慢性後のマウス脾細胞におけるDNA損傷と修復の測定インビボβ-およびγ-放射線の非常に低い用量への暴露

次の実験の全体的な目標は、低線量のベータ線またはガンマ線への慢性的なin vivo曝露によってマウス脾臓細胞に誘導されるDNA損傷と修復を測定することです。これは、まずマウスを内部ベータまたは外部ガンマ線に曝露して、DNAの損傷と修復の潜在的な変化を引き起こすことによって達成されます。第2のステップとして、PLE細胞を単離し、検出可能なDNA損傷を誘発する高負荷のガンマ線を照射して、DNA修復のモニタリングを可能にします。

その後、時間の経過とともに、脾臓細胞はγ H 2 A xに対して蛍光免疫標識され、DNA損傷の定量化が可能になります。最終的には、10°Cという低い急性ガンマ線の線量によって生じるDNA損傷は、フローサイトメトリーで測定できます。この方法は、職業、医療、または公共の環境で通常遭遇する低線量の放射線が、実際には癌などの健康に有害な影響の可能性を高めるかなど、放射線防護分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。

免疫蛍光顕微鏡を用いてγ H two A X病巣を計数するなどの既存の方法と比較した本技術の主な利点は、本技術が分析に必要な時間を大幅に短縮し、大規模な動物研究に適していること、およびγ H 2 A X定量におけるオペレーター関連のバイアスを低減することです。この技術の意味は、医学の個別化と癌の放射線療法にまで及び、個々の患者の放射線感度は、末梢血リンパ球を使用して患者の放射線療法の線量レジメンを調整するために決定される可能性があります。この方法は放射線の毒性についての洞察を提供しますが、環境化学汚染物質の毒性の調査や、in vivoでのマウスのDNA損傷形成と修復の基本的なメカニズムの調査など、他の研究にも適用できます。

内部ベータ線照射については、外部ガンマ線照射のためにトリチウム水へのADリビタムアクセスにより、動物を1ヶ月間治療します。マウスのケージ全体をガンマ線源から適切な距離に配置して、トリチウム曝露の線量率に一致させます。開始し、1ヶ月間露出を維持します。

熱ルミネッセンス線量計を使用して、曝露終了時の総吸収線量を測定します。脾臓採取の日に、動物1匹につき1つの小さな空のペトリ皿の中に細胞ストレーナーを置き、各皿に5ミリリットルのRPMI培地を追加します。次に、安楽死させたマウスを仰臥位に置き、動物が完全に浸されたら70%エタノールを髪にスプレーします。

鉗子を使用して尿道開口部の前方の皮膚をつかみ、この切開部から会陰領域に小さな切開を行います。腹側正中線に沿って胸腔まで切り込み、皮膚だけを切って下の筋肉壁を切らないように注意します。正中線から離れて皮膚を解剖します。

次に、鉗子で腹壁をつかみます。筋肉の中央アクセスに沿ってカットして、腹腔を開きます。脾臓の位置を特定し、滅菌鉗子で軽くつかみます。

次に、組織をそっと引っ張りながら、同時に結合組織を叩き落とします。下流の分析のために脾臓の約10分の1を取り除きます。次に、すべての脾臓が採取された後、残りの組織を細胞ストレーナーの1つに最大2時間移します。

滅菌された湾曲した鉗子を使用して、個々の細胞ストレーナー内の各組織を細かく刻みます。脾臓が十分に均質化されたら、ストレーナを取り外し、ろ過した細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移します。各ストレーナーを追加の5ミリリットルの培地ですすぎ、残りの細胞懸濁液で洗浄液を引っ張り、細胞を2回遠心分離し、最初のスピン後にペレットをそれぞれ10ミリリットルの新鮮なRPMIに懸濁します。

2回目のスピンの後。ペレットを5ミリリットルのRPMIに懸濁し、得られた細胞懸濁液の4ミリリットルを25ミリリットルの組織培養フラスコに移し、摂氏37度および5%二酸化炭素、湿度80%でインキュベートする。残りの細胞懸濁液を新しい1.5ミリリットルチューブに移し、摂氏4度の細胞を遠心分離します。

真空ポンプを使用して上清を慎重に吸引し、ペレットを1ミリリットルのTBSバッファーに穏やかに再懸濁し、再び吸引液を吸引した後、細胞を再度スピンダウンします。リースは、ペレットをそれぞれ300マイクロリットルのTBSに懸濁します。その後、マイナス20°Cの700マイクロリットルで低速でボルテックスしながら、各チューブに100%エタノールを充填します。

