回復後に安楽死させました。周術期の生存者の中では、移植片の生存がで&gt; 95％でした7日（ 図4）。同系移植の受信者数は3ヶ月以上生き続けてきました。抗生物質の予防的投与を使用していないにも関わらず、我々は、任意の感染性合併症を観察しませんでした。 <...

カフ技術は、技術的に困難な小血管の縫合糸吻合を避けることにより、マウスにおける異所性子宮頸部心臓移植のモデルを短縮し、促進します。このビデオペーパーで示されている技術的な詳細により、研究者は自分の研究室でこのモデルを確立できるはずです。

The heterotopic cervical heart transplantation in mice is a valuable tool in transplant and cardiovascular research. The cuff technique greatly simplifies ...

本ビデオでは、同系マウスを用いた虚血再灌流傷害の検討、または同種動物を用いた移植片拒絶反応の検討を目的とした、頸部心移植の実験モデルを紹介します。手順の最初のステップは、ドナーマウスから心臓を摘出することです。移植片は、実験設定に応じて、心停止液中で氷上に最大4時間まで保存されます。次のステップは、レシピエントマウスの右頸部血管の準備です。切断した外頸静脈と総頸動脈の血管壁をカフに被せ、結紮糸で固定します。手順の最終ステップは、レシピエントマウスへのグラフトの移植です。グラフトの上行大動脈を総頸動脈とともにカフに被せ、肺動脈幹を外頸静脈に吻合します。最終的に、クランプを取り除き、再灌流を開始します。通常、心臓は1分以内に洞調律に回復します。腹部へのグラフト移植と比較して、頚部への心臓移植は低侵襲であり、動物の回復がより早くなります。また、吻合にcalsを使用することで、微小血管の縫合を完全に回避でき、技術的により実現可能なモデルとなります。マウスにイソフルランで事前鎮静を行った後、麻酔薬を腹腔内注射して麻酔をかけ、足底逃避反射を確認して手術耐性を確認します。その後、マウスを術野で仰臥位に固定します。次に、クロルヘキシジンで皮膚を3回消毒します。腹部正中切開を行い、湿らせたガーゼを用いて腸管を左側に牽引し、下大静脈を露出させます。その後、凝固を防ぐため、0.4 mLの生理食塩水で希釈した50 unitsのヘパリンを下大静脈に注入します。1分後、容器内で横隔膜を開き、両側開胸術を行って心臓を露出させ、前胸壁を上方へ翻転させ、クランプで固定します。次に、胸腺を除去し、大動脈と肺動脈幹の間の結合組織を鈍的に剥離し、右総頸動脈を切開します。その後、30ゲージの針を用いて、腕頭動脈付近で遊離させた descending aorta を穿刺し、3 mLの氷冷心筋保護液をゆっくりと逆行性に注入します。過度な圧力をかけないでください。空気を注入しないでください。さらに心停止を促進させるため、移植片に氷冷生理食塩水を滴下します。次に、腕頭動脈の起始部の近位側で大動脈を切断し、心臓に近い位置で下大静脈および左右の上大静脈を結紮します。結紮後、ATOシルクを用いて、各血管を結紮部位の遠位側で切断します。続いて、肺動脈幹を可能な限り遠位まで剥離し、分岐点に近い位置で肺動脈を結紮します。同様にシルク糸を用いて、結紮部位よりも遠位でこれらの血管を切断します。最後に結紮するのは肺静脈であり、1本のシルク糸でまとめて結紮することができます。その後、これらの静脈を切断し、ドナーから心臓を取り出します。顕微鏡下での処置を開始するまで、心臓を氷冷した心停止液に保存します。ポリアミドチューブをハサミまたは11番メスで切断し、吻合用のカフを準備します。ドナーと同様にレシピエントの手術準備を整えた後、水分補給として0.25 millilitersの温 saline solutionを皮下注射します。次に、右頸部の被毛を剃毛し、マウスを温熱パッドの上に仰臥位で配置して脚をテープで固定します。この際、前肢を伸ばしすぎると呼吸を妨げる可能性があるため、注意してください。