チューブを数回反転させて、さらに混ぜ合わせます。その後、サンプルをマイナス20°Cで最大12か月間保管します。DNA二本鎖切断を誘発し、修理機械に挑戦すること。

分200ミニグラ以下の線量率で2つの灰色のガンマ線を照射するサイ培養。チャレンジの直後に、培養物をCO2インキュベーターに戻します。1時間後、照射した培養物を生物学的安全キャビネットに移し、ピペットを使用して細胞を穏やかに再懸濁します。

得られた細胞懸濁液の1ミリリットルを氷上の1.5ミリリットルのチューブに移し、細胞をスピンダウンします。真空ポンプを使用して仰臥位を慎重に吸引し、ペレットをTBSの1ミリリットルに穏やかに懸濁します。次に、2回目のTBS洗浄後、細胞の免疫蛍光分析のためにマイナス20°Cの貯蔵で示したように、細胞をエタノールに固定します。

まず、0.5ミリリットルの氷冷TBSを適切なサンプルチューブに加えます。次の渦アリコートEloquaは、固定マイナス20°CのSPL細胞を5秒間保存しました。次に、0.5ミリリットルの細胞を適切なチューブに移し、それらをスピンダウンし、1%FBSと遠心細胞を含む1ミリリットルの氷冷TBSにペレットを静かに再懸濁します。

再度、サンプルをチューブあたり1ミリリットルのTSTバッファーで氷上で20分間インキュベートします。細胞をスピンダウンした後、再度、ペレットを200マイクロリットルの一次抗γH two ax抗体に再懸濁します。次に、インキュベーションの終了時に、チューブを回転するシェーカーに45〜60度の角度で1.5時間、Gの300倍と室温で配置します。

2%FBSを含む1ミリリットルの氷冷TBSでサンプルを2回洗浄します。次に、ペレットを200マイクロリットルの新たに調製した二次抗体に振とうプラットフォーム上に再懸濁します。1時間後、1%FBSを含むTBSと呼ばれる1ミリリットルの氷で細胞を洗浄し、続いてTBSのみと呼ばれる1ミリリットルの氷で洗浄します。

最後に、ヨウ化プロピジウムを含有するTBSの0.5ミリリットルにペレットを再懸濁しますこれらのグラフでは、代表的なフローサイトメトリーの結果が示されています。散乱プロピジウムヨウ素染色により、コントロールサンプルと放射線チャレンジサンプルの両方が正常な細胞周期分布を示すことが確認されました。γ H two axシグナルの測定は、ここで未処理の対照と比較して、2つの灰色照射細胞内のDNA二本鎖切断の2倍以上の増加を示しましたが、マウス細胞の相対的なγ H 2 AXレベルは、低線量または高線量のγ線へのex vivo曝露の1時間後に予想どおりに示されました。

2つの灰色のチャレンジの後に、二本鎖切断の強力な3倍の誘導が検出されました。0.1 gray へのばく露後に、わずかではあるが統計的に有意な増加が観察され、この分析法の感度が十分であることを示しています。顕微鏡で観察された蛍光の顕著な病巣様パターンは、シグナルがCHクロマチン内の個々のDNA二本鎖切断に由来することを示しており、染色の特異性を検証しています。

ここでは、1ヶ月間のトリチウム化水に曝露したマウスから採取したPLE細胞が示すDNA二本鎖切断のレベルを示します。この治療により、基礎ガンマH 2 A Xレベルが10%増加しましたが、変化は統計的に有意ではありませんでした。さらに、γH2軸の測定された形成と損失に違いはない。

DNAの動態を表すチャレンジを行った後、トリチウム水処理マウスとコントロールの細胞との間に二本鎖ブレーキ修復が観察されました。この手順を試行する際には、地域の放射線防護協会が定めた規則や規制を遵守すること、および内部および外部の放射線源を使用して大規模なマウスプロジェクトを実施できる認定試験所または施設を利用することを忘れないでください。これらのテクニックを習得すると、適切に実行されれば、10匹のマウスあたり約1日半で完了します。

このビデオを見れば、Gamma H two A X発現のフローサイトメトリー解析を使用して、低線量のトリチウムまたはガンマ線への曝露によってin vivoで誘導されるDNAダブレット鎖切断と修復を測定する方法について十分に理解できるはずです。この手順に加えて、血液リンパ球におけるM FISH、骨髄小核アッセイ、ストレス応答遺伝子の発現を測定するためのR-T-Q-P-C-Rなどの他の方法を実行して、低線量放射線への被ばくに関連する健康リスクを評価することができます。