その後、眼軟膏を塗布し、クロルヘキシジン scrub を用いて手術部位を3回消毒します。続いて、右下顎角から頸切痕にかけて皮膚を横方向に切開し、手術を開始します。次に、外頚静脈を鈍的に剥離し、バイポーラ鉗子で側枝を焼灼して切断します。外頚静脈と顎下腺からの静脈が合流している部位を、結紮糸の間で切断します。分離後、外頚静脈をカフに通して引き出します。次に、カフの延長部分に血管鉗子を装着し、血管を近位側で遮断します。続いて結紮糸を取り除き、血管腔内を1〜10 mLのヘパリン生理食塩水で洗浄します。血管壁をカフの上に折り返し、あらかじめ準備した円周方向の絹糸（silk）で血管を固定し、カフへの装着を完了させます。次に、胸鎖乳突筋の浅層部を除去します。続いて、右総頸動脈を遊離させます。その後、頸動脈分岐部の下方で2箇所を結紮し、その間で血管を切断します。次に、頸動脈をカフに通し、カフの近位側の伸展部にクランプを装着します。血管を遮断するため、結紮糸を取り除き、1〜10 µLのヘパリン含有生理食塩水で血管腔内を洗浄します。その後、血管拡張器を用いて慎重に血管腔を拡張させます。以前と同様に、カフへの血管の装着を完了させます。この手順で最も困難なのは、カフの上に動脈の血管容積を反転させることです。これは容易に元に戻ってしまうためです。したがって、適切なカフサイズを選択するために動脈を完全に可動化し、反転させる前に血管腔を緩やかに拡張させることが重要です。移植の準備として、顎下腺の右葉を摘出し、術野を湿潤に保ちます。移植片をレシピエントの頸部領域に、大動脈を内側、肺動脈を外側に向けて倒立状態で配置します。次に、移植片の大動脈を頸動脈のカフ側に引き寄せ、周囲を8-0シルク糸で結紮して吻合を固定します。次に、肺動脈幹の前面を切開し、外頸静脈とともにカフの上に引き寄せます。別の結紮糸を使用して、この吻合部を固定します。ここで、まず外頸静脈のクランプを外し、次に頸動脈のクランプを外すと、心臓に急速に血液が充満し、再灌流が促進されます。グラフトの上に加温生理食塩水を滴下してください。通常、心臓は1分以内に洞調律を開始します。次に、静脈側のカフ延長部を取り除き、グラフトを確認します。吻合部は緊張がなく、血管に捻れがないことを確認してください。皮膚の血管を焼灼しないでください。これは傷の治癒を妨げる可能性があるため、出血が自然に止まるまで待ち、単一の連続縫合で皮膚を閉じます。手術後、0.25 mLの温 salineを動物に皮下注射してください。次に、麻薬の拮抗作用を持たせるために、薬剤カクテルを皮下注射します。動物が腹臥位を維持できるまで、温熱パッドの上で回復させます。完全に回復したと判断する前に、少なくとも1時間、動物を観察してください。回復後、マウスは少なくとも3日間、単独飼育してください。最低72時間は鎮痛剤を投与してください。また、動物の体重を毎日測定して急激な体重減少がないかを確認し、全身状態を観察してください。記載したプロトコルを用い、同系Black sixマウスに組織病理学的検査のための移植を行った。移植片をヘマトキシリン・エオジンおよびシリウスレッドで染色した。非移植動物の切片を対照として使用し、比較した。遷延性虚血。再灌流により、組織浮腫を伴う強い炎症反応が生じた。星印で示されている白血球の浸潤を伴う充血および微小血管閉塞が認められる。強い赤色染色により、矢印で示される顕著な間質性コラーゲン沈着が認められた。このようなコラーゲン沈着は対照群では見られなかった。この移植モデルは、心血管および移植研究における有用なツールである。実験を開始する前に、心筋虚血再灌流障害について調査しておくことが特に有用です。吻合における大きなバイアスとなる可能性があるため、再現性のある手術結果が得られるよう、この手技を確実に習得してください。したがって、温虚血時間は20分未満に制限する必要があります。

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